基因工程的基本操作程序3

1、（優(yōu)選）基因工程的基本操作程序第一頁，共三十二頁。第二頁，共三十二頁?；蚬こ痰幕静僮鞒绦蛑饕ㄋ膫€(gè)基本步驟：1）目的基因的獲取2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4）目的基因的檢測與鑒定第三頁，共三十二頁。第四頁，共三十二頁。步驟一：目的基因的獲取 目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因,獲取目的基因是實(shí)施基因工程的第一步 。 如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗?。共《?、抗細(xì)菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。第五頁，共三十二頁。目的基因的提取方法直接分離基因人工合成基因反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA：鳥槍法第六頁，共三十二頁。1 .

2、 鳥槍法（散彈射擊法） 用限制酶將供體細(xì)胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運(yùn)載體，然后通過運(yùn)載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細(xì)胞，讓供體細(xì)胞提供的外源DNA的所有片段分別在各個(gè)受體細(xì)胞中大量復(fù)制（即擴(kuò)增），從中找出含有目的基因的細(xì)胞，再利用一定發(fā)方法將目的基因的DNA片段分離出來。用限制酶切斷成許多片段第七頁，共三十二頁。1）反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA)雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成2.人工合成基因法第八頁，共三十二頁。2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA

3、法 ： 根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對原則，推測出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學(xué)合成第九頁，共三十二頁。上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點(diǎn)？優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)鳥槍法反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知氨基酸合成DNA法操作簡便廣泛使用工作量大，盲目，分離出來的有時(shí)并非一個(gè)基因?qū)Ｒ恍詮?qiáng)操作過程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高專一性最強(qiáng)僅限于合成核苷酸對較少的簡單基因第十頁，共三十二頁。哪些新技術(shù)能大大簡化基因工程的操作技術(shù)？1）DNA序列自動(dòng)測序儀：

4、2）PCR技術(shù)： 對提取出來的基因進(jìn)行核苷酸序列分析。 使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增。第十一頁，共三十二頁。第十二頁，共三十二頁。3）從基因文庫中獲取目的基因：基因文庫: 將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(gene library)基因組文庫: 基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫.部分基因文庫: 基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫.第十三頁，共三十二頁。 用DNA重組技術(shù)將某種生物的總DNA用特定的限制性內(nèi)切酶切割成一個(gè)個(gè)片段，然后將這些片

5、段隨機(jī)地連接在某些質(zhì)?；蚱渌d體上，再將它們轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，通過細(xì)胞的增殖而構(gòu)成各個(gè)片段的無性繁殖系（克?。?，當(dāng)這些克隆多到可以包括某種生物的全部基因時(shí)，這一批克隆的總體就稱為該種生物的基因文庫。這一定義也適用于線粒體DNA和葉綠體DNA，分別稱為某種生物的線粒體基因文庫或葉綠體基因文庫。為了有效地保存基因文庫，可通過細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上繁殖而使包含各個(gè)特定DNA片段的細(xì)菌增多。通過分子雜交的方法，可以篩選出包含有所需基因的DNA片段的細(xì)菌（或噬菌體）。經(jīng)過擴(kuò)增得到大量這樣的細(xì)菌（或噬菌體），從中便可分離出所需基因的DNA片段。建立和使用基因文庫是分離高等真核生物基因的有效手段，對于基因

6、定位和基因工程的研究都很有用。第十四頁，共三十二頁。第十五頁，共三十二頁。步驟二：基因表達(dá)載體的構(gòu)建 1）用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出黏性末端。 2）用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。 3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒） 目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過程，實(shí)際上是不同來源的基因重組的過程。第十六頁，共三十二頁。第十七頁，共三十二頁。常用的受體細(xì)胞： 有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。步驟三：目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第十八頁

7、，共三十二頁。直接導(dǎo)入法有電擊、顯微注射、直接吸收、基因槍等方法。（1）電擊法：借助電擊儀高壓脈沖把目的基因打入宿主細(xì)胞。（2）顯微注射法：利用微量注射器在顯微鏡下直接把目的基因注入宿主細(xì)胞。（3）直接吸收法：把目的基因和宿主細(xì)胞混在一起，讓其吸收。（4）基因槍法：在金屬微粒上涂一層目的基因，然后發(fā)射到宿主細(xì)胞中。間接導(dǎo)入法常用的載體是質(zhì)粒、噬菌體、科斯質(zhì)粒。（1）質(zhì)粒是細(xì)菌染色體DNA以外的環(huán)狀雙鏈DNA分子，它能自我復(fù)制，也可整合到細(xì)胞染色體DNA中與其一起表達(dá)。質(zhì)粒通常還含有標(biāo)記基因，這可以從細(xì)胞的表型特征來識別。（2）噬菌體是一種細(xì)菌病毒，其環(huán)狀雙鏈DNA可以作為目的基因的載體。（3）

8、科斯質(zhì)粒是一種雜種質(zhì)粒，含有質(zhì)粒和噬菌體的部分順序，很適合用作真核生物基因的載體。第十九頁，共三十二頁。1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞第二十頁，共三十二頁。2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞第二十一頁，共三十二頁。3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 大腸桿菌細(xì)胞最常用的轉(zhuǎn)化方法是: 首先用Ca2+ 處理細(xì)胞,以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性,使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞. 第二步是將重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合,在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子,完成轉(zhuǎn)化過程. 第二步目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)，隨其繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌繁殖的速度非?？?，在很短的時(shí)間

9、內(nèi)就能獲得大量的目的基因。第二十二頁，共三十二頁。 1）將細(xì)菌用CaCl2處理，以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性。 2）使含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞。 3）目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)，隨其繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌繁殖的速度非?？?，在很短的時(shí)間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。第二十三頁，共三十二頁。步驟四：目的基因的檢測與鑒定四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素抗性基因第二十四頁，共三十二頁。 不能，受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達(dá)。受體細(xì)胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達(dá)嗎？若不能表達(dá)，要對抗蟲基因再進(jìn)行修飾。第二十五頁，共三十二頁。第二十六頁，共三十二頁。前三步的處理十分繁鎖，為保證目的

10、基因得到有效利用，通常用大量的受體細(xì)胞來接受不多的目的基因。這樣，處理的受體細(xì)胞中真正攝入了目的基因的很少，必須將它從中檢測出來。無表達(dá)產(chǎn)物無表達(dá)產(chǎn)物有表達(dá)產(chǎn)物無表達(dá)產(chǎn)物細(xì)菌的檢測，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)形成菌落，檢測菌落中是否有目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。淘汰無表達(dá)產(chǎn)物的菌落，保留有表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。第二十七頁，共三十二頁。多細(xì)胞生物的檢測，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)并誘導(dǎo)發(fā)育成完整個(gè)體，檢測這些個(gè)體是否攝入目的基因，攝入的基因是否表達(dá)（是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀）。淘汰無變化的個(gè)體，保留有相應(yīng)變化的個(gè)體進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。第二十八頁，共三十二頁。1）以下說法正確的是 （ ） A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列 B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體 C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接 D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來C練習(xí)第二十九頁，共三十二頁。2）不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是 A、能復(fù)制 （ ） B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn) C、具有標(biāo)記基因 D、它是環(huán)狀DNAD練習(xí)第三十頁，共三十二頁。3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（ ） A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來