手足口病的實驗診斷課件

手足口病的實驗診斷安徽省疾病預防控制中心2009.3

.11手足口病的病原手足口?。╤and-foot-mouthdisease,HFMD）由人腸道病毒感染引起。人腸道病毒為小RNA病毒科（Picornaviridae），腸道病毒屬（Enterovirus）的一組單股正鏈RNA病毒。其中包括?？刹《荆?1個血清型）、柯薩奇病毒A組（23個血清型）和B組（5個血清型），還包括3個脊髓灰質(zhì)炎病毒血清型和人腸道病毒68-71型。

CourtesyofLindaM.Stannard,UniversityofCapeTown,S.A.h~30nm二十面體對稱無包膜人腸道病毒的毒粒結(jié)構(gòu)人腸道病毒發(fā)現(xiàn)的歷史脊髓灰質(zhì)炎病毒：1909年首次鑒定出該病毒，1949年，利用細胞培養(yǎng)的方法增殖病毒，為疫苗的研制奠定了基礎?？滤_奇病毒：1948年在美國紐約Coxsackie鎮(zhèn)，將兩名麻痹患兒的標本接種至乳鼠體內(nèi)，分離出來的一組病毒定名為柯薩奇病毒。根據(jù)它們在乳鼠上產(chǎn)生的組織病理學變化和在細胞培養(yǎng)上的能力，分為柯薩奇病毒A組和B組。埃可病毒：1951年在一名無癥狀的兒童的糞便標本中分離到，在細胞培養(yǎng)上可以造成致細胞病變，但對乳鼠和靈長類動物不致病。新腸道病毒：隨后新發(fā)現(xiàn)的病毒被按照序號命名（69~71），最近，已經(jīng)命名至102型腸道病毒主要血清型腸道病毒的抵抗力腸道病毒無包膜，乙醚、75%酒精、表面活性劑等均不能將其滅活。對紫外線及干燥敏感；各種氧化劑（高錳酸鉀、漂白粉等）、甲醛或56℃30min都能滅活病毒病毒在4℃可存活1年，-20℃可長期保持感染性病毒RNA有感染性。（一）糞便標本采集病人發(fā)病7日內(nèi)的糞便標本，用于病原檢測。糞便標本采集量5～8g/份，采集后立即放入無菌采便管內(nèi)，4℃暫存立即(12h內(nèi))送達實驗室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于－70℃冰箱。（二）腦脊液標本出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病例，要采集腦脊液標本，進行病原和抗體檢測。采集時間為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3日內(nèi)，采集量為1.0～2.0ml。采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，4℃暫存立即(12h內(nèi))送達實驗室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于－70℃冰箱。手足口病的標本采集（五）皰疹液可同時采集多個皰疹作為一份標本，用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內(nèi)裝有3～5ml保存液（維持液或生理鹽水）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封。所采集標本4℃暫存立即(12h內(nèi))送達實驗室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于－70℃冰箱。手足口病的標本采集標本采集器械要求注射器：醫(yī)用（5ml和10ml）一次性注射器棉拭子：塑料桿全血收集管：10ml螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)血清保存管：2ml螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)，可耐深低溫（液氮保存）糞便保存管：5-20ml螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)，可耐深低溫（液氮保存）-全國POLIO網(wǎng)絡實驗室鼻咽拭子保存管：10ml螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)，可耐深低溫（液氮保存）痰液保存管：50ml螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)，可耐深低溫（液氮保存）尸檢組織凍存管：50ml螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)；尸檢（每一個樣品換手術刀）記號筆：油性，防水標本采集器械要求病人標本的采集運輸和保藏標本采集注意事項為了保證檢測結(jié)果的準確性和有效性，標本應在病例發(fā)病后盡早采集，盡快檢測。不能立即檢測的標本應冷凍保存。對于血清學診斷，急性期血清應該在發(fā)病后盡早采集，恢復期血清在發(fā)病2-4周后采集。手足口病的診斷一般是通過采集適當?shù)呐R床標本后進行基因檢測、抗原檢測、血清學抗體檢測、病毒分離和病鑒定手足口病的實驗室診斷標本病毒分離CPE陽性RT-PCR及序列測定腸道病毒非腸道病毒測雙份血清中和抗體滴度RT-PCRRealtimeRT-PCR檢測病毒核酸序列測定無CPE常規(guī)實驗補充實驗中和定型手足口病的實驗室檢測流程病毒分離培養(yǎng)用于病毒分離的標本：

