實(shí)驗(yàn)四農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥

試驗(yàn)四、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥ArabidopsisthalianaNicotianatabacum實(shí)驗(yàn)四農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥第1頁(yè)選擇標(biāo)識(shí)基因與匯報(bào)基因必備條件：編碼一個(gè)不存在于正常植物細(xì)胞中酶基因較小能在轉(zhuǎn)化體中得到充分表示檢測(cè)輕易，而且能定量分析選擇標(biāo)識(shí)基因與篩選標(biāo)識(shí)基因：npt-II新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（卡那，新霉素，G418），aat（鏈霉素，壯觀霉素），spe（壯觀霉素），strl（鏈霉素），cat（氯霉素），bar（草苷膦）匯報(bào)基因：reportgene（篩選標(biāo)識(shí)之一）在轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中經(jīng)過(guò)瞬時(shí)及穩(wěn)定表示檢測(cè)來(lái)確定轉(zhuǎn)化DNA次序（基因）是否能在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中得到表示，起到匯報(bào)作用。gus基因（β-葡萄糖苷酸酶基因），gfp（綠色熒光蛋白基因）轉(zhuǎn)化目標(biāo)基因能夠省略附加匯報(bào)基因，但選擇標(biāo)識(shí)基因是不可缺乏。實(shí)驗(yàn)四農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥第2頁(yè)植物基因轉(zhuǎn)化受體高效穩(wěn)定再生能力較高遺傳穩(wěn)定性含有穩(wěn)定外植體起源對(duì)選擇性抗生素敏感對(duì)農(nóng)桿菌侵染有敏感性植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)類型：愈傷組織再生系統(tǒng)直接分化再生系統(tǒng)原生質(zhì)體再生系統(tǒng)胚狀體再生系統(tǒng)生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)四農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥第3頁(yè)植物遺傳轉(zhuǎn)化方法植物遺傳轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因槍法PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體電穿孔法操作簡(jiǎn)單，易造成原生質(zhì)體損傷雙子葉植物無(wú)宿主限制，技術(shù)限制原生質(zhì)體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)四農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥第4頁(yè)轉(zhuǎn)基因方法農(nóng)桿菌侵染法基因槍法實(shí)驗(yàn)四農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥第5頁(yè)農(nóng)桿菌侵染法農(nóng)桿菌是一個(gè)天然植物遺傳轉(zhuǎn)化體系對(duì)單子葉植物不敏感根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中細(xì)胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌經(jīng)過(guò)侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。實(shí)驗(yàn)四農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥第6頁(yè)T-DNA整合植物基因組分子機(jī)理T-DNA在植物染色體中插入是隨機(jī)，可插入任何一條染色體。插入位點(diǎn)特點(diǎn)：T-DNA優(yōu)先整合到轉(zhuǎn)錄活躍植物基因位點(diǎn)T-DNA與植物DNA連接處富含A-T堿基對(duì)植物DNA上插入靶位點(diǎn)與T-DNA邊界序列有一定程度同源性。但在T-DNA整合過(guò)程中常有植物基因組靶序列缺失、倒位和重復(fù)等現(xiàn)象，T-DNA整合一定程度上依賴于植物內(nèi)源重組系統(tǒng)?？傊琓-DNA整合是經(jīng)過(guò)植物靶DNA和T-DNA間短同源區(qū)段發(fā)生重組而完成，在接口附近伴有DNA次序轉(zhuǎn)換和重復(fù)。實(shí)驗(yàn)四農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥第7頁(yè)真空浸透法轉(zhuǎn)化擬南芥受體材料擬南芥種子消毒與萌發(fā)，播種后生長(zhǎng)出現(xiàn)花蕾后打頂，待側(cè)枝長(zhǎng)出花蕾后，侵染前一天去除已開花蕾和果莢接種接種含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌GV3101克隆于5mLYEP液體培養(yǎng)基(Rif100μg/mL，Kan50μg/mL)中，28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜活化將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液按照1:100的比例轉(zhuǎn)接到50mL新鮮配制的YEP液體培養(yǎng)基(Rif100μg/mL，Kan50μg/mL)中，28°C，200rpm振蕩過(guò)夜培養(yǎng)至菌液OD600為1-2誘導(dǎo)收集菌體，重懸于浸染緩沖液(1/2MS，5%蔗糖，0.015%SilwetL-77)，將菌液稀釋至OD600為0.6-0.8轉(zhuǎn)化將擬南芥花蕾倒置于裝有花浸染緩沖液的燒杯中，燒杯放置在真空罐中，0.5Mbar抽真空10min培養(yǎng)將擬南芥植株平放在拖盤中，蓋上塑料膜，避光培養(yǎng)。1~2d后去除塑料膜，培養(yǎng)至種子成熟實(shí)驗(yàn)四農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥第8頁(yè)農(nóng)桿菌侵染瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草接種接種含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌GV3101克隆于5mLYEP液體培養(yǎng)基(Rif100μg/mL，Kan50μg/mL)中，28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜活化將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液按照1:100的比例轉(zhuǎn)接到50mL新鮮配制的YEP液體培養(yǎng)基(Rif100μg/mL，Kan50μg/mL)中，28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)至菌液OD600為1-2誘導(dǎo)5000rpm離心5min收集菌體，重懸于浸染緩沖液(1/2MS，5%蔗糖，乙酰丁香酮120μmol/L)，將菌液稀釋至OD600為0.6-0.8侵染煙草組培苗葉片切成小塊，浸泡在菌液中侵染10min后，用無(wú)菌濾紙吸干葉片表面的菌液，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS+5%蔗糖+乙酰丁香酮120μmol/L）上（25±2）℃暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)2d。實(shí)驗(yàn)四農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥第9頁(yè)注射法瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草受體材料種植本生煙(Nicotianabenthamiana)：25°C，16h光照，約一個(gè)月后可用；在注射的前一天將煙草澆水并置于黑暗條件下；接種與活化小量培養(yǎng)農(nóng)桿菌16-24h；按1:100轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)液(5mLYEP，100μM乙酰丁香酮(Aldrich)，10mMMES(pH5.6)，Rif100μg/mL，Kan50μg/mL）中，28°C16-24h誘導(dǎo)當(dāng)菌搖到OD6001.0時(shí)，5000rpm10min收集菌體，用溶液(5ml10mMMgCl2，7.5μL100mM乙酰丁香酮)重懸農(nóng)桿菌至OD6001.0，室溫靜置至少3h侵染用1ml注射器注射煙草葉片，避光培養(yǎng)約48h后，Gus染色觀察實(shí)驗(yàn)四農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥第10頁(yè)乙酰丁香酮Vir區(qū)基因活化直接調(diào)控著T-DNA轉(zhuǎn)移，酚類化合物對(duì)Vir區(qū)基因活化含有主要作用。乙酰丁香酮（Acetosyringone，分子式:HOC6H2(OCH3)2COCH3）AS：遺傳轉(zhuǎn)化中慣用誘導(dǎo)能力較強(qiáng)一個(gè)酚類化合物，乙酰丁香酮之所以能夠提升外植體轉(zhuǎn)化頻率，是因?yàn)樗烧T導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir基因活化，從而促進(jìn)外源基因整合。使用方法：在侵染前4-6h加入液體培養(yǎng)基，使農(nóng)桿菌既處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久，又處于vir基因高度活化狀態(tài)，從而提升侵染能力懸浮離心后用植物外植體培養(yǎng)基稀釋成侵染液時(shí)加入加在農(nóng)桿菌和外植體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，普通農(nóng)桿菌附著16h后才能進(jìn)行轉(zhuǎn)化在農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基及共培養(yǎng)基中都加入AS實(shí)驗(yàn)四農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥第11頁(yè)SilwetL-77擬南芥、油菜等轉(zhuǎn)化必須試劑之一，原產(chǎn)地為美國(guó)GE企業(yè)，Silwet-L77高效有機(jī)硅表面活性劑，能夠極大降低水表面張力(水表面張力為72.4mN/m，0.1%Silwet-L77系列有機(jī)硅溶液表面張力約為21mN/m),這使Silwet-L77有機(jī)硅溶液可輕易濕潤(rùn)幾乎全部種類葉面,相對(duì)于傳統(tǒng)助劑,顯著提升了在靶標(biāo)生物覆蓋面.同時(shí)，Silwet-L77有機(jī)硅助劑含有極強(qiáng)耐水沖刷及滲透能力。Silwet-L77是擬南芥及其它作物慣用轉(zhuǎn)基因用表面活性劑。

