中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)1課件

中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)米麗華生物教研室2272304教學(xué)參考資料唐炳華、王繼峰:醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)(第一版）,中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2006年胡維新:醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)（第一版）,科學(xué)出版社,2007年T.A.Brown著，魏群等譯：基因克隆和DNA分析（第五版），高等教育出版社，2003年王艷明、周坤福、徐力：分子生物學(xué)與中醫(yī)藥研究，上海中醫(yī)藥大學(xué)出版社，2000年RobertF.Weaver：MolecularBiology（3rd

ed

），

McGraw-HillPress.2005[美]J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯：分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版），科學(xué)出版社，2002年朱玉賢、李毅、鄭曉峰：現(xiàn)代分子生物學(xué)（第三版），高等教育出版社，2007年教學(xué)參考資料盧圣棟：現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，高等教育出版社，1993年J.D.WatsonetalMolecularBiologyoftheGene

5thTheBenjamin/CummingsPublishingCompany,Inc.2003Lewin,B.,GENES

Ⅷ.UniversityPress,Oxford.2004孫乃恩孫東旭朱德煦：分子遺傳學(xué)（第二版），南京大學(xué)出版社，1997年網(wǎng)址：/（參見(jiàn)教材P274表7-3）第一章緒論一、什么是分子生物學(xué)分子生物學(xué)已廣泛滲透到醫(yī)學(xué)科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的理論基礎(chǔ)。微生物學(xué)臨床各學(xué)科細(xì)胞學(xué)免疫學(xué)病理學(xué)藥理學(xué)生理學(xué)分子生物學(xué)二、分子生物學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容

（一）分子生物學(xué)理論1、核酸的分子生物學(xué)：研究核酸的結(jié)構(gòu)及其功能。分子遺傳學(xué)（moleculargenetics）是其主要研究?jī)?nèi)容包括①核酸/基因組的結(jié)構(gòu)，②遺傳信息的復(fù)制，③轉(zhuǎn)錄與翻譯，④核酸存儲(chǔ)的信息突變與修復(fù)，⑤基因表達(dá)調(diào)控和基因工程技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用等。遺傳信息傳遞的中心法則（centraldogma）是其理論體系的核心。二、分子生物學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容

（一）分子生物學(xué)理論：1、核酸的分子生物學(xué)：研究核酸的結(jié)構(gòu)及其功能。2、蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)研究執(zhí)行各種生命功能的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。3、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子生物學(xué)：研究細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間信息傳遞的分子基礎(chǔ)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理的研究在理論和技術(shù)方面與上述核酸及蛋白質(zhì)分子有著緊密的聯(lián)系，是當(dāng)前分子生物學(xué)發(fā)展最迅速的領(lǐng)域之一。二、分子生物學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容

（二）

分子生物學(xué)技術(shù)2、核酸操作技術(shù)核酸的提取和純化；DNA、RNA合成技術(shù)；DNA重組技術(shù)；核酸雜交技術(shù)；DNA序列測(cè)定技術(shù)等。3、實(shí)用蛋白技術(shù)蛋白質(zhì)的提取和純化；蛋白質(zhì)測(cè)定；蛋白質(zhì)印跡技術(shù)；蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)等。二、分子生物學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容（三）分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用如癌的分子生物學(xué)；免疫分子生物學(xué)；人類(lèi)基因分析；基因產(chǎn)物的醫(yī)學(xué)用途；新藥的發(fā)現(xiàn)；基因診斷、治療；人類(lèi)疾病的分子生物學(xué)等。二、分子生物學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容（二）現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立和發(fā)展階段

這一階段是從50年代初到70年代初，以1953年Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型作為現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的里程碑，開(kāi)創(chuàng)了分子遺傳學(xué)基本理論建立和發(fā)展的黃金時(shí)代。

1、中心法則的建立Watson和Crick就提出DNA復(fù)制的可能模型。1956年A.Kornbery首先發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶。1958年Meselson及Stahl用同位素標(biāo)記和超速離心分離實(shí)驗(yàn)為DNA半保留模型提出了證明。1968年Okazaki（岡畸）提出DNA不連續(xù)復(fù)制模型。（二）現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立和發(fā)展階段1972年證實(shí)了DNA復(fù)制開(kāi)始需要RNA作為引物

1958年Weiss及Hurwitz等發(fā)現(xiàn)依賴(lài)于DNA的RNA聚合酶

1961年Hall和Spiege-lman用RNA-DNA雜交證明mRNA與DNA序列互補(bǔ)

60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等幾組科學(xué)家的共同努力破譯了RNA上編碼合成蛋白質(zhì)的遺傳密碼

1970年Temin和Baltimore又同時(shí)從雞肉瘤病毒顆粒中發(fā)現(xiàn)以RNA為模板合成DNA的反轉(zhuǎn)錄酶

2、對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)

1956-58年Anfinsen和White根據(jù)對(duì)酶蛋白的變性和復(fù)性實(shí)驗(yàn)，提出蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)是由其氨基酸序列來(lái)確定的。

