趨磁細菌磁小體及磁小體形成蛋白的應(yīng)用

..>趨磁細菌磁小體與磁小體形成蛋白的應(yīng)用魏靜怡生命科學(xué)學(xué)院1400012136摘要：趨磁細菌的磁小體因其優(yōu)良的性質(zhì)，具有很大的合成和應(yīng)用價值。本文在介紹趨磁細菌和磁小體形成的根底上,重點研究磁小體和類磁小體納米顆粒的合成。由于趨磁細菌直接培養(yǎng)與合成磁小體的障礙頗多，所以文章轉(zhuǎn)向研究磁小體合成相關(guān)的蛋白研究，并重點考察了Mms6蛋白，對其在體外的礦化作用與合成的單分散納米磁顆粒〔MNP〕的性質(zhì)進展了探索。此外，文章還研究了Mms6蛋白合成MNP的方法，確定了較優(yōu)的反響條件，具有良好的前景。關(guān)鍵詞：趨磁細菌磁小體Mms6MNP1．趨磁細菌與磁小體1.1趨磁細菌趨磁細菌〔magnetotacticbacteria，MTB〕是一類胞內(nèi)含有可感應(yīng)磁場的磁小體，在鞭毛的輔助下可沿磁場運動的革蘭氏陰性細菌。這類微生物分布很廣，常見于氧化復(fù)原過渡界面附近，在酸性環(huán)境、海底、熱泉等特殊環(huán)境也有發(fā)現(xiàn)。系統(tǒng)發(fā)育分析說明，這類菌主要屬于Proteobacteria門的α、γ、δ亞屬。自養(yǎng)菌可以通過氧化鐵等無機物獲得能量，異養(yǎng)菌可以從酒石酸等有機酸中獲得能量。1.2磁小體的性質(zhì)磁小體〔magnetosome，MS〕是指趨磁細菌細胞內(nèi)生成的由膜包圍的磁性顆粒。每個趨磁細菌細胞內(nèi)可包含有1條至多條磁小體鏈,位置靠近細胞壁,一般沿細胞的長軸方向分布。磁小體大小一般35-120nm、強磁性、由生物膜包被、具有單磁疇、呈有序鏈狀排列于胞內(nèi)。磁小體主要成分是Fe3O4〔magnetite〕或Fe3S4〔greigite〕，形態(tài)有八面體、立方體、棱柱體、球狀體、牙齒狀和子彈狀等。1.3磁小體的優(yōu)點與應(yīng)用磁小體與一般人造磁性納米顆粒相比有許多優(yōu)點：〔1〕有生物膜包被，且處于超順磁性范圍，不易聚集，具有良好的分散性；〔2〕磁小體膜上帶有大量生物活性基團，可用于與其他分子的共價連接，且連接其他分子后可方便地通過外加磁場別離純化；〔3〕載藥磁小體在體內(nèi)通過降解磁小體外膜的方式即可實現(xiàn)藥物的釋放；〔4〕生物來源使其具有良好的生物相容性和平安性。所以，磁小體在多個領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價值。如細胞別離、核酸提取與別離、核酸特異識別、磁介導(dǎo)熱療、藥物靶向傳送、生物分子載體、磁性探針、醫(yī)學(xué)成像和環(huán)境重金屬處理等領(lǐng)域。尤其值得注意的是磁小體在信息存儲中的應(yīng)用——因為磁小體具有超微性〔納米級〕均勻性和無毒性，可生產(chǎn)品位高的磁性生物材料，可以進展高清晰、高保真的大容量超高密度磁記錄材料的開發(fā)。2.趨磁細菌合成磁小體的研究與主要障礙磁小體具有極高的應(yīng)用價值，故而利用趨磁細菌直接合成磁小體是一個自然的想法。事實上，有不少研究者已進展了趨磁細菌性質(zhì)的探索與應(yīng)用〔如表1〕。但是很少有大規(guī)模生產(chǎn)和商業(yè)化應(yīng)用的實例。這主要由以下原因造成：生長條件苛刻由于趨磁細菌主要在氧化復(fù)原過渡界面附近，所以它們的生長需要特殊的氧化物與復(fù)原性物質(zhì)的濃度梯度。