實(shí)驗(yàn)四農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥第12頁(yè)植物瞬時(shí)表示系統(tǒng)當(dāng)外源基因?qū)胫参锛?xì)胞中以后，其表示方式有瞬時(shí)表示（transientexpression）和穩(wěn)定表示（stableexpression）兩種。

在瞬時(shí)表示狀態(tài)基因轉(zhuǎn)移中，引入細(xì)胞外源DNA和宿主細(xì)胞染色體DNA并不發(fā)生整合。這些DNA普通隨載體進(jìn)入細(xì)胞后12小時(shí)內(nèi)就能夠表示，并連續(xù)約80小時(shí)左右。在穩(wěn)定表示狀態(tài)基因轉(zhuǎn)移中，導(dǎo)入宿主細(xì)胞DNA整合到細(xì)胞染色體DNA上，以永久形式存在，并可傳給后代，形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞。植物瞬時(shí)表示系統(tǒng)在開啟子分析、基因功效分析和生產(chǎn)重組蛋白方面用途廣泛。實(shí)驗(yàn)四農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥第13頁(yè)Gus基因gus基因起源于E.coli染色體上uidA位點(diǎn)。編碼β-葡萄糖苷酸酶。β-葡萄糖苷酸酶是一個(gè)水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯類物質(zhì)為底物，其反應(yīng)產(chǎn)物可用各種方法檢測(cè)出來(lái)。因?yàn)榻^大多數(shù)植物沒有檢測(cè)到葡萄糖苷酸酶背景活性，所以這個(gè)基因被廣泛應(yīng)用于基因調(diào)控研究中。依據(jù)gus基因檢測(cè)所用底物不一樣，檢測(cè)方法有：組織化學(xué)法、分光光度法和熒光法。實(shí)驗(yàn)四農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥第14頁(yè)操作關(guān)鍵點(diǎn)侵染煙草葉片無(wú)菌操作注意事項(xiàng)抗生素正確使用及抗生素敏感性試驗(yàn)