瘧原蟲血片制作方法

瘧原蟲血片制作方法第一頁，共26頁。血膜的制作（取血時間）取血時機(jī)現(xiàn)癥病人一般可隨時取血，瘧疾普查時可不考慮取血時機(jī)。但在診斷或需要某期瘧原蟲作標(biāo)本時，則應(yīng)掌握適宜的取血時機(jī)。間日瘧在寒熱發(fā)作時，外周血液中主要可見環(huán)狀體期；發(fā)作后數(shù)小時，環(huán)狀體發(fā)育到滋養(yǎng)體期，瘧色素形成，形態(tài)較易辯認(rèn)，為診斷的有利時機(jī)；36~48小時，可檢出裂殖體；發(fā)作一、二次后，配子體出現(xiàn)較多。惡性瘧較理想的取血時間是在發(fā)作后至20小時內(nèi)取血，初發(fā)患者退熱后常查不到原蟲。第二頁，共26頁。血膜的制作（取血操作）取血方法采血部位一般人為耳垂，指頭，通常在耳垂取血（現(xiàn)場取血建議用大頭針采血，一人一針，避免血傳疾病）。先用75%酒精棉球消毒取血部位（冬季用手捻動耳垂使其充血后再行消毒），待酒精干后，用左手拇指和食指緊捏耳垂上方，右手持消毒針迅速刺入耳垂下端1~2毫米，不宜過深或過淺。然后用右手中指輕輕向擠壓出血。第三頁，共26頁。取血量及涂片法（涂片操作）薄血膜取潔凈的載玻片2張，1張平置在桌上，以左手拇指，食指夾持載玻片兩端（手指切勿接觸玻片表面），用另一張邊緣平滑（最好為磨口邊緣）的載玻片做推片，用推片一端邊緣的中點從取血部分取約1微升的血量（相當(dāng)于1/4火柴頭大?。?，使血滴與平置的載玻片接觸，并形成25~30度夾角，待血液向兩側(cè)擴(kuò)展約2厘米長度時，均勻而迅速地輕輕向左推出（約2.5厘米長）。第四頁，共26頁。（涂片操作）厚血膜用推片的一角，從取血部位刮取約4微升血量（相當(dāng)于火柴頭大小），使血滴與平置的載玻片接觸，再由里向外一個方向旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)2~4圈，涂成直徑0.8~1厘米大小圓形厚血膜，血膜厚薄均勻，過厚易于脫落，過薄達(dá)不到檢出率的要求。第五頁，共26頁。血膜的制作（涂片操作）涂制厚、薄血膜的位置通常是將厚、薄血膜涂在一張載片上。方法是將載片分為6等分，第1、2格備貼標(biāo)簽及編號用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前緣至第6格中部。作為標(biāo)本的血片每張玻片涂厚、薄血膜各1個；門診和發(fā)熱病人血片每片1人，涂涂2個厚血膜1個薄血膜，以防血膜脫落而影響檢查；瘧疾調(diào)查時，每張玻片可涂制2~3人血膜。標(biāo)本片發(fā)熱病人血片標(biāo)簽標(biāo)簽第六頁，共26頁。血膜的制作血膜編號血膜制成后，立即用特種蠟筆或水筆于玻片面上寫上受檢者的號碼，以防差錯，待薄血膜干后再用鉛筆于薄血膜中寫上血片種類的代號和受檢者的個人編號，依次順序插入標(biāo)本盒內(nèi)。第七頁，共26頁。制作血膜的注意事項

1.玻片清洗時，避免玻片碰撞、磨損。制作血膜的載玻片必須完全清潔而毫無油漬或污垢。制片時，手指只能持載片的邊緣，不能接觸玻片表面，以免油污使薄血膜產(chǎn)生空白區(qū)以及厚血膜脫落。作為推片的玻片邊緣一定要平滑，才能使推出的血膜均勻一致。第八頁，共26頁。制作血膜的注意事項2.剛涂制的血膜要平放在標(biāo)本盒內(nèi)，厚血膜未干前勿使標(biāo)本盒傾斜，以免血膜傾向一側(cè)，造成血膜厚薄不均，厚處不一溶血和著色而影響檢查結(jié)果；晾干血膜時應(yīng)注意防塵、防止蒼蠅、蟑螂等昆蟲吮吸血膜，干后應(yīng)及時裝入標(biāo)本盒并蓋嚴(yán)，新的木制標(biāo)本盒需敞開放置一段時間，讓木醇揮發(fā)后才能使用，以免厚血膜紅蛋白被其固定，不能溶血或染色效果不佳。第九頁，共26頁。制作血膜的注意事項3.血膜讓其自然干燥，切忌用太陽曬或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天標(biāo)本盡可能24~48小時內(nèi)固定染色；冬天也不能超過72小時。放置時間越久，厚血膜越不易脫血，染色效果也差。若不能及時染色，膜血膜宜先用甲醇固定（1~3分鐘）然后用過濾清水對厚血膜溶血，晾干固定后裝入盒內(nèi)蓋嚴(yán)，待以后染色。第十頁，共26頁。血片的染色

