EMSA操作方法(原核表達(dá)純化蛋白)

1、三、凝膠滯留試驗(yàn)（S凝膠遷移滯留試驗(yàn)（electrophoreticmobilityshiftassays,EMSA）是研究核酸與蛋白質(zhì)相互作用簡(jiǎn)單、快速、敏感的方法，目前已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法，并且用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。其基本原理是蛋白質(zhì)可以與末端標(biāo)記的核酸探針結(jié)合，電泳時(shí)這種復(fù)合物比無(wú)蛋白結(jié)合的自由探針在凝膠中泳動(dòng)的速度慢，即表現(xiàn)為相對(duì)滯后。（一）轉(zhuǎn)錄因子-標(biāo)簽融合蛋白和標(biāo)簽蛋白的原核表達(dá)純化以標(biāo)簽為例。裂解液：25mp.ri、10（CilaCl2m2a、1m和1XCompleteProteaseInhibitorCocktail。洗脫液：50mMpH

2、7.8Tri、s-20H0mCMlNaC、l1mMDT、T0.02%（v/）vTriton1（和10m還原性谷胱甘肽。透析液：25mp.0ris-1mClet1m和1XComplete2ProteaseInhibitorCocktail。1將轉(zhuǎn)化了口4載體或者口4目的基因重組載體的12大腸桿菌在5mL含100螃mL氨芐青霉素的L培養(yǎng)液中3、200rpm震蕩培養(yǎng)12h。2取1mL菌液加入100mL含100%mL氨芐青霉素的L培養(yǎng)液中，3、200rpm震蕩培養(yǎng)至為00.5左右。3加入IP至終濃度為0.5m,2、200rpm培養(yǎng)h4冰上放置10min,4、3000Xg離心15min,收集菌體并稱重。

3、5每克菌體加入3mL裂解液，重懸菌體，加入溶菌酶至終濃度為0.5mgmL,在冰上溫和地?cái)噭?dòng)菌液30min。超聲波破碎30s（破碎10s停10s）。、12000Xg離心30min,上清液用0.45Mrn濾膜過(guò)濾，向?yàn)V液中加入5aCl使aCl的濃度為200m。去掉ltathioneepharose4ast中的儲(chǔ)存液，用5倍樹脂體積的裂解液清洗樹脂。9待裂解液流到樹脂上沿以下時(shí)，加入已過(guò)濾的菌體裂解液。流出液再過(guò)一次樹脂，收集流穿液。10用5倍樹脂體積的裂解液清洗樹脂，收集洗滌液并置于冰上。11用5倍樹脂體積的洗脫液洗脫目的蛋白，收集目的蛋洗脫液置于冰上。12洗脫結(jié)束后，用5倍樹脂體積的裂解液清洗樹

4、脂，收集清洗液置于冰上。用5倍樹脂體積的雙蒸水洗滌樹脂，樹脂保存于倍體積的20（）乙醇中。通過(guò)電泳分析流穿液、洗滌液、目的蛋洗脫液和清洗液中出現(xiàn)的目的蛋白。15用截留分子量不大于目的蛋白分子量1/的3超濾管超濾純化目的蛋白，并加入透析液繼續(xù)超濾至合適的體積，轉(zhuǎn)移到51離心管中，2保存。（二）蛋白質(zhì)濃度的法測(cè)定用m公司生產(chǎn)的蛋白定量分析試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)溶液的濃度。用透析液稀釋2000呢mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，得到濃度分別為0、25、25250、500、500005002000螃mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。2液與液按50：的體積混勻，得到WR液。將200瓦WR液分別與25應(yīng)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液混勻，封口

5、，7溫育0m。冷卻至室溫后測(cè)量52波長(zhǎng)的吸光值，測(cè)次，取平均值。做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。5將25配待測(cè)蛋白質(zhì)溶液加到200配WR液中，混勻，封口，7溫育0m。冷卻至室溫后測(cè)量52波長(zhǎng)的吸光值，測(cè)次，取平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出待測(cè)蛋白質(zhì)溶液中的蛋白質(zhì)濃度。（三）轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合的驗(yàn)證公司生產(chǎn)的DeeoM檢測(cè)性物素標(biāo)記探針。1配制非變性凝膠：1800雙雙蒸水、3500瓦1XTBE緩沖液(50mMTrs硼酸和2mMaEDT)、1400凡30%()rB(2S：1)、219瓦80%()甘油、52.5配10%()和3.5瓦TEMED。2配制4義結(jié)合緩沖液：200mMp8.0Trs、C4mMaEDT、00nMCl24

