酶工程復習資料p

第一章緒論1．酶：是具有生物催化功能的生物大分子，分為蛋白類酶和核酸類酶兩大類別。酶的生產：是指通過各種方法獲得人們所需的酶的技術過程，重要涉及微生物發(fā)酵產酶、動植物培養(yǎng)產酶和酶的提取與分離純化等。酶的改性：是通過各種方法改善酶的催化特性的技術過程，重要涉及酶分子修飾、酶的固定化、酶非水相催化和定向進化。酶的應用：是通過酶的催化作用獲得人們所需的物質或者除去不良物質的技術過程，重要涉及酶反映器的選擇與設計以及酶在各個領域的應用等2．酶催化的作用特點：專一性強、催化效率高和作用條件溫和等。酶的催化作用受到底物濃度、酶濃度、溫度、pH值、激活劑濃度、克制劑濃度等諸多因素的影響。在酶的應用過程中，必須控制好各種環(huán)境條件，以充足發(fā)揮酶的催化功能。3．米氏方程：V=VmS/Km+S,Km為米氏常數，是酶催化反映速度等于最大反映速度一半時的底物濃度?？酥苿┑挠绊懀河锌赡婵酥苿┖筒豢赡婵酥苿┲帧２豢赡婵酥苿┡c酶分子結合后，克制劑難于除去，酶活性不能恢復。可逆克制劑與酶的結合是可逆的，只要將克制劑除去，酶酶活力即可恢復?？赡嫘钥酥谱饔每梢苑譃楦偁幮钥酥?、非競爭性克制和反競爭性克制三種。=1\*GB3①競爭性克制：是指克制劑和底物競爭與酶分子結合而引起的克制作用?？酥频男Ч麖娙跖c競爭性克制劑的濃度、底物濃度以及克制劑和底物與酶的親和力大小有關，隨著底物濃度增長，酶的克制作用減弱。特點：酶催化反映的最大反映速率Vm不變，米氏常數Km增大。=2\*GB3②非競爭性克制：是指克制劑與底物分別于酶分子上的不同位點結合而引起酶活性減少的克制作用。特點：最大反映速度Vm減少，米氏常數Km不變。=3\*GB3③反競爭性克制：在底物與酶分子結合生成中間復合物后，克制劑再與中間復合物結合而引起的克制作用稱為反競爭性克制。特點：最大反映速度Vm和米氏常數Km同時減少。4．酶的活力測定酶活力：是指在一定條件下，酶所催化的反映初速度。在外界條件相同的情況下，反映速度越大，意味著酶活力越高。酶活力測定過程：反映體系選擇、反映條件擬定、反映物檢測、酶活力計算、偶聯(lián)酶反映活力測定酶活力單位：在特定條件下（溫度可采用25℃或其它選用的溫度，pH等條件均采用最適條件），每1min催化1μmol的底物轉化為產物的酶量定義為1個酶活力單位。這個單位稱為國際單位。酶的轉換數：是指每個酶分子每分鐘催化底物轉化的分子數，即每摩爾酶每分鐘催化底物轉化為產物的摩爾數。酶的生產方法：提出分離法、生物合成法、化學合成法微生物發(fā)酵產酶酶的發(fā)酵生產：通過預先設計，通過人工操作，運用微生物的生命活動獲得所需的酶的技術過程，稱為酶的發(fā)酵生產。產酶微生物的特點：=1\*GB3①酶的產量高；=2\*GB3②產酶穩(wěn)定性好；=3\*GB3③容易培養(yǎng)和管理；=4\*GB3④利于酶的分離純化；=5\*GB3⑤安全可靠、無毒性。酶的發(fā)酵生產方式：固體培養(yǎng)發(fā)酵、液體深層發(fā)酵、固定化微生物細胞發(fā)酵和固定化微生物原生質體發(fā)酵。酶發(fā)酵動力學：是研究發(fā)酵過程中細胞生長效率、產物生成效率、基質消耗速率以及環(huán)境因素對這些速率的影響規(guī)律的學科。一、細胞生長動力學在分批培養(yǎng)過程中，細胞生長一般要經歷延遲期、指數生長期、減速期、靜止期和衰亡期5個階段。1950年，法國莫諾德一方面提出了表述微生物細胞生長的動力學，他認為，在培養(yǎng)過程中，細胞生長速率與細胞濃度成正比。營養(yǎng)物濃度（生長限制基質濃度）和生長速率之間的動力學關系：Monod模型μ:比生長速率（1/h）（specificgrowthrate）μmax：最大比生長速率（1/h）S：營養(yǎng)物濃度（生長限制基質濃度）克/LKs：莫諾德常數或飽和常數或營養(yǎng)物運用常數克/L，或mol/L二、產酶動力學（一）酶生物合成的模式根據酶的合成與細胞生長之間的關系，可將酶的生物合成分為4種模式，即：同步合成型、中期合成型、延續(xù)合成型、滯后合成型1.同步合成型：酶的生物合成與細胞生長同步。特點：酶的合成可以誘導，但不受分解代謝物阻遏和反映產物阻遏。當去除誘導物、細胞進入平衡期后，酶的合成立即停止，表白這類酶所相應的mRNA很不穩(wěn)定。2．中期合成型：酶的合成在細胞生長一段時間后才開始，而在細胞生長進入平衡期以后，酶的合成也隨著停止。特點：酶的合成受產物的反饋阻遏或分解代謝物阻遏。所相應的mRNA是不穩(wěn)定的。3．延續(xù)合成型：酶的合成在細胞的生長階段開始，在細胞生長進入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成較長一段時間。特點：可受誘導，一般不受分解代謝物和產物阻遏。所相應的mRNA相稱穩(wěn)定。3.滯后合成型：只有當細胞生長進入平衡期以后，酶才開始合成并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。特點：受分解代謝物的阻遏作用。所相應的mRNA穩(wěn)定性高。酶生產中最抱負的合成模式：延續(xù)合成型：發(fā)酵過程中沒有生長期和產酶期的明顯差別。細胞開始生長就有酶的產生，直至細胞生長進入平衡期后，酶還可以繼續(xù)生成一段時間。同步合成型：提高相應的mRNA的穩(wěn)定性，如減少發(fā)酵溫度。滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使酶的合成提早開始。