細(xì)胞培養(yǎng)課件

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一、基本概念傳代：細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)一定時(shí)間后，被分開(kāi)接種到新的培養(yǎng)器皿中。原代培養(yǎng)：取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。細(xì)胞系（cellline）:原代培養(yǎng)細(xì)胞首次傳代成功后的細(xì)胞，稱細(xì)胞系。細(xì)胞株(cellstrain):從一個(gè)經(jīng)過(guò)生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過(guò)篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱細(xì)胞株。再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細(xì)胞群，亦可稱之為亞株（Substrain）瘤株：在動(dòng)物體內(nèi)可傳代的腫瘤細(xì)胞系。ATCCAmericanTypeCultureCollection美國(guó)模式培養(yǎng)物收集中心,美國(guó)菌種保存中心（一）貼附型大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，判斷細(xì)胞形態(tài)時(shí)不能按照體內(nèi)組織學(xué)標(biāo)推判定，僅大致分成以下四型：1、成纖維細(xì)胞型：胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀。除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類似時(shí)皆可稱之為成纖維細(xì)胞。

名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的來(lái)源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細(xì)胞，心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)，胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出2—3個(gè)長(zhǎng)短不等的突起，中有卵圓形核生長(zhǎng)特點(diǎn)：排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片，細(xì)胞—細(xì)胞接觸易斷開(kāi)而單獨(dú)行動(dòng)，游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個(gè)伸長(zhǎng)的細(xì)胞突起成纖維細(xì)胞2、上皮型細(xì)胞：細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜。生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連，很少單獨(dú)行動(dòng)。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。上皮型細(xì)胞（二）懸浮型：見(jiàn)于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長(zhǎng)。這類細(xì)胞容易大量繁殖。三、培養(yǎng)細(xì)胞生命期（LifeSpanofCultureCells）

所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。原代培養(yǎng)期傳代期衰退期1．原代培養(yǎng)（PrimaryCulture）期：

也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見(jiàn)細(xì)胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。細(xì)胞群是異質(zhì)的（Heterogeneous），也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。如把這種細(xì)胞群稀釋分散成單細(xì)胞，在軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞克隆形成率（CloningEfficiency）很低，即細(xì)胞獨(dú)立生存性差。克隆形成率即細(xì)胞群被稀釋分散成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，形成細(xì)胞小群（克?。┑陌俜?jǐn)?shù)。初代培養(yǎng)細(xì)胞多呈二倍體核型；由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大，是檢測(cè)藥物很好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。2．傳代期：

初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系（CellLine）。在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系（DiploidCellLine）。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當(dāng)前世界上常用細(xì)胞均在不出十代內(nèi)凍存。如不凍存，則需反復(fù)傳代以維持細(xì)胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導(dǎo)致細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。3．衰退期：

此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點(diǎn)（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（SpontaneousTransformation）。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無(wú)限細(xì)胞系（InfiniteCellLine），也稱連續(xù)細(xì)胞系（ContinuousCellLine）。無(wú)限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀。組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期

所謂細(xì)胞“一代”一詞，系僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說(shuō)法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代（Generation）或倍增〔Doubling）不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3～6次。細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過(guò)以下5個(gè)階段：游離期：

細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。

10分鐘一4小時(shí)貼壁期：

細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘一4小時(shí)貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長(zhǎng)基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長(zhǎng)基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）指數(shù)增生期（LogarithmicgrowthPhase）：

這是細(xì)胞增值最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂指數(shù)（MitoticIndex：MI）表示，即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%～0.5%，初代細(xì)胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%～5%。

在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長(zhǎng)空間漸趨減少、最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（ContactInhibition）。細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營(yíng)養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制（DensityInhibition），導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。四、培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件1細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要2細(xì)胞的生存環(huán)境溫度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4

滲透壓

3無(wú)污染

4無(wú)毒

（一）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用品：超凈工作臺(tái)，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器液氮罐自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)吸引器，培養(yǎng)板，凍存管超凈臺(tái)

超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過(guò)高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過(guò)工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。

濾器CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2

。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒③箱內(nèi)火菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。自動(dòng)雙重純水蒸餾器純水儀培養(yǎng)板

培養(yǎng)瓶

常用玻璃器皿清洗浸泡（自來(lái)水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小時(shí)）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50℃烘干清潔液的配制（二）細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無(wú)Ca2+、Mg2+的緩沖液

PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20

加水至1000ml消化液：胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。

胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過(guò)一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。

胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％。用濾器過(guò)濾除菌。胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來(lái)源受限。成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染

合成培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。

人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。一般說(shuō)來(lái)．含5％小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死．但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加10％血清。血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長(zhǎng)因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56℃，30分鐘血清的消毒：過(guò)濾除菌抗菌素的使用：在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位——方便、廣譜、穩(wěn)定完全培養(yǎng)基的組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基80％一95％血清5％一20％碳酸氫鈉2.0g/L青、鏈霉素各100單位／毫升培養(yǎng)基的配制

RPMI-1640培養(yǎng)粉1袋碳酸氫鈉2.0g?

