分子生物學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求與質(zhì)量控制

1、分子生物學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求與質(zhì)量控制國(guó)家質(zhì)檢總局動(dòng)植物檢疫實(shí)驗(yàn)所二OO四年六月實(shí)驗(yàn)室技技術(shù)要求求總體要求求質(zhì)量控制制質(zhì)量保證證實(shí)驗(yàn)室總總體要求求實(shí)驗(yàn)室分分區(qū)要求求實(shí)驗(yàn)室工工作人員員要求安全防護(hù)護(hù)廢棄物處處理結(jié)果判斷斷與驗(yàn)證證實(shí)驗(yàn)室分分區(qū)要求求設(shè)施和環(huán)環(huán)境要求求各工作區(qū)區(qū)域設(shè)置置緩沖間間，緩沖沖間的壓壓力為負(fù)負(fù)壓（或或上設(shè)抽抽風(fēng)裝置置），與與其相連連的工作作間為正正壓，工工作間與與緩沖間間之間宜宜安裝磁磁性連鎖鎖裝置。不同功能能的核酸酸檢驗(yàn)工工作區(qū)應(yīng)應(yīng)是分隔隔獨(dú)立的的工作室室，并有有明顯的的標(biāo)志，各區(qū)間間不能直直通。各各區(qū)之間間如果是是緊密相相連，需需安裝物物品傳遞遞艙。每個(gè)工作作區(qū)域的的頂部

2、應(yīng)應(yīng)安裝紫紫外燈，紫外燈燈的波長(zhǎng)長(zhǎng)為254nm，安裝數(shù)量量為每20m2安裝一支支40W的紫外燈燈，燈與與地面的的距離不不宜超過(guò)過(guò)（2.00.1）m。實(shí)驗(yàn)室分分區(qū)要求求工作區(qū)域域的設(shè)置置及要求求核酸檢驗(yàn)驗(yàn)區(qū)試劑貯存存和準(zhǔn)備備區(qū);樣樣品制制備區(qū); 核酸酸制備區(qū)區(qū)擴(kuò)增區(qū); 擴(kuò)增增產(chǎn)物分分析區(qū)蛋白質(zhì)檢檢驗(yàn)區(qū)蛋白質(zhì)分分離純化化區(qū)蛋白質(zhì)檢檢測(cè)區(qū)其它區(qū)域域設(shè)置洗滌滌消毒室室（洗滌滌、消毒毒、制備備純水和和/或雙雙蒸水、制冰等等）、高高速/超超高速離離心機(jī)室室、低溫溫/超低低溫冰箱箱室等。主要功能能：原裝裝試劑和和配制試試劑的貯貯存，所所有試劑劑的配制制與分裝裝。工作區(qū)域域的壓力力要求：未設(shè)緩緩沖間的的試劑貯

3、貯存和準(zhǔn)準(zhǔn)備區(qū)，工作區(qū)區(qū)域?yàn)檎龎骸Ｗ⒁馐马?xiàng)項(xiàng)：當(dāng)試試劑經(jīng)質(zhì)質(zhì)檢合格格后，應(yīng)應(yīng)將其分分裝貯存存?zhèn)溆茫A存試試劑的分分裝體積積根據(jù)通通常在實(shí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)內(nèi)一次測(cè)測(cè)定所需需的擴(kuò)增增反應(yīng)數(shù)數(shù)決定。用于擴(kuò)擴(kuò)增的試試劑應(yīng)冰冰凍貯存存。核酸檢驗(yàn)驗(yàn)區(qū)各區(qū)區(qū)功能 試劑劑貯存和和準(zhǔn)備區(qū)區(qū)核酸檢驗(yàn)驗(yàn)區(qū)各區(qū)區(qū)功能 樣品品制備區(qū)區(qū)主要功能能：實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室樣品品的混樣樣和測(cè)試試樣品的的制備。工作區(qū)域域的壓力力要求：未設(shè)緩緩沖間的的樣品制制備區(qū)，工作區(qū)區(qū)域?yàn)樨?fù)負(fù)壓或減減壓，可可安裝排排風(fēng)系統(tǒng)統(tǒng)。注意事項(xiàng)項(xiàng)：此區(qū)區(qū)應(yīng)遠(yuǎn)離離其它實(shí)實(shí)驗(yàn)操作作區(qū)；粉粉碎樣品品時(shí)的器器皿應(yīng)單單獨(dú)使用用，所用用的器具具在使用用前應(yīng)經(jīng)經(jīng)過(guò)徹底底清洗并并高壓消