6、mMDTT；3配制結(jié)合反應(yīng)液：5配4義結(jié)合緩沖液、1配poly(dIdC、5%純化蛋白和0.1pM生物素標(biāo)記探針，用雙蒸水補(bǔ)至20瓦。競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)加入相應(yīng)量的非標(biāo)記探針。室溫下放置1h。4小型垂直電泳槽放置在冰中，將結(jié)合反應(yīng)液加入非變性凝膠的進(jìn)樣孔中，在0.5XTBE緩沖液中100電壓電泳0m。5剪出與凝膠大小相當(dāng)?shù)哪猃埬ず蜑V紙(4張)，將尼龍膜和濾紙?jiān)?.5XTBE中浸泡10m以上。在半干轉(zhuǎn)膜儀中加入0.5義18,依次鋪上2層濾紙、尼龍膜、凝膠、2層濾紙，每層之間不能有氣泡。500m電轉(zhuǎn)1h。移走濾紙將尼龍膜取出，在超凈臺(tái)紫外燈下約10m處紫外交聯(lián)10m8從冰箱取出BloBufer和4XWash

7、buffer,置3烘箱，使白色沉淀溶解。9將尼龍膜放在9將尼龍膜放在5mLBlogBuffer輕微振蕩15morsPereardoixsihdaseugate/BlockiugorsPereardoixsihdaseugate/Blockiugg輕微振蕩10將1.uLabledrepadCouga加e到5mLBloBufer中（1300稀釋）配制CoBuffer。倒出BlogBuf加入CougaeBlo15miu。11用4XWashbuffer加純水配制40mL1XWashbuffer。12將膜移動(dòng)到新容器中，用10mL1XWashbuffer洗滌尼龍膜4次，每次5m,輕微振蕩。13將膜移動(dòng)到

8、新容器中，加入10mLSubstrateEquilibratiou，Buffer輕微振蕩5m14將結(jié)合膜取出放置到濾紙上，吸掉水分，再放到新的濾紙上。在暗室中將和等體積混合配制，將加到尼龍膜上。用保鮮膜覆蓋尼龍膜，放上感光片，曝光，顯影，拍照。蛋白原核表達(dá)及激酶活性測(cè)定吳赴清提供一、蛋白原核表達(dá)（一）載體選擇1、蛋白表達(dá)的載體系統(tǒng)很多，常用的有pET系統(tǒng)（有his-tag）,pGEX-4T-1（GSTtag）,pMAL系統(tǒng)（MBPtag）。2、由于pET系統(tǒng)標(biāo)簽小，純化洗脫都比較方便，因此一般首選這個(gè)系統(tǒng);如果pET表達(dá)困難，可以考慮用pGEX-4T-1和pMAL系統(tǒng)，GST標(biāo)簽與MBP標(biāo)簽一

9、方面都可以增加蛋白的可溶性，另一方面也利于增加難表達(dá)蛋白的表達(dá)水平。二者的區(qū)別是某些情況下，pMAL系統(tǒng)表達(dá)復(fù)雜結(jié)構(gòu)蛋白能力更強(qiáng)些，但MBP融合蛋白不容易從樹脂上洗脫下來(lái)。（二）表達(dá)菌株表達(dá)菌株使用最多的是BL21（DE3），另外對(duì)某些表達(dá)特別困難的蛋白也可以選用由這個(gè)菌株優(yōu)化的新菌株，如rostta（DE3）,BL21（DE3）plysS等。（三）融合蛋白表達(dá)純化1、His蛋白表達(dá)純化（1）測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂板后培養(yǎng)8-16h。（2）挑取3單菌落接種于5mlLB培養(yǎng)基中，37搖菌至OD60（=0.6。（3）取1ml菌液保存菌種，取2ml加入IPTG使終濃度為1