中期合成型：要在提高mRNA穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方面努力。酶的發(fā)酵工藝條件與控制：1、培養(yǎng)基培養(yǎng)基的基本成分五大要素：碳源、氮源、無機鹽、生長因子、水2、發(fā)酵條件及控制：pH值的控制：培養(yǎng)基的pH必須控制在一定的范圍內，以滿足不同類型微生物的生長繁殖或產生代謝產物。為了維持培養(yǎng)基pH的相對恒定，通常在培養(yǎng)基中加入pH緩沖劑，或在進行工業(yè)發(fā)酵時補加酸、堿。通常培養(yǎng)條件：細菌與放線菌：pH7~7.5酵母菌和霉菌：pH4.5~6范圍內生長細胞發(fā)酵產酶的最適pH值與生長最適pH值往往有所不同。細胞生產某種酶的最適pH值通常接近于該酶催化反映的最適pH值。溫度的控制：通常在生物學范圍內每升高10℃，生長速度就加快一倍，所以溫度直接影響酶反映，對于微生物來說，溫度直接影響其生長和合成酶。有些細胞發(fā)酵產酶的最適溫度與細胞生長最適溫度有所不同，并且往往低于生長最適溫度。這是由于在較低的溫度條件下，可以提高酶所相應的mRNA的穩(wěn)定性，增長酶生物合成的延續(xù)時間，從而提高酶的產量。溶解氧的控制溶解氧：是指溶解在培養(yǎng)基中的氧氣。在酶的發(fā)酵生產過程中，處在不同生長階段的細胞，其細胞濃度和細胞呼吸強度各不相同，致使耗氧速率有很大的差別。因此必須根據耗氧量的不同，不斷供應適量的溶解氧。培養(yǎng)液中溶解氧的量，決定于在一定條件下氧氣的溶解速度。溶氧速率與通氣量、氧氣分壓、氣液接觸時間、氣液接觸面積以及培養(yǎng)液的性質等有密切關系。一般說來，通氣量越大、氧氣分壓越高、氣液接觸時間越長、氣液接觸面積越大，則溶氧速率越大。培養(yǎng)液的性質，重要是黏度、氣泡、以及溫度等對于溶氧速率有明顯影響?？刂迫芙庋醴椒ǎ赫{節(jié)通氣量、調節(jié)氧的分壓、調節(jié)氣液接觸時間、調節(jié)氣液接觸面積、改變培養(yǎng)液的性質3、提高產酶的措施（1）添加誘導物對于誘導酶的發(fā)酵生產，在發(fā)酵過程中的某個適宜的時機，添加適宜的誘導物，可以顯著提高酶的產量。例如，乳糖誘導β-半乳糖苷酶，纖維二糖誘導纖維素酶，蔗糖甘油單棕櫚酸誘導蔗糖酶的生物合成等。誘導物一般可以分為3類：酶的作用底物、酶的催化反映產物、作用底物的類似物（2）控制阻遏物的濃度阻遏作用根據機理不同，可分為：產物阻遏和分解代謝物阻遏兩種。1.產物阻遏作用是由酶催化作用的產物或者代謝途徑的末端產物引起的阻遏作用。2.分解代謝物阻遏作用是由分解代謝物（葡萄糖等和其它容易運用的碳源等物質通過度解代謝而產生的物質）引起的阻遏作用?？刂谱瓒粑锏臐舛仁墙獬瓒?、提高酶產量的有效措施。為了減少或者解除分解代謝物阻遏作用，應當控制培養(yǎng)基中葡萄糖等容易運用的碳源的濃度。采用其他較難運用的碳源，如淀粉等采用補料、分次流加碳源添加一定量的環(huán)腺苷酸（cAMP）對于受代謝途徑末端產物阻遏的酶，可以通過控制末端產物的濃度的方法使阻遏解除。（3）添加表面活性劑表面活性劑可以與細胞膜互相作用，增長細胞的透過性，有助于胞外酶的分泌，從而提高酶的產量。將適量的非離子型表面活性劑，如吐溫（Tween）、特里頓(Triton)等添加到培養(yǎng)基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的產量增長。由于離子型表面活性劑對細胞有毒害作用，特別是季胺型表面活性劑是消毒劑，對細胞的毒性較大，不能在酶的發(fā)酵生產中添加到培養(yǎng)基中。（4）添加產酶促進劑產酶促進劑是指可以促進產酶、但是作用機理未闡明清楚的物質。例如，添加一定量的植酸鈣鎂，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的產量提高1～20倍；添加聚乙烯醇可以提高糖化酶的產量。產酶促進劑對不同細胞、不同酶的作用效果各不相同，現(xiàn)在還沒有規(guī)律可循，要通過實驗擬定所添加的產酶促進劑的種類和濃度。第四章酶的提取與分離純化酶的提取與分離純化：是指將酶從細胞或其他含酶原料中提取出來，再與雜質分開，而獲得所規(guī)定的酶制品的技術過程，重要涉及細胞破碎、提取、離心分離等等。 細胞破碎：是指通過各種方法使細胞外層結構破壞的技術過程。細胞破碎方法與其原理分類細胞破碎方法細胞破碎原理機械破碎法搗碎法通過機械運動產生的剪切力，使組織、細胞研磨法破碎勻漿法物理破碎法溫度差破碎法 通過各種物理因素的作用，使組織、細胞壓力查破碎法 的外層結構破壞，從而使細胞破碎超聲波破碎法化學破碎法添加有機溶劑通過各種化學試劑對細胞膜的作用，從而使添加表面活性劑細胞破碎酶促破碎法自溶法通過細胞自身的酶系或外加酶制劑的催化外加酶制劑法作用，使外層結構受到破壞，從而使細胞 破碎酶的提?。菏侵冈谝欢ǖ臈l件下，用適當的溶劑或溶液解決含酶原料，使酶充足溶解到溶劑或溶液中的過程，也稱為酶的抽提。酶提取時一方面應根據酶的結構和溶解性質，選擇適當的溶劑。一般說來，極性物質易溶于極性溶劑中，非極性物質易溶于非極性的有機溶劑中，酸性物質易溶于堿性溶劑中，堿性物質易溶于酸性溶劑中。酶的重要提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對象鹽溶液提取0.02～0.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取PH8～12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機溶劑提取可與水混溶的有機溶劑用于提取那些與脂質結合牢固或具有較多非極性基團的酶