大多數(shù)趨磁細菌是厭氧的，少數(shù)趨磁細菌能在較低的氧氣濃度〔10%-12%〕條件下生存，但氧氣濃度太高或太低都會影響其生存，為實驗室大量培養(yǎng)造成了困難。磁小體的合成影響因素較多研究說明，營養(yǎng)物質(zhì)〔鐵離子濃度，碳含量〕和氧氣濃度都會影響磁小體的產(chǎn)量，甚至是磁小體的大小。這就為大規(guī)模統(tǒng)一生產(chǎn)磁小體造成了很大障礙。生物平安使用細菌進展磁小體生產(chǎn)并從其體內(nèi)提取磁小體，可能攜帶有生物膜，蛋白質(zhì)，核酸等污染，這在醫(yī)藥中可能引起很大問題。表1、趨磁細菌相關(guān)研究成果直接利用趨磁細菌合成磁小體受到阻礙時，下一步就是研究磁小體合成中相關(guān)基因，試圖找到重要的可以在其它工程菌中表達的基因，進展大規(guī)模生產(chǎn)。3．磁小體合成與Mms6蛋白3.1磁小體的合成與相關(guān)基因趨磁細菌基因組上有一段特殊的區(qū)域—"磁小體島〞，該基因島與磁小體的合成密切相關(guān)，負責(zé)細胞質(zhì)膜內(nèi)陷成為磁小體囊泡、磁小體蛋白的定位、磁小體排列成鏈、磁鐵礦的生物礦化等步驟，每個步驟分別有獨立的基因控制。研究說明，MagA有助于趨磁細菌從外界環(huán)境中吸收鐵，膜蛋白MamB，MamQ，MamI和MamL在細胞質(zhì)膜內(nèi)陷成為磁小體囊泡的過程中發(fā)揮作用，磁小體可以沿著MamK蛋白所形成的纖維構(gòu)造在胞內(nèi)排列成鏈，酸性蛋白MamJ可以控制磁小體鏈的形成。另外，還有一種礦化蛋白Mms6，可以輔助磁小體形成與形態(tài)調(diào)控。該蛋白在近年來研究很廣，以下具體分析Mms6蛋白性質(zhì)與應(yīng)用。3.2Mms6蛋白Mms6蛋白是磁小體形成中起重要作用的蛋白。最先在趨磁螺菌MagnetospirillummagneticumAMB-1中被發(fā)現(xiàn)，并能與AMB-1體內(nèi)的立方八面體MNP嚴密結(jié)合。Mms6的N端疏水，可能與磁小體的脂膜結(jié)合有關(guān)；其C端可能與鐵離子，磁小體前體或形成過程中的晶體外表結(jié)合〔羧基的酸性〕，從而輔助了體內(nèi)MNP立方八面體性態(tài)的形成。3.3Mms6蛋白在體外的礦化作用Arakaki【2】等人發(fā)現(xiàn)Mms6在體外同樣可以輔助立方磁顆粒的形成，且這種體外形成的磁鐵礦呈現(xiàn)出立方八面體的晶體形態(tài)，晶體顆粒尺寸均勻，超順磁性，與AMB-1中的磁小體非常相似，該發(fā)現(xiàn)就引發(fā)了后續(xù)對Mms6合成類磁小體的單分散納米磁顆?！睲NP〕的研究。4.Mms6蛋白體外合成單分散納米磁顆粒〔MNP〕4.1Mms6蛋白體外合成MNP的性質(zhì)TanyaProzorov【3】等研究者對Mms6在體外的礦化作用做了比照驗證。通過將Mms6，鐵結(jié)合蛋白，脂籠蛋白Lcn2和BSA放入Fe〔III〕和Fe〔II〕1：2的溶液，在室溫下進展共沉淀實驗(RTCP)，可以觀察到Mms6礦化效果的明顯優(yōu)勢——納米顆粒形態(tài)規(guī)則，統(tǒng)一，大小適宜〔30nm〕(圖1B.)。而其他鐵結(jié)合蛋白形成的納米顆粒形態(tài)不一且大小偏小?！