4、消毒，防防止交叉叉污染；稱(chēng)取的的測(cè)試樣樣品應(yīng)加加蓋后再再移至樣樣品核酸酸制備區(qū)區(qū)。核酸檢驗(yàn)驗(yàn)區(qū)各區(qū)區(qū)功能 核酸酸制備區(qū)區(qū)主要功能能：核酸酸的提取取純化與與貯存；核酸含含量的測(cè)測(cè)定；測(cè)測(cè)試樣品品DNA的保存。工作區(qū)域域的壓力力要求：未設(shè)緩緩沖間的的核酸制制備區(qū)，工作區(qū)區(qū)域?yàn)樨?fù)負(fù)壓或減減壓，可可安裝排排風(fēng)系統(tǒng)統(tǒng)。注意事項(xiàng)項(xiàng)：已純純化的核核酸應(yīng)保保存于20或80，避免反反復(fù)凍融融；陽(yáng)性性和陰性性標(biāo)準(zhǔn)物物質(zhì)DNA可調(diào)整至至常用的的使用濃濃度后分分裝并冷冷凍保存存。核酸檢驗(yàn)驗(yàn)區(qū)各區(qū)區(qū)功能 擴(kuò)增增區(qū)主要功能能：PCR擴(kuò)增反應(yīng)應(yīng)體系的的配制和和模板的的加入，核酸擴(kuò)擴(kuò)增。工作區(qū)域域的壓力力要求：未設(shè)緩緩沖間的

5、的擴(kuò)增區(qū)區(qū)，工作作區(qū)域?yàn)闉樨?fù)壓或或減壓，可安裝裝排風(fēng)系系統(tǒng)。注意事項(xiàng)項(xiàng)：嚴(yán)格格限制無(wú)無(wú)關(guān)人員員出入并并減少在在本區(qū)內(nèi)內(nèi)走動(dòng)；加樣應(yīng)應(yīng)在超凈凈工作臺(tái)臺(tái)（生物物安全柜柜）內(nèi)進(jìn)進(jìn)行，超超凈工作作臺(tái)的氣氣流方向向宜選擇擇垂流式式；巢式式PCR的第二次次加樣必必須在此此區(qū)進(jìn)行行。核酸檢驗(yàn)驗(yàn)區(qū)各區(qū)區(qū)功能 擴(kuò)增增產(chǎn)物分分析區(qū)主要功能能：擴(kuò)增增產(chǎn)物的的測(cè)定工作區(qū)域域的壓力力要求：未設(shè)緩緩沖間的的擴(kuò)增產(chǎn)產(chǎn)物區(qū)，工作區(qū)區(qū)域?yàn)樨?fù)負(fù)壓或減減壓，應(yīng)應(yīng)安裝排排風(fēng)系統(tǒng)統(tǒng)。注意事項(xiàng)項(xiàng)：此區(qū)區(qū)是最主主要的擴(kuò)擴(kuò)增產(chǎn)物物污染來(lái)來(lái)源，應(yīng)應(yīng)遠(yuǎn)離其其它實(shí)驗(yàn)驗(yàn)操作區(qū)區(qū)；使用用PCR-ELISA方法檢測(cè)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)產(chǎn)物時(shí)，應(yīng)使用用洗板機(jī)機(jī)洗板。