從細胞、細胞碎片或其他含酶原料中提取酶的過程受到擴散作用的影響。提高溫度，減少溶液粘度、增長擴散面積、縮短擴散距離，增大濃度差等都有助于提高酶分子的擴散速度，從而增大提取效果。為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中還要注意控制好溫度、pH值等提取條件。酶的分離方法沉淀分離：是通過改變某些條件或添加某種物質，使酶的溶解度減少，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質分離的技術過程。沉淀分離的方法沉淀分離方法分離原理鹽析沉淀法運用不同蛋白質在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質分離等電點沉淀法運用兩性電解質在等電點時溶解度最低，以及不同的兩性電解質有不同的等電點這一特性，通過調節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質沉淀析出，從而使酶與雜質分離有機溶劑沉淀法運用酶與其它雜質在有機溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機溶劑，使酶或雜質沉淀析出，從而使酶與雜質分離復合沉淀法在酶液中加入某些物質，使它與酶形成復合物而沉淀下來，從而使酶與雜質分離選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質分離2．離心分離：是借助于離心機旋轉所產生的離心力，使不同大小、不同密度的物質分離的技術過程。在離心分離時，要根據欲分離物質以及雜質的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當的離心機、離心方法和離心條件。離心機重要分為常速（低速）離心機、高速離心機和超速離心機。常速離心機又稱為低速離心機,其最大轉速在8000r/min以內，相對離心力（RCF）在1×104g以下，在酶的分離純化過程中，重要用于細胞、細胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等固形物的分離。也用于酶的結晶等較大顆粒的分離。高速離心機的最大轉速為（1～2.5）×104r/min，相對離心力達成1×104～1×105g，在酶的分離中重要用于沉淀、細胞碎片和細胞器等的分離。為了防止高速離心過程中,溫度升高而導致酶的變性失活,有些高速離心機裝設有冷凍裝置,謂之高速冷凍離心機。超速離心機的最大轉速達(2.5～12)×104r/min，相對離心力可以高達5×105g甚至更高。超速離心重要用于DNA、RNA、蛋白質等生物大分子以及細胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測；沉降系數和相對分子質量的測定等。離心條件的擬定：根據需要選擇的離心力、離心時間及離心介質的PH值和溫度等條件。3過濾與膜分離過濾：是借助于過濾介質將不同大小、不同形狀的物質分離的技術過程。過濾介質多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結金屬和各種高分子膜等，可以根據需要選用。過濾的分類及其特性(根據過濾介質截留的物質顆粒大小不同)類別截留顆粒大小截留的重要物質過濾介質粗濾>2μm酵母、霉菌、動物細胞、植物細胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結金屬等微濾0.2～2μm細菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20?～0.2μm病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<20?生物小分子、鹽、離子反滲透膜膜分離：離借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質顆?；蚍肿舆M行分離的技術稱為膜分技術。膜分離所使用的薄膜重要是由丙烯腈、醋酸纖維素、賽璐玢以及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。有時也可以采用動物膜等。膜分離過程中，薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質顆?；蚍肿油ㄟ^，而把大于其孔徑的顆粒截留。膜的孔徑有多種規(guī)格可供使用時選擇。四種常用膜分離技術的基本特性膜技術膜技術截留物尺寸nm（分子量）推動力分離機理微濾MF>20(>40,000)壓力差，>100kPa篩分超濾UF1～20(10,000--40,000)壓力差，>100kPa篩分納濾NF>1(100～1000)壓力差，<1000kPa優(yōu)先吸附、表面電位反滲透RO(>100)壓力差，>1000kPa優(yōu)先吸附、溶解擴散超濾要細看（書本P101）4．層析分離層析分離：是運用混合物中各組分的物理化學性質的差別，使各組分以不同限度分布在兩個相中，其中一個相為固定的(稱為固定相)，另一個相則流過此固定相(稱為流動相)并使各組分以不同速度移動，從而達成分離。