（一）染液的種類及染色原理染液種類：目前所用的血片染色液，雖然名稱很多，但都是從羅門諾夫斯基氏創(chuàng)造的染液變化過來的。總的可分為水溶液和酒精溶液兩大類，前者包括羅氏、西氏（Simon)、J.S.B氏染液等，后者包括利氏(Leishman)、瑞氏和吉氏染液等。這些染液中的主要染劑都包含美蘭、伊紅和由美蘭氧化所成的天青，所以稱多色性染劑。第十一頁，共26頁。血片的染色

（一）染液的種類及染色原理染色原理：伊紅是酸性水溶性鈉鹽，美蘭是堿性水溶性鹽酸鹽，當(dāng)它們各自溶化水中時，就離解為帶陽電和陰電的離子。伊紅主要離解為酸性的陽離子，在遇到堿性的蛋白質(zhì)如血紅蛋白、嗜伊紅白血球顆粒等即可結(jié)合成不易溶于水的沈淀物染成紅色。美蘭主要離解為堿性的美蘭離子，美蘭就與瘧原蟲、淋巴和大單核細(xì)胞的胞漿、嗜堿性白細(xì)胞的顆粒等酸性蛋白質(zhì)結(jié)合染成蘭色。第十二頁，共26頁。血片的染色

（一）染液的種類及染色原理染色原理：美蘭與伊紅都不能使原蟲和白細(xì)胞的核著色，必須由天青作為媒介（染媒）才能使其著色。天青雖然也是堿性染劑，但又具有染媒作用，使原蟲核和白細(xì)胞核等原來只能染上極淡蘭色的結(jié)構(gòu)染上顯著的酸性染劑伊紅，這樣，就使白細(xì)胞粗大的核染成顯著的既蘭又紅的紫蘭色，而較小或菲薄的原蟲核和淋巴細(xì)胞原漿中的顆粒染成紫紅色。第十三頁，共26頁。血片的染色

（一）染液的種類及染色原理注意：蛋白質(zhì)是二性電解質(zhì)，當(dāng)其處于較等電點為酸的溶液中時，便呈鹼的作用，即與酸或陰離子結(jié)合，這就說明為何在染液偏酸時，伊紅的著色力強(qiáng)，使紅細(xì)胞著色鮮艷而淋巴細(xì)胞和原蟲的胞漿著色不著；反之，蛋白質(zhì)在偏鹼的溶液中呈酸的作用而中和鹼基，也就說明為何染液偏鹼時，紅細(xì)胞和嗜伊紅白細(xì)胞的顆粒等被染成紫蘭色。

伊紅在水溶液內(nèi)遇到美蘭或天青，即可互相化合而產(chǎn)生沈淀從而失去染色力，因此，吉氏母液絕對不能進(jìn)水。第十四頁，共26頁。血片的染色

（二）吉氏染液母液配置方法取吉氏粉0.5克置于研缽中，加少量甘油充分研磨，再加再磨，至25毫升加完為止，倒入60或100毫升帶有玻塞的有色玻瓶中。在研缽中加少量甲醇，洗去甘油濃液混入瓶內(nèi)，至25毫升甲醇洗凈缽中甘油染液為止，塞緊瓶塞，充分搖勻，置于55~60℃水浴中或溫箱內(nèi)24小時或室溫內(nèi)3~5天，多加搖動，即成原液。吉氏染液是目前較優(yōu)良的血膜染劑，即使在炎熱天氣中，亦可經(jīng)久不變。材料：1、吉氏粉0.5克2、甘油25毫升3、甲醇25毫升第十五頁，共26頁。血片的染色

