基因敲除小鼠技術(shù)

精品文檔轉(zhuǎn)基因、基因敲入/敲除動(dòng)物技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)領(lǐng)感謝閱讀歷史，經(jīng)典技術(shù)如原核顯微注射、胚胎干細(xì)胞顯微注射技術(shù)一直以來經(jīng)久感謝閱讀感謝閱讀一、技術(shù)介紹與研究進(jìn)展轉(zhuǎn)/敲除動(dòng)物技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)感謝閱讀十年代誕生以來，至今已有近四十年的歷史，經(jīng)典技術(shù)如原核顯微注射、且如同剪切酶和抗體等常規(guī)分子生物學(xué)試劑的制備技術(shù)一樣，逐漸從基礎(chǔ)研究藥物和數(shù)以千計(jì)的優(yōu)秀文章。盡管如此，傳統(tǒng)技術(shù)仍然存在一些難以克服的缺陷，如步驟繁瑣、周期漫長、成功率低、費(fèi)用高昂等，而ZFN和等新技術(shù)的出現(xiàn)，或有可能將這一局面徹底改變。感謝閱讀二、同源重組技術(shù)原理基因敲除鼠技術(shù)是上世紀(jì)年代中后期基于同源重組的原理發(fā)展起來的，Capecchi和Smithies在1987年根據(jù)同源重組（homologousrecombination）

的原理，首次實(shí)現(xiàn)了ES的外源基因的定點(diǎn)整合（targetedintegration），這一

技術(shù)稱為基因打靶（genetargeting）或基因敲除（geneknockout），利用

這種ESKOMice:knockoutmice;

由于這一工作，Capecchi和Smithies于2007年與Evans分享了諾貝爾醫(yī)學(xué)

獎(jiǎng)。精品文檔放心下載homologousrecombinationsister

chromatin)之間或同一染色體上含有同源序列的分子之間或分子之內(nèi)的重

有相同片段的重組載體，將重組載體導(dǎo)入到胚胎干細(xì)胞后外源的重組載體與胚胎干細(xì)胞中相同的片段會(huì)發(fā)生同源重組，如圖1所示：精品文檔放心下載1歡迎下載。精品文檔圖1.基因敲除鼠制作同源重組原理示意圖三、制作流程圖2.基因敲除鼠制作過程示意圖1.Knockout載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建根據(jù)研究項(xiàng)目具體情況和要求把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的片段都重組到帶有標(biāo)記基因(如基因，TK)的載體上，成為重組的Knockout載體。精品文檔放心下載2歡迎下載。精品文檔2.KnockoutES細(xì)胞篩選Knockout載體測(cè)序驗(yàn)證正確后，將載體線性化，然后電轉(zhuǎn)入ES細(xì)胞，通過載體

上的正負(fù)篩選基因獲得陽性的KnockoutESPCR鑒定打靶載體正確

插入的ES用于SouthernBlotSouthernBlot鑒定的

Knockout精品文檔放心下載ES擴(kuò)大培養(yǎng)并液氮保存。謝謝閱讀3.KnockoutES細(xì)胞囊胚注射得到嵌合體小鼠精品文檔放心下載擴(kuò)增經(jīng)鑒定插入或置換片段位置正確的KnockoutES方式將一定數(shù)量的KnockoutES到假孕的小鼠子宮中。待后代小鼠出生后，通過小鼠的毛色中來源于ES細(xì)胞

毛色的比例判斷嵌合程度的高低，以及該小鼠的后代中可能獲得生殖系傳遞能力。謝謝閱讀4.由嵌合體小鼠繁殖出生殖遺傳系Knockout小鼠感謝閱讀PCR鼠是否含有打靶序列。如有，則該小鼠為具備生殖遺傳能力的Knockout小鼠(F1

代鼠)。感謝閱讀5.Knockout小鼠生殖系傳遞鑒定PCR基因型鑒定謝謝閱讀的方法驗(yàn)證嵌合體小鼠生殖系傳遞能力。四、基因敲除常見方法一、常規(guī)基因敲除鼠（ConventionalKnockout）精品文檔放心下載3歡迎下載。精品文檔感謝閱讀區(qū)域用Cassette替換掉。這樣的小鼠其全身所有的組織和細(xì)胞中都不表達(dá)響，而且這個(gè)基因沒有胚胎致死性。精品文檔放心下載二、條件性基因敲除小鼠（Knockout）精品文檔放心下載條件性基因敲除小鼠是通過基因打靶，把兩個(gè)位點(diǎn)放到目的基因一個(gè)或幾

CreCre胞中敲除該基因，而該基因在其他組織或細(xì)胞表達(dá)正常。謝謝閱讀）用于研究該基精品文檔放心下載因在特定的組織或細(xì)胞中的生理病理功能。三、基因敲入小鼠（Knockin）4歡迎下載。精品文檔感謝閱讀用小鼠的表達(dá)調(diào)控元件指導(dǎo)目的基因表達(dá)。此類基因敲入鼠一般用于藥物的篩選，信號(hào)通路的研究等。精品文檔放心下載獲得嵌合體及之后品系純化詳細(xì)流程：5歡迎下載。精品文檔五、基因敲除其他方法一、ZFN技術(shù)制作基因敲除鼠ZFN能夠識(shí)別并結(jié)合指定的基因序列位點(diǎn)，并高效精確地切斷。隨后細(xì)胞利用天然的修復(fù)過程來實(shí)現(xiàn)DNA所自然發(fā)生的同源重組，其效率只有百萬分之一，而ZFN的基因敲除效率能