青、鏈霉素各100單位／毫升加三蒸水至1000ml,過(guò)濾除菌。

調(diào)節(jié)pH值至7.2

加血清（終濃度10％）

無(wú)菌操作技術(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件?！九囵B(yǎng)前準(zhǔn)備】

在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前要制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點(diǎn)無(wú)誤后將其放置操作場(chǎng)所(培養(yǎng)室、超凈臺(tái))內(nèi)，然后開(kāi)始消毒。這可以避免開(kāi)始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會(huì)。

【操作野消毒】

無(wú)菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作臺(tái)面消毒時(shí)切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時(shí)照射紫外線，消毒時(shí)工作臺(tái)面上用品不要過(guò)多或重疊放置，否則會(huì)遮擋射線降低消毒效果?！┎僮饔镁呷缫埔浩?、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線消毒。

【洗手和著裝】

原則上和外科手術(shù)相同。平時(shí)僅做觀察不做培養(yǎng)操作時(shí)，可穿著細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射30min的清潔工作服。在利用超凈臺(tái)工作時(shí)，因整個(gè)前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著長(zhǎng)袖的清潔工作服，并于開(kāi)始操作前要用75％酒精消毒手。如果實(shí)驗(yàn)過(guò)程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。

五、培養(yǎng)細(xì)胞的觀察１．肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度２．倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)六、細(xì)胞計(jì)數(shù)培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長(zhǎng)良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞Coulter計(jì)數(shù)儀：人工計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)：

1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。

2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。

3、靜置3分鐘。

4、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：

細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/4×10000

注意：鏡下偶見(jiàn)由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說(shuō)明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。

根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，傳代方法有3種：1．懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。2．半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。3．貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。七、細(xì)胞傳代方法貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法：1吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液2加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)）靜置2-10min（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)）。3吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。4用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。5離心，細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)液制成懸液。5吸取1/10—1/40細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。6加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。7將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。任何培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過(guò)程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。八、培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定1．臺(tái)盼藍(lán)法活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色；用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力；方法：

1、將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中；

2、加入0.5ml0.4%臺(tái)盼蘭染液，染色2一3分鐘；

3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片；

4、鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)細(xì)胞活力；

死細(xì)胞能被臺(tái)盼蘭染上色，鏡下可見(jiàn)深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無(wú)色透明狀。

活力測(cè)定可以和細(xì)胞計(jì)數(shù)合起來(lái)進(jìn)行，但要考慮到染液對(duì)原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。

2．四唑鹽（MTT）比色法

四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)；MTT比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值；MTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。操作步驟：

（1）單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；103-104細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200微升（96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升），37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時(shí)間）；（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)；（3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150微升／孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解；（4）酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值（檢測(cè)波長(zhǎng)570納米）。記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。九、細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。

凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融

當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶很大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序：

當(dāng)溫度在-25℃以上時(shí)，1～2℃/min

當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，5～10℃/min

當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí)，可迅速放入液氮中簡(jiǎn)易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過(guò)線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投入液氮中。細(xì)胞凍存方法1．預(yù)先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基，10%DMSO，DMSO液用培養(yǎng)液配好，避免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞；2．取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉?用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1×106～5×106細(xì)胞/ml)；3．加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。十、細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測(cè)細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌和病毒。無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等是主要的污染源。嚴(yán)格之無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。細(xì)菌和真菌的污染和檢測(cè)肉眼直接觀察法培養(yǎng)檢查法顯微鏡觀察法支原體的污染和檢測(cè)造成支原體高污染率的原因：

1.支原體大小0.1－0.8um，無(wú)細(xì)胞壁，可透過(guò)一般過(guò)濾膜（0.22-0.45um）；

2.支原體污染時(shí)，沒(méi)有明顯的肉眼或一般光學(xué)顯微鏡可觀察到的特征變化；

3.過(guò)去缺乏簡(jiǎn)單、快速且可靠的檢測(cè)方式；

4.細(xì)胞流通間缺乏物品管理，造成實(shí)驗(yàn)室間的相互污染；

5.研究或操作人員忽略污染問(wèn)題；

6.已受污染的細(xì)胞；

7.已受污染的培養(yǎng)基、血清。支原體之檢測(cè)：

相差顯微鏡觀察法Hayflick培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法原理：直接培養(yǎng)支原體于培養(yǎng)基中，觀察其生長(zhǎng)及菌落生成。

特點(diǎn)：是目前最直接與靈敏之步驟，亦是用來(lái)評(píng)估其它偵測(cè)新步驟之標(biāo)準(zhǔn)步驟。

缺點(diǎn)：培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，須3－5星期才能判斷。有些支原體不能在培養(yǎng)基培養(yǎng)出來(lái)(例如M.hyorhinis)。需同時(shí)培養(yǎng)支原體株作為正反應(yīng)對(duì)照組，可能會(huì)造成污染。

DNA熒光染色法

原理︰利用熒光染劑（bisbenzimide,Hoechst33258）檢測(cè)支原體污染。此染劑會(huì)結(jié)合到DNA之富含A-T區(qū)域，因?yàn)橹гw之DNA中A-T含量占多數(shù)（55～80%），所以可將其染色而檢測(cè)。被支原體污染之細(xì)胞經(jīng)染色后，在細(xì)胞核外與細(xì)胞周圍可看到許多大小均一之熒光小點(diǎn)，即為支原體