層析分離方法層析方法分離原理吸附層析運用吸附劑對不同物質的吸附力不同而使混合物中各組分分離分派層析運用各組分在兩相中的分派系數不同，而使各組分分離離子互換層析運用離子互換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達成分離目的凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，運用流動相中所含各種組分的相對分子質量不同而達成物質分離親和層析運用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質的等電點特性與離子互換層析的特性結合在一起，實現(xiàn)組分分離（1）吸附層析是運用吸附劑對不同物質的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。吸附層析是各種層析技術中應用最早的技術。吸附劑來源豐富、價格低廉、可再生，吸附設備簡樸。操作過程：吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。層析時，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當樣品液所有進入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時，層析柱內不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。洗脫方法涉及溶劑洗脫法、置換洗脫法、前緣洗脫法。（2）分派層析分派系數是指一種溶質在兩種互不相溶的溶劑中溶解達成平衡時，該溶質在兩項溶劑中的濃度的比值。在層析條件擬定后，層析系數是一常數。在分派層析中，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為固定相，這種溶劑在層析過程中始終固定在多孔支持物上。另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相流動，稱為流動相。當某溶質在流動相的帶動流經固定相時，該溶質在兩相之間進行連續(xù)的動態(tài)分派。分派層析重要有紙上層析、分派薄層層析、分派氣相層析等方法。（3）離子層析離子互換層析是運用離子互換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達成分離目的的一種層析分離方法。離子互換劑是具有若干活性基團的不溶性高分子物質。通過在不溶性高分子物質（母體）上引入若干可解離基團（活性基團）而制成。按活性基團的性質不同，離子互換劑可以分為陽離子互換劑和陰離子互換劑。由于酶分子具有兩性性質，所以可用陽離子互換劑，也可用陰離子互換劑進行酶的分離純化。操作過程：涉及裝柱、上柱、洗脫、收集和互換劑再生等環(huán)節(jié)。具體看書本（P110）。（4）凝膠層析凝膠層析又稱為凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，運用流動相中所含各種組分的相對分子質量不同而達成物質分離的一種層析技術。原理：凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當具有各種組分的混合溶液流經凝膠層析柱時，大分子物質由于分子直徑大，不能進入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。較小的分子能進入凝膠的微孔內，不斷地進出于一個個顆粒的微孔內外，這就使小分子物質向下移動的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對分子質量由大到小的順序先后流出層析柱，而達成分離的目的。操作過程：涉及裝柱、上柱、洗脫等過程。（5）親和層析親和層析是運用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術。酶與底物,酶與競爭性克制劑,酶與輔助因子,抗原與抗體，酶RNA與互補的RNA分子或片段,RNA與互補的DNA分子或片段等之間，都是具有專一而又可逆親和力的生物分子對。故此,親和層析在酶的分離純化中有重要應用.親和層析種類：根據欲分離組分與配基的結合特性,親和層析可以分為：共價親和層析、疏水層析、金屬離子親和層析、免疫親和層析、染料親和層析、凝集素親和層析（6）電泳分離電泳：帶電粒子在電場中向著與其自身所帶電荷相反的電極移動的過程稱為電泳。方法：電泳方法按其使用的支持體的不同，可以分為：紙電泳、薄層電泳、薄膜電泳、凝膠電泳、自由電泳、等電聚焦電泳影響因素：顆粒在電場中的移動速度重要決定于其自身所帶的凈電荷量，同時受顆粒形狀和顆粒大小的影響。此外，還受到電場強度、溶液pH值、離子強度及支持體的特性等外界條件的影響。6、萃取分離萃取分離是運用物質在兩相中的溶解度不同而使其分離的技術。萃取分離中的兩相一般為互不相溶的兩個液相。有時也可采用其它流體。分類：按照兩相的組成不同，萃取可以分為：有機溶劑萃取、雙水相萃取、超臨界萃取、反膠束萃取雙水相萃?。哼\用溶質在兩個互不相溶的水相中的溶解度不同而達成分離。各種雙水相系統(tǒng)聚合物P聚合物Q或鹽聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基葡聚糖，葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖甲基纖維素羥甲基葡聚糖，葡聚糖乙基羥乙基纖維素葡聚糖羥丙基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸鎂，硫酸銨，硫酸鈉，甲酸鈉，酒石酸鉀鈉第五章酶分子修飾酶分子修飾：通過各種方法使酶分子的結構發(fā)生某些改變，從而改變酶的催化特性的技術過程稱為酶分子修飾。