達(dá)到。利用這些技術(shù)進(jìn)行小鼠基因的定點(diǎn)敲除和敲入，可以把時(shí)間從一年

縮短到幾個(gè)月。謝謝閱讀這項(xiàng)技術(shù)中設(shè)計(jì)特異性的ZFN法設(shè)計(jì)高特異性的ZFN，但ZFN的脫靶（off），也就是把不該切的地方切

ZFN技術(shù)進(jìn)行小鼠的基因修

飾還無法完全取代傳統(tǒng)技術(shù)。謝謝閱讀二、TALEN技術(shù)制作基因敲除鼠TALEN技術(shù)是一種嶄新的分子生物學(xué)工具?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)，來自一種植物細(xì)菌的

TAL蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點(diǎn)的核酸序列有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結(jié)合任意序列的模塊化蛋白，從而達(dá)

到靶向操作內(nèi)源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能識(shí)別任意目標(biāo)基因序

列，以及識(shí)別序相等或更好的靈

活性，TALEN

技術(shù)進(jìn)行小鼠的基因修飾仍然無法取代傳統(tǒng)技術(shù)。謝謝閱讀6歡迎下載。精品文檔六、常見問題與解答什么是ES細(xì)胞顯微注射？體小鼠的組織，將同時(shí)含有來源于囊胚的細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。嵌合體小鼠必須

靶基因（來源于胚胎干細(xì)胞）穩(wěn)定的生殖系傳遞的小鼠。一般情況下，大約能獲得繼承了目的基因的后代。精品文檔放心下載嵌合體感謝閱讀機(jī)體身上有兩種或兩種以上染色體組成不同的細(xì)胞系同時(shí)存在,彼此能夠耐受,

不產(chǎn)生排斥反應(yīng),謝謝閱讀精品文檔放心下載精品文檔放心下載7歡迎下載。精品文檔生的個(gè)體也叫嵌合體，即該生物體中嵌合了兩種不同遺傳結(jié)構(gòu)的細(xì)胞（一種是謝謝閱讀基因型被改變了的細(xì)胞，另一種是原來的基因型的細(xì)胞）。感謝閱讀3.條件性敲除的原理？答：Cre-LoxP系統(tǒng)是源于P1噬菌體的一個(gè)重組體系,由Cre酶和相應(yīng)的位點(diǎn)組成,它能導(dǎo)致重組發(fā)生在特定的序列處(LoxP位點(diǎn)),該系統(tǒng)可以將外

源基因定點(diǎn)整合到染色體上或?qū)⑻囟ㄆ蝿h除。基于Cre-LoxP的基因打

靶的基因組中引入謝謝閱讀精品文檔放心下載Cre介導(dǎo)的重

組來實(shí)現(xiàn)靶基因的遺傳修飾或改變。Cre-LoxP系統(tǒng)既可以在細(xì)胞水平上用

Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中靶細(xì)胞，通過識(shí)別LoxP位點(diǎn)將抗性標(biāo)記基因切除，又可

以在個(gè)體水平上將重組雜合子小鼠與Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，篩選子代小鼠就

可得到刪除外源標(biāo)記基因的條件性敲除小鼠。謝謝閱讀4.如何鑒定和挑選嵌合體？謝謝閱讀根據(jù)毛色去鑒定。注射的ES和囊胚來源不同的小鼠品系。它們的毛色不同。因精品文檔放心下載此可以根據(jù)毛色的嵌合率來鑒定和挑選嵌合體。5.ROSA26與定點(diǎn)插入？答：利用同源重組技術(shù)，把外面的片段或者其他片段，定點(diǎn)插入到

ROSA26位置。ROSA26是一個(gè)安全區(qū)域，外源性的基因定點(diǎn)插入這個(gè)位點(diǎn)不會(huì)影

響其他基因的表達(dá)。精品文檔放心下載謝謝閱讀七、Farms,Inc.成立于年，是位于紐約哈得孫河谷地區(qū)的一家家族企業(yè)。自成立以來，公司一直精品文檔放心下載是世界上最大的實(shí)驗(yàn)室嚙齒動(dòng)物供應(yīng)商之一，在持續(xù)生產(chǎn)高品質(zhì)、定義明確的謝謝閱讀Taconic在轉(zhuǎn)基因小鼠的定制設(shè)計(jì)和生產(chǎn)、小感謝閱讀鼠和大鼠育種、屏障系統(tǒng)、基因和動(dòng)物健康方面的專業(yè)經(jīng)驗(yàn)為利用活體模型開展藥物開發(fā)的研究人員提供支持。在美國和歐洲設(shè)有六個(gè)育種工廠和三個(gè)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室，員工人數(shù)超過名，致力于從謝謝閱讀8歡迎下載。精品文檔賽業(yè)生物科技是目前國內(nèi)探生網(wǎng)提醒：最大的轉(zhuǎn)基因/基因敲除鼠技術(shù)服務(wù)供應(yīng)商，旗下的

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