6、若實(shí)驗(yàn)僅僅采用全全自動(dòng)擴(kuò)擴(kuò)增檢測(cè)測(cè)儀（如如實(shí)時(shí)熒熒光定量量PCR儀），可可將擴(kuò)增增區(qū)與擴(kuò)擴(kuò)增產(chǎn)物物分析區(qū)區(qū)合并為為一個(gè)區(qū)區(qū)。蛋白質(zhì)檢檢驗(yàn)區(qū) 功能能及要求求蛋白質(zhì)分分離純化化區(qū)主要功能能：用于于蛋白質(zhì)質(zhì)的分離離與純化化。工作區(qū)域域要求：蛋白質(zhì)質(zhì)純化應(yīng)應(yīng)具備低低溫工作作的場(chǎng)地地，如4冷房房和/或或?qū)游龉窆竦?。蛋白質(zhì)分分離純化化區(qū)主要功能能：蛋白白質(zhì)分析析檢測(cè)control test陽(yáng)性結(jié)果陰性結(jié)果檢測(cè)工作作流程實(shí)驗(yàn)室樣樣品到樣樣驗(yàn)收（確定是是否具備備檢驗(yàn)的的基本條條件）混樣獲取測(cè)試試樣品測(cè)試樣品品的制備備（待檢檢狀態(tài)）核酸和/或蛋白白等目標(biāo)標(biāo)物質(zhì)的的提取PCR實(shí)驗(yàn)（包包括擴(kuò)增增和產(chǎn)物物分析）和/或

7、或蛋白質(zhì)質(zhì)檢測(cè)結(jié)果判定定結(jié)果表述述（出具具檢驗(yàn)報(bào)報(bào)告）實(shí)驗(yàn)室質(zhì)質(zhì)量控制制和質(zhì)量量保證工作人人員操作作要求按照ISO/IEC 17025：1999中5.2的要求求。應(yīng)具備良良好的分分子生物物學(xué)專(zhuān)業(yè)業(yè)技術(shù)操操作規(guī)范范。方向：試試劑貯存存和準(zhǔn)備備區(qū)樣本制備備區(qū)核酸制備備區(qū)擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物物分析區(qū)區(qū)各實(shí)驗(yàn)區(qū)區(qū)域應(yīng)有有專(zhuān)用的的儀器設(shè)設(shè)備，同同一區(qū)域域內(nèi)的儀儀器設(shè)備備、物品品和工作作服應(yīng)有有明顯標(biāo)標(biāo)記，避避免與其其他區(qū)域域的儀器器設(shè)備混混用。儀器設(shè)備備的校準(zhǔn)準(zhǔn)應(yīng)符合合ISO/IEC 17025：1999中5.5的規(guī)定定。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)質(zhì)量控制制和質(zhì)量量保證儀器設(shè)設(shè)備要求求實(shí)驗(yàn)室質(zhì)質(zhì)量控制制和質(zhì)量量保證試劑要要求除

8、另有規(guī)規(guī)定外，所有實(shí)實(shí)驗(yàn)使用用的試劑劑等級(jí)應(yīng)應(yīng)為不含含DNA和DNase的分析純純或生化化試劑。試劑的的選購(gòu)、驗(yàn)收、貯存應(yīng)應(yīng)符合ISO/IEC 17025：1999規(guī)定。實(shí)驗(yàn)用水水應(yīng)符合合GB6682-92中一級(jí)水水的規(guī)格格。去離離子水的的電阻應(yīng)應(yīng)達(dá)到18.2。商品試劑劑盒應(yīng)注注明到貨貨日期，對(duì)所收收到的試試劑盒應(yīng)應(yīng)按規(guī)定定的貯存存條件存存放。對(duì)菌種、質(zhì)粒、動(dòng)植物物細(xì)胞組組織的貯貯存與保保管應(yīng)符符合ASTM E1342-97的規(guī)定。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)質(zhì)量控制制和質(zhì)量量保證試劑配配制實(shí)驗(yàn)室配配制的試試劑應(yīng)在在容器上上標(biāo)明試試劑名稱(chēng)稱(chēng)、濃度度、配制制時(shí)間、保存條條件、失失效日期期及配制制者姓名名。所用試劑劑