重要涉及金屬離子置換修飾、大分子結合修飾、側鏈基團修飾、肽鏈有限水解修飾、核苷酸鏈有限水解修飾、氨基酸置換修飾、核苷酸置換修飾和酶分子的物理修飾。酶分子修飾重要研究內容：1對酶分子的側鏈基團，特別是酶活性中心中的必需基團進行化學修飾，研究酶結構與功能的關系2通過對酶功能基團的修飾和水不溶性大分子的結合，改造酶性能，增長酶的穩(wěn)定性3通過對酶分子內或分子間的交聯(lián)，或與水不溶性載體的結合制成固定化酶，催化特定的反映4用化學方法合成新的有機催化劑，使其具有酶活性(模擬酶)5用分子生物學方法克隆酶或修飾酶基因以產生突變酶，或設計新基因合成自然界不存在的新酶(抗體酶)大分子結合修飾：采用水溶性大分子與酶的側鏈基團共價結合，使酶分子的空間構象發(fā)生改變，從而改變酶的催化特性的方法稱為大分子結合修飾。大分子結合修飾的重要過程：1．修飾劑的選擇大分子結合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子，要根據酶分子的結構和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。2．修飾劑的活化作為修飾劑使用的水溶性大分子具有的基團往往不能直接與酶分子的基團進行反映而結合在一起。在使用之前一般需要通過活化，活化基團才干在一定條件下與酶分子的某側鏈基團進行反映。3．修飾將帶有活化基團的大分子修飾劑與通過度離純化的酶液以一定的比例混合，在一定的溫度、PH等條件下反映一段時間，使活化基團與酶分子的某側鏈基團以共價鍵結合，對酶分子進行修飾。4．分離通過度離方法進行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾劑。大分子結合修飾的作用：提高酶的催化效率、增長酶的穩(wěn)定性、減少或消除酶的抗原性等。側鏈基團修飾：采用一定的方法（一般為化學法）使酶的側鏈基團發(fā)生改變，從而改變酶的催化特性的修飾方法稱為側鏈基團修飾。側鏈基團：組成蛋白質氨基酸殘基上的功能團及組成RNA的核苷酸殘基的功能團。重要有氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、咪唑基等等。側鏈基團修飾劑：采用的各種小分子化合物。20種不同氨基酸的側鏈基團中只有極性氨基酸的側鏈易被修飾，它們一般具有親核性。a各種氨基酸側鏈的修飾劑氨基酸側鏈基團修飾劑Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亞硝酸Asp、Glu羧基水溶性碳化二亞胺Arg胍基苯乙二醛，1,2－環(huán)己二酮、丁二酮Cys巰基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基馬來酰亞胺

二硫鍵巰基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羥基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亞胺物理修飾:通過各種方法使酶分子的空間構象發(fā)生某些改變，從而改變酶的催化特性的方法稱為酶分子的物理修飾。修飾特點：在于不改變酶的組成單位及其基團，酶分子中的共價鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排，使酶分子的空間構象發(fā)生某些改變。酶分子修飾的應用：在酶學研究的方面的應用：酶的活性中心研究、酶的空間結構研究、酶的作用機制研究。在醫(yī)學方面的應用：減少或者消除酶抗原性、增強醫(yī)藥用酶的穩(wěn)定性在工業(yè)方面的應用：提高工業(yè)用酶的催化效率、增強工業(yè)用酶的穩(wěn)定性、改變酶的動力學特性。在抗體酶研究開發(fā)方面的應用在核酸類酶人工改造方面的應用在有機介質酶催化反映中的應用酶、細胞、原生質體固定化固定化酶：是指固定在一定載體上并在一定的空間范圍內進行催化反映的酶，反映后的酶可以回收反復使用。固定化酶的優(yōu)缺陷：優(yōu)點：提高酶的催化效率、增長穩(wěn)定性、多次使用、可以裝塔連續(xù)反映、純化簡樸、提高產物質量、應用范圍廣缺陷：初次投入成本高、擴散限制，大分子底物較困難酶的固定化：采用各種方法，將酶固定在水不溶性的載體上，制備成固定化酶的過程稱為酶的固定化。方法：將酶和含酶菌體或菌體碎片固定化的方法重要涉及吸附法、包埋法、結合法、交聯(lián)法和熱解決法等。吸附法：運用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上，從而使酶固定化的方法叫做物理吸附法，簡稱吸附法。包埋法：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法。根據載體材料和方法的不同，可以分為凝膠包埋法和半透膜包埋法兩大類。結合法：選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子鍵與酶結合在一起的固定化方法稱為結合法。根據酶與載體結合的化學鍵不同，可分為離子鍵結合法和共價鍵結合法。離子鍵結合法：通過離子鍵使酶與載體結合的固定化方法。常用載體:DEAE-纖維素，DEAE-葡聚糖凝膠使用注意：pH、離子強度、溫度2．共價鍵結合法：通過共價鍵使酶與載體結合的固定化方法?？梢孕纬晒矁r鍵的基團：游離氨基、游離羧基、巰基、咪唑基、酚基、羥基、甲硫基、吲哚基、二硫鍵常用載體：天然高分子、人工合成的高聚物、無機載體要使載體與酶形成共價鍵，一方面必須使載體活化，即借助于某種方法，在載體上引進活潑基團，此活潑基團再與酶分子上的某一基團反映，形成共價鍵。載體活化的方法：A．重氮法、B．疊氮法、C．烷基化反映法、D．硅烷化法、E．溴化氰法（4）交聯(lián)法：借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網狀結構的固定化酶的方法稱為交聯(lián)法。也可用于含酶菌體或菌體碎片的固定化。（5）熱解決法：是將含酶細胞在一定溫度下加熱解決一段時間，使酶固定在菌體內，而制備得到固定化菌體的方法。 各類固定化方法的特點比較項目吸附法結合法交聯(lián)法包埋法