矆D1〕圖1.TEMimagesofmagnetitenanoparticlesobtainedbyco-precipitationofFeCl2andFeCl3:A)withoutprotein,B)withMms6,C)withferritin(Notethatca5nmirono*idenanoparticlesseenasdarkersmalldotsappearembeddedinsurroundingglobularbodies,mostlikelyprotein),D)withLnc2,andE)withBSA此外，Mms6合成的MNP還具有良好的磁學(xué)性質(zhì)。比較不同鐵結(jié)合蛋白形成的納米顆粒的磁滯回線，可得Mms6合成的MNP的優(yōu)勢：易磁化，易退磁由Mms6合成的納米磁顆粒磁滯回線狹長，包圍面積小，磁滯損耗小，矯頑力小，說明其易磁化，退磁。(2)超順磁性由Mms6合成的納米磁顆粒在較低磁場時較快到達飽和，說明其磁矩較大，呈現(xiàn)強磁性。在阻隔溫度TB之上，磁滯現(xiàn)象幾乎消失，曲線都符合Langevin方程,說明其在阻隔溫度TB之上的超順磁性。〔圖2〕22所以，Mms6在體外合成MNP的可行性與優(yōu)越性已被證明。4.2Mms6在體外合成MNP的方法研究在TanyaProzorov的研究中，磁納米顆粒分散在溶液中，收集和應(yīng)用有一定困難。而現(xiàn)今科技〔尤其是高通量的數(shù)據(jù)存儲〕急需的是能結(jié)合在固定相上的單分散的MNP。所以，在2012年JohannaMGalloway等人對Mms6在體外合成納米磁顆粒的實驗方法進展了研究與優(yōu)化，完成了對Mms6表達，固定，與礦化這一系列的操作。Mms6表達與純化在2007年，TanyaProzorov等研究者已經(jīng)成功表達與提取了Mms6蛋白。他們通過選用AMB-1趨磁細菌，設(shè)計Mms6基因編碼區(qū)的引物，用PCR法成功克隆出Mms6基因。將基因轉(zhuǎn)入pTrcHisTOPO質(zhì)粒，〔在Mms6的N端加上多組氨酸標簽〕并選用大腸桿菌作為載體，成功表達并提取了His-taggedMms6。〔相關(guān)序列如圖3〕圖3、Mms6重組蛋白序列與堿基序列JohannaMGalloway等人在此根底上進展了優(yōu)化。為了提高產(chǎn)率，研究者在蛋白后參加了N端麥芽糖結(jié)合蛋白〔MBP〕，以提高重組蛋白的溶解度。His-tag也被插入N端，使得提純更為方便。〔用固定化金屬離子親和層析(IMAC)進展提純〕。在Mms6序列和N端還參加了一個蛋白酶切位點，使得在參加His6-TEV蛋白酶的情況下可以切去Mms6后的His8-MBPtag?！矆D4〕圖4、Mms6重組蛋白構(gòu)建(2)固定相的構(gòu)建與Mms6蛋白附著研究人員使用了自組裝單分子層(SAM)進展操作，具體而言，在金外表加上烷硫醇構(gòu)建SAM。實驗使用了兩種SAM，分別為四乙二醇烷基硫醇〔PEG〕和一端含羧基的烷硫醇〔PEG-COOH〕，PEG主要解決生物污損問題，即抵抗蛋白的結(jié)合；而PEG-COOH在碳化亞胺〔EDC〕和N-羥基琥珀酰亞胺〔NHS〕存在的條件下可以形成酯鍵，能與蛋白的N端高效連接。所以，在參加Mms6后，即可進展蛋白的固定相附著。〔如圖5〕(注：圖5中聚二甲硅氧烷〔PDMS〕主要作為stamp起隔絕作用，與PEG一起構(gòu)建SAM的pattern)圖5、SAM固定相的構(gòu)建與蛋白附著〔3〕Mms6礦化方法回憶2007年已使用的RTCP法，發(fā)現(xiàn)MNP難以結(jié)合在固定相上，這主要由于溶液中存在可移動的Mms6，在溫和條件下一旦滴入堿性液體，可以很快催化礦化反響，在液相外表就形成MNP，而在底部的固定相與堿性液體接觸較晚，礦化效果不佳。所以研究者研究了氫氧化物法POFHK。