9、溶液宜宜大體積積配制、小體積積分裝后后高壓滅滅菌保存存，不宜宜高壓滅滅菌的試試劑應(yīng)過(guò)過(guò)濾（0.22m）除菌；PCR主混液、引物、探針應(yīng)應(yīng)避免反反復(fù)凍融融。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)質(zhì)量控制制和質(zhì)量量保證試劑配配制實(shí)驗(yàn)室應(yīng)應(yīng)確定關(guān)關(guān)鍵試劑劑，并在在使用前前進(jìn)行質(zhì)質(zhì)量檢測(cè)測(cè)。關(guān)鍵鍵試劑包包括：核核酸提取取試劑、RNase、蛋白酶K、陰性對(duì)照照標(biāo)準(zhǔn)物物質(zhì)、陽(yáng)陽(yáng)性對(duì)照照標(biāo)準(zhǔn)物物質(zhì)、Taq酶、各種種限制性性?xún)?nèi)切酶酶、引物物、探針針、菌種種、陽(yáng)性性質(zhì)粒。試劑質(zhì)檢檢包括有無(wú)污污染，是是否存在在假陽(yáng)性性；使使用弱陽(yáng)陽(yáng)性對(duì)照照標(biāo)準(zhǔn)物物質(zhì)檢測(cè)測(cè)試劑的的擴(kuò)增效效果。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)質(zhì)量控制制和質(zhì)量量保證 防止止污染嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室分區(qū)區(qū)對(duì)實(shí)驗(yàn)室

10、室進(jìn)行功功能分區(qū)區(qū)，各區(qū)區(qū)的工作作服、實(shí)實(shí)驗(yàn)用具具和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)記錄本本應(yīng)區(qū)分分標(biāo)記，不能混混用。樣品管理理送檢樣品品的包裝裝應(yīng)完好好并有明明確的標(biāo)標(biāo)識(shí)；在在對(duì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室樣品品進(jìn)行混混樣、測(cè)測(cè)試樣品品的制備備和稱(chēng)量量過(guò)程中中應(yīng)避免免交叉污污染。實(shí)驗(yàn)過(guò)程程的質(zhì)量量控制實(shí)驗(yàn)室質(zhì)質(zhì)量控制制和質(zhì)量量保證 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)過(guò)程的的質(zhì)量控控制實(shí)驗(yàn)室環(huán)環(huán)境對(duì)照照陰性質(zhì)控控對(duì)照核酸提取取空白對(duì)對(duì)照：核核酸提取取過(guò)程中中不加樣樣品的空空白管；PCR試劑對(duì)照照：不含含DNA/cDNA模板的PCR擴(kuò)增反應(yīng)應(yīng)液試劑劑；陰性目標(biāo)標(biāo)DNA對(duì)照：即即為內(nèi)源源基因?qū)?duì)照，與與測(cè)試樣樣品等同同處理。陽(yáng)性質(zhì)控控對(duì)照檢驗(yàn)PCR反應(yīng)是否否正常進(jìn)進(jìn)行P

11、CR抑制物對(duì)對(duì)照檢測(cè)PCR反應(yīng)體系系中是否否存在水水溶性抑抑制物質(zhì)質(zhì)。當(dāng)PCR反應(yīng)無(wú)擴(kuò)擴(kuò)增結(jié)果果和定量量PCR時(shí)宜設(shè)此此對(duì)照。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)質(zhì)量控制制和質(zhì)量量保證 避免免各類(lèi)實(shí)實(shí)驗(yàn)污染染避免擴(kuò)增增產(chǎn)物污污染PCR擴(kuò)增反應(yīng)應(yīng)液中加加入U(xiǎn)DG酶，以dUTP代替dTTP可防止以以前PCR擴(kuò)增產(chǎn)物物所致的的遺留污污染。避免RNase污染（RNA檢測(cè)）戴口罩和和手套;DEPC;高溫烘烤烤;RNase抑制劑避免操作作過(guò)程污污染實(shí)時(shí)熒光光PCR和總核酸酸雜交法法可防止止操作過(guò)過(guò)程的污污染，實(shí)實(shí)時(shí)熒光光PCR尤其轉(zhuǎn)基基因產(chǎn)品品檢測(cè)實(shí)實(shí)驗(yàn)室重重要的防防污染措措施之一一。陽(yáng)性樣品品陰性樣品品Ct值值轉(zhuǎn)基因馬馬鈴薯和和油