（三）吉氏染液血片染色方法先用甲醇或無水酒精固定薄血膜，待干后進(jìn)行染色。亦可在固定薄血膜后用清水對厚血膜溶脫血紅蛋白，然后才進(jìn)行染色。

成批血片染色：將已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入2%吉氏染液稀釋液（2毫升原液加中性蒸餾水98毫升稀釋均勻即成），同時對厚薄血膜染色30分鐘（如染液不合標(biāo)準(zhǔn)時，得酌情增減染色時間），然后用清水輕輕將染液沖去，再用清水輕輕沖洗一次，干凈后將血片標(biāo)本（血膜面朝下）插于晾干板上，待干鏡檢。第十六頁，共26頁。血片的染色

（三）吉氏染液血片染色方法先用甲醇或無水酒精固定薄血膜，待干后進(jìn)行染色。亦可在固定薄血膜后用清水對厚血膜溶脫血紅蛋白，然后才進(jìn)行染色。

單張血片染色：薄血膜經(jīng)固定干燥后，用2%吉氏染液稀釋液1~2毫升，滴入血片標(biāo)本上染色30分鐘左右，或用中性蒸餾水1毫升，加吉氏母液1~2滴，混合均勻后滴入血片標(biāo)本上，染色10~20分鐘，然后用清水輕輕將片上的染液沖洗干凈，晾干鏡檢。第十七頁，共26頁。影響染色效果的因素血片染色好壞除了與玻片是否清潔，血片制作質(zhì)量好壞等有關(guān)外，還受到以下幾個因素的影響：（1）染料溶劑的質(zhì)量染料、甲醇和甘油如果不純，常使配制的染液偏酸或偏堿而影響染色效果。因此必須用分析純的甲醇和中性甘油，而且在配制時所用的器具必須干凈而無水份。第十八頁，共26頁。影響染色效果的因素（2）染液的新舊新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力較弱且常呈現(xiàn)偏堿性。染液存放時間越久，染色力越強(qiáng)。通常在染液配制1~2周后才使用，盛裝染液的瓶子應(yīng)加塞蓋密。以防吸潮而影響染液質(zhì)量。第十九頁，共26頁。影響染色效果的因素（3）染液稀釋后使用時間吉氏和瑞氏染液的主要成份是美藍(lán)、伊紅和由美藍(lán)氧化產(chǎn)生的天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中伊紅遇到美藍(lán)和天青即產(chǎn)生沉淀。因此，必須在稀釋染液當(dāng)時使用，一般在半小時內(nèi)染色力最強(qiáng)。第二十頁，共26頁。影響染色效果的因素（4）染液的稀釋濃度染液的濃度高其著色就快而深，從而瘧原蟲寄生紅細(xì)胞的薛氏點粗大顯著，但顏色常偏堿；染液濃度過低則染色時間久，顏色偏酸，薛氏點不明顯或消失。第二十一頁，共26頁。影響染色效果的因素（5）染色時間染色時間長染色效果好，反之較差。室溫高則著色快，染色時間可略縮短，氣溫低可適當(dāng)延長。因此染色時間應(yīng)根據(jù)染液的質(zhì)量、新舊、稀釋濃度和氣溫而適當(dāng)增減。第二十二頁，共26頁。影響染色效果的因素（6）染色用水染液的稀釋用水和染色后沖洗用水應(yīng)選擇Ph7.0~7.2清潔水，通常使用的新鮮的蒸餾水或過濾的冷開水，以及自來水、井水、河水、泉水和雨水等。如果偏酸或偏堿，可用緩沖蒸餾水調(diào)整。染色后發(fā)現(xiàn)血膜顏色偏藍(lán)（偏堿）或偏紅（偏酸）時，可用與之相反的酸、堿度水沖洗血片予以糾正。第二十三頁，共26頁。影響染色效果的因素（7）染色后不要直接將染液倒掉，應(yīng)沿玻片或染色缸邊緣加水使染液表面一層溢出，并輕輕沖洗，以免染液色素顆粒沾污血膜。第二十四頁，共26頁。顯微鏡的一般構(gòu)造1.鏡座9.粗調(diào)節(jié)器17.濾光鏡圈2.鏡柱10.細(xì)調(diào)節(jié)器18.反光鏡3.鏡臂11.齒板4.傾斜度關(guān)節(jié)12.鏡臺5.鏡筒13.推動器6.接目鏡14.彈簧夾7.旋轉(zhuǎn)盤15.聚光器8.接物鏡16.虹彩第二十五頁，共26頁。血片的鏡檢1.在學(xué)習(xí)鏡檢瘧原蟲之前，必須先對正常厚薄血膜中各種血細(xì)胞