10、mM，16，160rpm,16h誘導(dǎo)，另2ml不加IPTG，16，160rpm,16h，作未誘導(dǎo)對(duì)照。（4）誘導(dǎo)結(jié)束后，誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的，各取1ml,10000rpm離心1min,去上清，沉淀中加入50plPBS重懸，再加入50pl2x蛋白上樣緩沖液，100煮樣5min,10000rpm離心5min,得至的上清為總蛋白。取10-20pl電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。（5）如果要檢測(cè)表達(dá)的蛋白是在上清中還是在沉淀中，則按下面步驟進(jìn)行：取5ml誘導(dǎo)和5ml未誘導(dǎo)菌液，離心收集沉淀，加入300-500ulPBS重懸，超聲破碎，至菌體變?yōu)槌吻澹?2000rpm離心5min,取50ul上清加入50ul2x蛋白

11、上樣緩沖液；取沉淀加入100-200ulPBS,再加入等體積2x蛋白上樣緩沖液，100煮樣5min,10000rpm離心5min,取10-20pl電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。（6）融合蛋白純化如果小量誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)蛋白有表達(dá)，則進(jìn)行純化，下面以1升LB為例介紹純化過(guò)程。1）誘導(dǎo)完畢后，7000rpm,4，離心5min收菌。沉淀可在-20保存數(shù)月。2）用40ml冷PBS重懸細(xì)胞沉淀，加入蛋白酶抑制劑cocktail（Roche），和2mMDTT,200plTritonX-100輕微渦旋混勻。4）超聲破碎細(xì)胞，至菌體澄清，12000rpm，4，離心10min，小心轉(zhuǎn)移上清到一個(gè)新的50ml離心管中。5）取

12、0.5-1mlNi-NTiBind樹脂到結(jié)合柱中，讓液體流下，加入2x5mlPBS漂洗樹脂，結(jié)束后將樹脂加到4）的蛋白上清中。6）將離心管封嚴(yán)平放在冰盒中，搖床上100rpm搖動(dòng)結(jié)合1-2h。7）將上述結(jié)合混合物上柱子，讓溶液流出，收集樹脂。8）用3X5ml冰中預(yù)冷的PBS漂洗樹脂。9）配制梯度咪唑溶液（100mM、200mM、300mM、400mM、500mM）放置冰中，分別用500ul上述溶液從低濃度到高濃度依次洗脫目的蛋白。10）從各管中取5ul蛋白加入等體積loadingbuffer，煮樣后電泳。3M咪唑：咪唑分子量為68.08，先稱取20.4g咪唑放入60ml水中，溶解后定容到100

13、ml。(2)GST融合蛋白表達(dá)純化GST融合蛋白表達(dá)純化的大部分步驟與HIS融合蛋白相同，不同的主要有如下幾點(diǎn)：1)為了產(chǎn)生盡量多的可溶蛋白，誘導(dǎo)用IPTG濃度一般為0.1mM;2)蛋白與樹脂混合物結(jié)合完畢后750g，離心1min，4C，沉淀樹脂。將樹脂與少量上清混合物上柱，用冰預(yù)冷的PBS5ml漂洗樹脂3次。這個(gè)混合物可保存于4C用于進(jìn)行pull-down實(shí)驗(yàn)。或進(jìn)行融合蛋白洗脫。3)10 xGST融合蛋白洗脫溶液500mMTris-Cl(pH8.0)+200mM還原型谷胱甘肽還原型谷胱甘肽在溶液中不穩(wěn)定，要將母液分裝后存在-20冰箱中，避免反復(fù)凍融。pH值很關(guān)鍵，必須用8.0的PBS.這樣洗脫下來(lái)的蛋白溶液中包含高濃度的谷胱甘肽，如果它對(duì)下游的實(shí)驗(yàn)有影響可以通過(guò)超濾等手段去除。)對(duì)洗脫下來(lái)的蛋白進(jìn)行SDS電泳，檢測(cè)蛋白純化情況。GST標(biāo)簽的大小為26KDa。)如果要立即使用融合蛋白，可在4存放1周，如果要長(zhǎng)期保存，可以加入甘油使終濃度為50%，存放于-20。)增加可溶性蛋白含量的方法：主要是通過(guò)減慢融合蛋白表達(dá)速度實(shí)現(xiàn)，措施包括降低誘導(dǎo)溫度、降低IPTG濃度、降低轉(zhuǎn)速。在菌體懸浮時(shí)加入去污劑，如0.1%tritonX-100?；蛘呖梢约兓w蛋白，然后