12、菜籽籽的實(shí)時(shí)時(shí)熒光PCR檢檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)質(zhì)量控制制和質(zhì)量量保證室間質(zhì)質(zhì)量評(píng)價(jià)價(jià)測(cè)試凡對(duì)外開(kāi)開(kāi)展基因因檢測(cè)并并出具檢檢測(cè)報(bào)告告的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室，應(yīng)應(yīng)定期參參加國(guó)家家有關(guān)法法定部門(mén)門(mén)組織的的檢驗(yàn)項(xiàng)項(xiàng)目的室室間質(zhì)量量評(píng)價(jià)測(cè)測(cè)試。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)質(zhì)量控制制和質(zhì)量量保證 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室清潔潔清潔方向向應(yīng)按檢測(cè)測(cè)工作流流程方向向進(jìn)行：試劑貯存存和準(zhǔn)備備區(qū)樣品粉碎碎區(qū)核酸制備備區(qū)擴(kuò)增區(qū)產(chǎn)物分析析區(qū)清潔用具具不同實(shí)驗(yàn)驗(yàn)區(qū)域的的清潔用用具應(yīng)固固定，不不能交叉叉使用。工作結(jié)結(jié)束后應(yīng)應(yīng)立即對(duì)對(duì)工作區(qū)區(qū)域進(jìn)行行清潔。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)質(zhì)量控制制和質(zhì)量量保證 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室清潔潔實(shí)驗(yàn)室空空間實(shí)驗(yàn)室空空間應(yīng)定定期進(jìn)行行紫外照照射。實(shí)驗(yàn)臺(tái)面面和儀器器設(shè)備的的清

13、潔實(shí)驗(yàn)臺(tái)面面、超凈凈工作臺(tái)臺(tái)宜用3%雙氧氧水或10%次次氯酸鈉鈉溶液（含有效效氯1g/L）擦拭清潔潔；也可可在擦拭拭后再用用紫外光光照射，照射距距離應(yīng)不不超過(guò)90cm，照射時(shí)間間宜過(guò)夜夜。注：10%次氯氯酸鈉和和3%雙雙氧水應(yīng)應(yīng)在使用用前配制制，配制制好的溶溶液不宜宜長(zhǎng)期存存放。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)質(zhì)量控制制和質(zhì)量量保證 有毒毒有害及及廢棄物物質(zhì)的處處理移液器吸吸頭使用過(guò)的的移液器器吸頭應(yīng)應(yīng)放入含含有10%次次氯酸鈉鈉溶液的容容器內(nèi)浸浸泡，浸浸泡時(shí)間間不宜少少于24h。PCR產(chǎn)物含有PCR產(chǎn)物的所所有液體體及廢棄棄物應(yīng)放放入含有有1mol/LHCl的容器中中浸泡，浸泡時(shí)時(shí)間不宜宜少于6h；采用PCR-ELISA方法檢測(cè)測(cè)時(shí)洗板板機(jī)洗板板所產(chǎn)生生的廢液液應(yīng)收集集至1mol/LHCl溶液中。瓊脂糖凝凝膠及電電泳液對(duì)含有EB或經(jīng)EB浸泡過(guò)的的瓊脂糖糖凝膠、電泳緩緩沖液的的處理參參見(jiàn)分分子克隆隆。陽(yáng)性樣品品和質(zhì)粒粒陽(yáng)性質(zhì)粒粒宜放入入1mol/LHCl溶液中浸浸泡，浸浸泡時(shí)間間不宜少少于6h。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)質(zhì)量控制制和質(zhì)量量保證 安全全防護(hù)紫外線(xiàn)應(yīng)佩戴具具有紫外外線(xiàn)防護(hù)護(hù)功能的的護(hù)目鏡鏡和/或或防護(hù)面面罩，并并遮蔽暴暴露的皮皮膚。紫紫外照射射消毒后后由于空空氣中臭臭氧富集集，不宜宜立即開(kāi)開(kāi)始工作作，應(yīng)在在停止紫紫外照射射30min后開(kāi)始工工作，有有條件的的實(shí)驗(yàn)室室，可安安裝無(wú)臭臭氧紫外外燈。溴化乙錠錠在