物理吸附共價鍵結合離子鍵結合

制備難易易難易較難較難固定化限度弱強中檔強強活力回收率較高低高中檔高載體再生也許不也許也許不也許不也許費用低高低中檔低底物專一性不變可變不變可變不變合用性酶源多較廣廣泛較廣小分子底物、藥用酶

固定化酶在工業(yè)生產上的應用1．葡萄糖異構酶——世界上生產規(guī)模最大的一種固定化酶。用吸附法、結合法、凝膠包埋法等進行固定化。葡萄糖異構酶葡萄糖--------------------果糖-------------果葡糖漿2．聚丙烯酰胺凝膠包埋具有延胡索酸酶的產氨短桿菌菌體，制得固定化延胡索酸酶。工業(yè)化生產L-蘋果酸3．運用固定化乳糖酶可以連續(xù)生產低乳糖奶固定化酵母細胞等微生物可用于生產各種酒類第七章酶非水相催化酶在非水介質中進行的催化作用稱為酶的非水相催化。酶非水相催化的幾種類型：有機介質中的酶催化——有機溶劑有機介質中的酶催化是指酶在具有一定量水的有機溶劑中進行的催化反映。合用于底物、產物兩者或其中之一為疏水性物質的酶催化作用。酶在有機介質中由于可以基本保持其完整的結構和活性中心的空間構象，所以可以發(fā)揮其催化功能。2．氣相介質中的酶催化——氣相介質酶在氣相介質中進行的催化反映。合用于底物是氣體或者可以轉化為氣體的物質的酶催化反映。由于氣體介質的密度低，擴散容易，因此酶在氣相中的催化作用與在水溶液中的催化作用有明顯的不同特點。3．超臨界介質中的酶催化——超臨界流體酶在超臨界流體中進行的催化反映。超臨界流體是指溫度和壓力超過某物質超臨界點的流體。離子液介質中的酶催化酶在離子液中進行的催化作用。離子液是由有機陽離子與有機（無機）陰離子構成的在室溫條件下呈液態(tài)的低熔點鹽類，揮發(fā)性低、穩(wěn)定性好。酶在離子液中的催化作用品有良好的穩(wěn)定性和區(qū)域選擇性、立體選擇性、鍵選擇性等顯著特點。有機介質反映體系：單相共溶體系——與水互溶的有機溶劑極性較大的有機溶劑與水形成均勻的單相溶液體系。酶、底物和產物都能溶解在這種體系中。不存在傳質障礙。極性大的溶劑對一般酶的催化活性影響大，能在該體系反映的酶較少。2．兩相/多相體系——與水不溶性，非極性有機溶劑由具有溶解酶的水相和一個非極性的有機溶劑(高脂溶性)相所組成的兩相體系。游離酶、親水性底物或產物溶解于水相，疏水性底物或產物溶解于有機相。催化反映在兩相界面進行，一般合用于底物或產物兩者或其中一種是屬于疏水化合物的催化反映。3．微水介質體系——非極性有機溶劑用非極性有機溶劑取代所有的大量水，使固體酶懸浮在有機相中。但仍然具有必需的結合水以保持酶的催化活性(含水量一般小于2%)。酶的狀態(tài)可以是結晶態(tài)、凍干狀態(tài)、沉淀狀態(tài)，或者吸附在固體載體表面上。有機介質酶催化中廣泛應用的一種反映體系。4．(正)膠束體系是在大量水溶液中具有少量與水不溶的有機溶劑，加入表面活性劑后形成的水包油的微小液滴。表面活性劑的極性端朝外，非極性端朝內，有機溶劑抱在液滴內部。反映時，酶在膠束外面的水溶液中，疏水性的底物或產物在膠束內部。反映在膠束的兩相界面中進行。5．反膠束體系具有表面活性劑與少量水的有機溶劑系統(tǒng)。反向微團：疏水尾部向外，與非極性有機溶劑接觸，急性頭部向內，形成一個極性核。反映時，酶分子在反膠束內部的水溶液中，疏水性底物或產物在反膠束外部，催化反映在兩相的界面中進行。有機介質酶催化的優(yōu)點：1．有助于疏水性底物的反映：有機溶劑增長了疏水性底物的溶解度，增長了疏水性物質的轉化效率；可改變反映平衡的移動方向：在有機介質中，可發(fā)生水解反映的逆反映，如氨基酸合成肽能催化在水中不能進行的反映：轉酯反映；酚氧化在氯仿中比水中效率高；防止水引起的副反映發(fā)生；酶穩(wěn)定性增強，較少微生物污染；易于實現(xiàn)固定化以及產物和酶的回收酶在有機介質中的催化特性：酶在有機介質中起催化作用時，由于有機溶劑的極性與水有很大差別，對酶的表面結構、活性中心的結合部位和底物性質都會產生一定的影響，從而顯示出與水相介質中不同的催化特性。底物特異性：有機介質中，酶分子活性中心的結合部位與底物之間的結合狀態(tài)發(fā)生某些變化，致使酶的底物特異性會發(fā)生改變。立體選擇性：有機溶劑中酶的立體選擇性減少。因素：1.在水和有機溶劑中，底物的兩種對映體將水從酶分子疏水性結合位點上置換出來的能力有所不同。2.在疏水性差的溶劑中，疏水性的基團進入酶的疏水袋中比暴露在溶劑中熱力學平衡更為有利，因此酶分子中的親核基團易于進攻位置合適的底物分子的羥基，從而得到某個構型的產物。而在疏水性強的溶劑中，疏水性基團更傾向于暴露在溶劑中，而非進入酶的疏水袋，從而失去酶對底物的選擇性。區(qū)域選擇性：在酶促反映中，底物某一位置上的基團被選擇性地轉化而另一位置上的相同基團沒有被轉化的現(xiàn)象鍵選擇性：與酶的來源和有機介質的種類有關。與氫鍵參數有關，易于形成氫鍵的基團，不易進行反映。反之易于反映熱穩(wěn)定性：酶在缺水的環(huán)境中，使得酶分子中肽鍵水解、二硫鍵破壞、氨基酸異構化等無法進行，酶構象的剛性增長，穩(wěn)定性提高?