包括糞便、咽拭子和皰疹液，如果患者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，可以采集腦脊液標本適用的細胞RD細胞（人胚胎橫紋肌肉瘤細胞）、Hep-2細胞（人喉上皮癌細胞）病毒分離培養(yǎng)標本的處理1、糞便：2g加PBS10ml，振蕩混勻，1500g低溫離心20min，上清0.2ml接種敏感細胞2、咽拭子：于采樣管中充分洗滌拭子，4℃下10000rpm離心20min，上清0.2ml接種敏感細胞3、腦脊液和皰疹液：直接接種病毒分離培養(yǎng)培養(yǎng)觀察：36℃培養(yǎng)逐日觀察，第1代培養(yǎng)見可疑CPE至觀察滿7天后再繼續(xù)凍融傳代，待穩(wěn)定CPE出現(xiàn)后,-20℃或-70℃凍存以備進一步鑒定；如果7天之后沒有出現(xiàn)CPE，需盲傳2代繼續(xù)觀察，盲傳2代后仍不出現(xiàn)CPE則判定為陰性；鑒定：中和試驗血清抗體檢測方法中和實驗、ELISAIgM：單份血：急性期IgG：雙份血：急性期，恢復期陰轉(zhuǎn)陽，四倍升高，四倍降低均可診斷近期感染病毒核酸檢測—RT-PCRRT-PCR(ReverseTranscriptasePCR)用于RNA病毒的檢測，酶促催化使RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，逆轉(zhuǎn)錄與第一次PCR在同一系統(tǒng)內(nèi)進行，逆轉(zhuǎn)錄完成后，加熱滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，然后開始PCR擴增。一條寡聚脫氧核苷酸引物先與mRNA雜交，然后由依賴RNA的DNA聚合酶催化合成相應互補的cDNA拷貝，后者能進一步用于PCR擴增。

糞便標本：采用氯仿進行處理。

肛拭子/咽拭子標本：咽拭子要在標本保存液中充分攪動，然后在4℃下，10000rpm離心20min。

皰疹液和腦脊液：直接用于RNA提取。標本的預處理可使用商業(yè)化試劑盒從臨床標本中提取病毒RNA

簡化操作、規(guī)范方法、條件一致、排除干擾QIAGENViralRNAMiniExtractionKit（CAT：52904）適合臨床標本和病毒培養(yǎng)物標本QIAGENRneasyMiniKit（CAT：74104）適合組織和咽拭子標本RNA的提取EV71核酸檢測引物序列：EV71-S（上游）：5`-

GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3`EV71-A（下游）：5`-

ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC-3`引物CA16核酸檢測引物序列：CoxA16-S（上游）：5`-ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3`CoxA16-A（下游）；5`-TCAGTGTTGGCAGCTGTAGG-3`引物根據(jù)自己實驗室的實際情況建立各自RT-PCR反應體系配下列試劑主溶液：10×PCRBuffer（含Mg2+）·················································5.0μldNTPs（2.5mMeach）·······················································2.0μl上游引物（0.1μg/μl）························································1.0μl下游引物（0.1μg/μl）························································1.0μlRNA酶抑制劑（RNasin,40U/μl）······································0.5μlTaqDNA聚合酶（5U/μl）·················································0.5μlAMV逆轉(zhuǎn)錄酶（10U/μl）··················································1.0μl模板RNA··········································································3.0μlRNaseFreedH2O···························································36.0μl

50.0μl反應體系在PCR儀上進行RT-PCR反應，反應步驟如下：42℃························45min95℃························3min95℃························20s50℃························25s×32個循環(huán)

72℃························30s72℃························10min4℃························Soak溫度循環(huán)參數(shù)通過比較標本的PCR產(chǎn)物與陽性對照的PCR產(chǎn)物在凝膠上的位置以及大小來解釋結(jié)果。結(jié)果解釋RT-PCR實驗結(jié)果解釋實驗室診斷原則人腸道病毒在自然界廣泛存在且種類繁多，一病多原、一原多癥是腸道病毒感染的重要特征。因而應對血清診斷及病原診斷的實驗室結(jié)果作嚴格評價，必須結(jié)合臨床癥狀及環(huán)境因素流行病學分析，以確立病毒與疾病的病原學關系。一般采取的原則為：（1）病毒分離陽性率遠高于對照人群；（2）病程中有特異性抗體變化并排除其他病毒感染；（3）從病變組織中分離出病毒。從疑為腸道病毒感染的腦炎/腦膜炎患者的腦脊液中檢測到相應的腸道病毒核酸（RT-PCR法），或分離到病毒或腸道病毒IgM陽性，即可證明是該腸道病毒引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。從疑為死于EV71（或其它腸道病毒）的尸檢標本中檢測到相應的腸道病毒核酸，或分離到病毒或腸道病毒IgM陽性，即可證明是該腸道病毒是病因。從HFMD患者的皰疹液中檢測到相應的腸道病毒核酸，或分離到病毒，那么該病毒就是病因病原。實驗結(jié)果的診斷意義實驗結(jié)果的診斷意義當無法進行病毒分離或未分離到病毒時，血清學診斷方法可以作為病毒感染的間接證據(jù)。腸道病毒有時引起無癥狀感染，只從個別HFMD患者糞便標本中分離到EV71（或其它腸道病毒）時，不能輕易下結(jié)論EV71是病因，應該擴大樣本量，所以實驗結(jié)果的實際意義應結(jié)合臨床過程和流行病學資料進行解釋。手足口病檢測實驗室相關問題1、實驗室生物安全問題：必須重視的問題實驗人員受過生物安全培訓①有防范潛在生物危害的意識②熟悉生物安全規(guī)程，掌握生物安全技能實驗室自己的生物安全指南合格的生物安全實驗室實驗室文件化的規(guī)程及方法（包括常規(guī)的和特殊的）2、PCR實驗室質(zhì)量控制問題：保證實驗結(jié)果可靠的必要手段實驗對照：陽性、陰性、試