該方法先用氫氧化鉀對鐵的氫氧化物進展了局部氧化，再利用Mms6進展礦化，原理圖如圖6。圖6、POFHK原理圖該方法的特點是氫氧化物反響較慢，且需加熱，所以在反響過程中所有反響物都能進展充分混合和反響，這使得在固定相上的Mms6蛋白能與反響物充分反響，控制一定實驗條件，可到達較好的礦化效果。(圖7)圖7、POFHK法Mms6礦化效果圖在不同實驗條件下操作，得到圖8所示各圖，可見圖8〔a〕效果最正確，對應(yīng)條件為80°C，2小時，試劑：共10mL:50mMFeSO4,40μL50-60%N2H4,200mL26%NH4OH,100mMKNO3。圖8、不同方法下Mms6礦化效果圖通過研究，使用生物方法〔Mms6蛋白〕進展固定相上納米顆粒MNP的合成已有了較為完善的方案。4.3Mms6蛋白合成MNP的優(yōu)缺點(1)優(yōu)點：相比化學(xué)方法〔如己烷，甲苯，氯仿，290°C反響〕在試劑上更易獲得，且生物方法可以持續(xù)生產(chǎn)。反響條件上相對溫和〔80°C〕(2)缺點：實驗試劑的用量〔比例〕需嚴風(fēng)格控，且仍有一些MNP附著在了PEG上(PEG應(yīng)該是防止附著的)，使得形成的pattern并不很理想。5、展望與設(shè)想第一，從目前得到的研究成果看，關(guān)于趨磁細菌的研究還存在著巨大的挑戰(zhàn)，尤其是趨磁細菌的培養(yǎng)和利用，還亟待進一步研究。下一步的研究重點應(yīng)是篩選較易培養(yǎng)的趨磁細菌并對其培養(yǎng)條件進展優(yōu)化?？梢酝ㄟ^研究趨磁菌原始生活環(huán)境的理化參數(shù)來進展實驗室模擬培養(yǎng)或通過對其原始生境的改良以開展固體平板培養(yǎng)獲得單菌落，尤其可以改造現(xiàn)已研究較多的MSR-1、AMB-1等大規(guī)模培養(yǎng)和生產(chǎn)磁小體。第二，可以考慮將趨磁細菌磁小體合成的相關(guān)基因〔磁小體島〕轉(zhuǎn)入其他工程菌〔如大腸桿菌〕，進展磁小體的大規(guī)模生產(chǎn)。不過磁小體合成的相關(guān)基因研究尚不完全，整個基因島的異源表達也未有研究，進展較為緩慢。第三，可以考慮重點利用Mms6蛋白合成類似磁小體的MNP，而且該方面已有較為深入的研究。Mms6蛋白的表達與體外礦化方法已較為成熟，且表達出生物方法的獨特優(yōu)勢。不過Mms6礦化還需在實驗條件上做進一步優(yōu)化，相信利用趨磁細菌磁小體合成的Mms6蛋白進展MNP合成前景光明。參考文獻1、MagnetotacticBacteria:PerformancesandChallengesAbhilashaSinghMathuriya,KratikaYadav&B.D.KaushikGeomicrobiologyJournal(2015)32,780–7882、ANovelProteinTightlyBoundtoBacterialMagneticParticlesinMagnetospirillummagneticumStrainAMB-1,A.Arakaki,J.Webb,T.Matsunaga,J.Biol.Chem.,278(2003)8745-8750.3、Protein-MediatedSynthesisofUniformSuperparamagneticMagnetiteNanocrystals，TanyaProzorov,SuryaK.Mallapragada,Adv.Funct.Mater.2007,17,951–9574、NanomagneticArraysFormedWiththeBiomineralizationProteinMms6,Gavin