；钚裕河袡C溶劑直接作用于酶有些酶的活性會隨著某些有機溶劑濃度升高而增大，在某一濃度達成最大值；低水有機溶劑體系中，大部分酶活性得以保持，但也有某些酶活性亦發(fā)生變化。pH：pH對水相中進行的酶促反映有較大影響，但在有機相反映體系中，很難直接測定。有機介質中酶催化反映的條件及其控制：酶在有機介質中可以催化多種反映，重要涉及：合成反映、轉移反映、醇解反映、氨解反映、異構反映、氧化還原反映、裂合反映等。重要應控制的條件有水含量：酶都溶于水，只有在一定量的水存在的條件下，酶分子才干進行催化反映。所以酶在有機介質中進行催化反映時，水是不可缺少的成分之一。有機介質中的水含量多少對酶的空間構象、酶的催化活性、酶的穩(wěn)定性、酶的催化反映速度等都有密切關系，水還與酶催化作用的底物和反映產物的溶解度有關。酶的種類和濃度：酶種類：依據反映的類型，如：脂肪酶、蛋白酶、氧化酶等酶形式的選擇：冷凍干燥的酶粉、固定化酶、結晶酶、酶與大分子物質的復合物等使用載體對酶固定化，所選擇載體對酶的微水環(huán)境影響盡也許小。假如酶基本存在于載體表面，則疏水性載體對酶的固定化有利。隨著載體親水性增強，酶的催化活力呈下降趨勢(親水基團爭奪必需水，導致構想改變)。提高載體疏水基團含量，可提高固定化酶對疏水性底物的親和力，提高反映活性。底物的種類和濃度：依據酶在所使用有機介質中的專一性選擇適宜的底物底物濃度-酶促反映速度有機溶劑的種類：溫度：在微水有機介質中，酶促反映的最適溫度高于水溶液中的最適溫度溫度升高，立體選擇性下降pH：有機相中最適pH通常與水溶液中相同或接近酶分子從緩沖液中轉到有機介質后，酶分子保存原有的pH印記通過調節(jié)緩沖液pH，對有機介質中酶催化的pH值進行調節(jié)離子強度：有機介質中，酶的催化活性與酶在緩沖液中的離子強度和pH有密切關系鹽，增長離子強度，可幫助酶維持構象?？赏ㄟ^調節(jié)緩沖液中離子強度的方法對有機介質中酶催化的離子強度進行調節(jié)控制。酶非水相催化的應用：酶催化反映應用脂肪酶肽合成青霉素G前體肽合成酯合成醇與有機酸合成酯類轉酯各種酯類生產聚合二酯的選擇性聚合?；蚀嫉孽；鞍酌鸽暮铣珊铣啥嚯孽；穷愼；u基化酶氧化甾體轉化過氧化物酶聚合酚類、胺類化合物的聚合多酚氧化酶氧化芳香化合物的羥基化膽固醇氧化酶氧化膽固醇測定醇脫氫酶酯化有機硅醇的酯化手性藥物的拆分：手性化合物：化學組成相同，立體結構互為對映體的兩種異構體化合物。一種顯著療效，一種弱或無效；一種顯著療效，一種毒副作用；兩者藥效相反；或具有不同的藥效；或具有互補性手性藥物的合成與生產中，除通過不對稱合成的方法得到光學純的手性化合物外，一般得到的由等量的相應異構體分子組成的外消旋體。非生物法拆分：運用機械分離法、色譜分離法、動力學拆分等生物法：2個對映體競爭的酶同一活性中性位置，兩者反映速度不同，產生選擇性而分開第八章酶的定向化一、酶分子定向進化：簡稱酶定向進化，是模擬自然進化過程（隨機突變+自然選擇），在體外進行酶基因的人工隨機突變，建立突變基因文庫，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體的技術過程。二、酶定向進化過程：1.從細胞內提取或者通過PCR等方法獲得目的分子的基因2.在體外采用易錯PCR、DNA重組、基因家族重排等技術進行人工突變，以獲得豐富多樣的突變基因。3.構建突變基因文庫4.高通量篩選定向選擇。酶基因酶基因隨機突變隨機突變反復進行反復進行構建突變基因文庫構建突變基因文庫進化酶負突變基因篩選正突變基因進化酶負突變基因篩選正突變基因三、酶定向進化的原理及特點：特點：適應面廣：酶定向進化不需要事先了解酶的結構、催化作用機制等，可以廣泛應用于各種P酶（蛋白質類酶）和R酶（核酸類酶）的改性。目的性強：酶定向進化是根據應用過程中酶呈現(xiàn)出的催化效率低，穩(wěn)定性差等缺陷，通過基因體外隨機突變，人工定向選擇從而獲取所需的進化酶，進化方向明確，具有很強的目的性。效果顯著：通過酶的定向進化，可以在很短的時間內完畢自然進化漫長的進化歷程，效果顯著。四、酶基因的隨機突變產生策略：1.易錯PCR：是指在擴增目的基因的同時引入堿基錯配，導致目的基因隨機突變過程：1.雙鏈DNA變性2.引物與單鏈DNA退火結合3.引物延伸具體做法：1.減少一種dNTP的量（減少5%-10%）2.加入dITP來代替被減少的dNTP3.緩沖液中另加0.5mmol/LMn2+,提高Mg2+濃度。特點：操作簡便、隨機突變豐富，但正突變概率低，突變基因文庫較大，文庫篩選的工作量大，一般合用于較小基因的定向進化。2.基因重排技術：又稱DNA改組技術，是從正突變基因文庫中分離得到的同源DNA，用酶切割成隨機片段，通過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列重新排布而引起基因突變的技術過程。過程：1.目的基因片段的準備2.DNase

I(脫氧核糖核酸酶I)酶切3.不加引物的PCR4.加引物的PCR兩條以上正突變基因兩條以上正突變基因酶切酶切DNA隨機片段DNA隨機片段酶切酶切無引物PCR突變基因（反復進行）無引物PCR突變基因（反復進行）基因重組基因重組 構建突變基因文庫構建突變基因文庫進化酶正突變基因篩選負突變基因進化酶正突變基因篩選負突變基因特點：在正突變的基礎上進行，具有正突變概率高、進化速度較快的特點，但是在進行無引物PCR獲得全長突變基因之前，必須將DNase

I去除干凈以免切割突變基因。重排技術改良：交錯延伸PCR技術：在PCR反映中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步，縮短其反映時間，從而只能合成出非常短的新生鏈，經變性的新生鏈再作為引物與體系內同時存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸。反復進行，當PCR片段大小接近全長基因時，分離全長基因并用基因外引物擴增全長基因。特點：可以省去DNA重排技術中DNase

I切割這個環(huán)節(jié)，具有簡便、快速的特點。隨機引物體外重組技術：以單鏈DNA為模板，配合一套隨機序列引物，PCR生產大量互補于模板不同位點的短DNA片段，然后除去模板，這些短DNA片段互為模板和引物進行擴增，通過堿基序列的重新排布而獲取全長突變基因。特點：DNA小片段是通過隨機引物引導的PCR反映而產生的，可以用較少的DNA模板獲得較多的DNA小片段，同時省去DNA重排技術中DNase

I切割這個環(huán)節(jié)，具有簡便、快速的特點。3.基因家族重排：又稱基因家族改組技術，是從基因家族的若干同源基因出發(fā)，用DNaseI切割成隨機片段，通過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA堿基序列發(fā)生重新排布而引起基因突變的技術過程。過程：（同DNA重排技術）兩者重要不同點在于基因家族重排是從基因家族的若干同源基因出發(fā)進行DNA序列重排，DNA重排技術是采用易錯PCR等技術所獲取的兩個以上的這個突變基因出發(fā)進行DNA序列重排。特點：排除了不必要的突變，大大加快了基因體外進化的速度?；蜷g同源性較高，形成雜合體的頻率較低。五、酶突變基因的定向選擇的基本過程：基因載體突變基因基因載體突變基因基因重組基因重組突變基因文庫突變基因文庫篩選篩選目的基因目的基因通過DNA重組技術將隨機突變獲得的各種突變基因與適宜的載體進行重組，獲得重組載體。通過細胞轉化等方法將重組載體轉入適宜的細胞或進行體外包裝成為有感染活性的重組λ噬菌體，形成突變基因文庫采用各種高通量篩選技術，在人工控制的特定環(huán)境中對突變基因進行篩選，得到目的基因。六、構建基因文庫的過程過程重要涉及：載體的選擇、基因重組、形成基因文庫等1.載體的選擇：根據目的基因的特性、載體的特點與重組DNA的篩選方法等選擇適宜的載體，常用載體有：質粒載體、噬菌體DNA載體、黏粒載體、嗜菌粒載體等。2.基因重組：在體外通過DNA連接酶的作用，將基因與載體DNA連接在一起形成重組DNA，根據目的基因片段的末端性質和載體DNA、外源DNA分子上限制性核酸內切酶位點的性質，可選用黏性末端連接、平頭末端連接和修飾末端連接。（黏性末端連接比平頭末端連接效率高，修飾末端連接方式用于載體DNA和外源DNA末端不匹配時。）3.組裝突變基因文庫將重組DNA轉入受體細胞或包裝成有感染活性的重組噬菌體。七、抱負基因文庫的質量規(guī)定：文庫的包容性：文庫中包含的DNA分子是否能完整的反映出源基因的所有也許的變化和改變，涉及正突變、負突變和中性突變，以便進行全面的篩選。這就規(guī)定構建的文庫必須有足夠大的容量，通常具有106或更大的容量。文庫的完整性：文庫中包含的DNA片段必須盡也許完整的反映基因的結構和功能信息，以便通過篩選得到的突變基因可以通過表達獲取完整的具有催化功能的進化酶。八、常用的高通量篩選方法及各自的特點：篩選方法篩選依據特點平板篩選法依據細胞在平板培養(yǎng)基上的生長情況、顏色變化、透明圈情況等進行篩選通量大、效率高、簡便、快速、直觀、容易控制和調整環(huán)境條件熒光篩選法依據是否產生熒光、熒光的強度情況等進行篩選通量大、效率高、直觀、明確、容易判斷、需要克隆報告基因噬菌體表面展示法依據噬菌體外膜結構蛋白與外源蛋白形成的融合蛋白在噬菌體表面的展示情況進行篩選通量大、效率高、有效基因通過展示進行富集、需要構建外源基因與噬菌體外膜蛋白基因的融合基因酵母細胞表面展示法依據凝集素蛋白與外源蛋白形成的融合蛋白在酵母細胞表面的展示情況進行篩選通量大、效率高、有效基因通過細胞表面展示進行富集、需要構建靶蛋白基因與外源蛋白基因的融合基因九、酶定向進化的應用：定向進化技術在酶的改性方面，重要應用于提高酶的催化效率、增強酶的穩(wěn)定性、改變酶的底物特異性等方面。第九章酶反映器一，酶反映器：用于酶或固定化酶進行催化反映的容器及其附屬設備稱為酶反映器。酶反映器是用于完畢酶促反映的核心裝置。它為酶催化反映提供合適的場合和最佳的反映條件，以便在酶的催化下，使底物（原料）最大限度地轉化成產物。它處在酶催化應過程的中心地位，是連接原料和產物的橋梁。二、酶反映器的類型：按結構區(qū)分：攪拌罐式反映器、鼓泡式反映器、填充床式反映器、流化床式反映器、膜反映器按操作方式區(qū)分1.分批式反映2.連續(xù)式反映3.流加分批式反映混合形式1.連續(xù)攪拌罐反映器2.分批攪拌罐反映器反映器類型適合的操作方式合用的酶特點攪拌罐式反映器分批式,流加分批式連續(xù)式,游離酶固定化酶反映比較完全，反映條件容易調節(jié)控制。填充床式反映器連續(xù)式固定化酶密度大，可以提高酶催化反映的速度。在工業(yè)生產中普遍使用。流化床反映器分批式流加分批式連續(xù)式固定化酶流化床反映器具有混合均勻，傳質和傳熱效果好，溫度和pH值的調節(jié)控制比較容易，不易堵塞，對粘度較大反映液也可進行催化反映。鼓泡式反映器分批式流加分批式連續(xù)式游離酶固定化酶鼓泡式反映器的結構簡樸，操作容易，剪切力小，混合效果好，傳質、傳熱效率高,適合于有氣體參與的反映。膜反映器連續(xù)式游離酶固定化酶清洗比較困難噴射式反映器連續(xù)式游離酶通入高壓噴射蒸汽，實現(xiàn)酶與底物的混合，進行高溫短時催化反映，合用于某