1958年Ingram證明正常的血紅蛋白與鐮刀狀細(xì)胞溶血癥病人的血紅蛋白之間，亞基的肽鏈上僅有一個(gè)氨基酸殘基的差別

1969年Weber開(kāi)始應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量

1973年氨基酸序列自動(dòng)測(cè)定儀問(wèn)世。

中國(guó)科學(xué)家在1965年人工合成了牛胰島素。在1973年用1.8AX-線(xiàn)衍射分析法測(cè)定了牛胰島素的空間結(jié)構(gòu)，為認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)做出了重要貢獻(xiàn)。（三）初步認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)并開(kāi)始改造生命的深入發(fā)展階段

70年代后，以基因工程技術(shù)的出現(xiàn)作為新的里程碑，標(biāo)志著人類(lèi)深入認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)并能動(dòng)改造生命的新時(shí)期開(kāi)始。其間的重大成就包括：

1、重組DNA技術(shù)的建立和發(fā)展1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等發(fā)現(xiàn)的限制性核酸內(nèi)切酶為基因工程提供了有力的工具；1972年Berg等將SV-40病毒DNA與噬菌體P22DNA在體外重組成功，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，使本來(lái)在真核細(xì)胞中合成的蛋白質(zhì)能在細(xì)菌中合成,打破了種屬界限；1、重組DNA技術(shù)的建立和發(fā)展1977年Boyer等首先將人工合成的生長(zhǎng)激素釋放抑制因子14肽的基因重組入質(zhì)粒，成功地在大腸桿菌中合成得到這14肽

1979年美國(guó)基因技術(shù)公司用人工合成的人胰島素基因重組轉(zhuǎn)入大腸桿菌中合成人胰島素。

1、重組DNA技術(shù)的建立和發(fā)展這時(shí)期基因工程的迅速進(jìn)步得益于許多分子生物學(xué)新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)。

1975-1977年Sanger、Maxam和Gilbert先后發(fā)明了三種DNA序列的快速測(cè)定法；

1985年Cetus公司Mullis等發(fā)明的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的特定核酸序列擴(kuò)增技術(shù)；90年代全自動(dòng)核酸序列測(cè)定儀的問(wèn)世。

2、分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展

⑴癌基因的發(fā)現(xiàn)⑵基因診斷⑶基因組文庫(kù)的建立⑷基因工程生產(chǎn)人胰島素⑸轉(zhuǎn)基因動(dòng)物⑹人類(lèi)基因治療⑺基因工程抗體技術(shù)的建立和發(fā)展⑻DNA芯片技術(shù)（基因芯片、生物芯片）4、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理

1961年，Jacob，F(xiàn).和Monod，J.提出了操縱子模型，打開(kāi)了人類(lèi)認(rèn)識(shí)基因表達(dá)調(diào)控的窗口。20世紀(jì)70年代以后才逐漸認(rèn)識(shí)了真核基因組結(jié)構(gòu)和調(diào)控的復(fù)雜性。

1977年最先發(fā)現(xiàn)猴SV40病毒和腺病毒中編碼蛋白質(zhì)的基因序列是不連續(xù)的，揭開(kāi)了認(rèn)識(shí)真核基因組結(jié)構(gòu)和調(diào)控的序幕。

1981年Cech等發(fā)現(xiàn)四膜蟲(chóng)rRNA的自我剪接，從而發(fā)現(xiàn)核酶（ribozyme）。

20世紀(jì)80-90年代，使人們逐步認(rèn)識(shí)到真核基因的順式調(diào)控元件與反式轉(zhuǎn)錄因子、核酸與蛋白質(zhì)間的分子識(shí)別與相互作用是基因表達(dá)調(diào)控根本所在。

5、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理研究的深入

1957Sutheland年發(fā)現(xiàn)cAMP、1965年提出第二信使學(xué)說(shuō)，是人們認(rèn)識(shí)受體介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第一個(gè)里程碑。1977年Ross等用重組實(shí)驗(yàn)證實(shí)G蛋白的存在和功能，深化了對(duì)G蛋白偶聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的認(rèn)識(shí)。20世紀(jì)70年代中期以后，癌基因和抑癌基因的發(fā)現(xiàn)、蛋白酪氨酸激酶的發(fā)現(xiàn)及其結(jié)構(gòu)與功能的深入研究、各種受體蛋白基因的克隆和結(jié)構(gòu)功能的探索等，使近10年來(lái)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究更有了長(zhǎng)足的進(jìn)步。目前，對(duì)于某些細(xì)胞中的一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑已經(jīng)有了初步的認(rèn)識(shí)。二十一世紀(jì)生物學(xué)的新熱點(diǎn)及領(lǐng)域

結(jié)構(gòu)生物學(xué)（StructuralBiology）

生物大分子的高級(jí)三維結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一生物大分子之間的互作→基因的社會(huì)學(xué)分子發(fā)育生物學(xué)（MolecularDevelopingBiology）基因表達(dá)，基因互作

器官發(fā)生胚胎形成個(gè)體發(fā)育21世紀(jì)生命科學(xué)發(fā)展的重要態(tài)勢(shì)對(duì)生命現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)從單基因水平向全基因組整體水平發(fā)展現(xiàn)代生命科學(xué)研究的理論與技術(shù)從較長(zhǎng)期的積累走向應(yīng)用四、分子生物學(xué)與其他醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)學(xué)科的關(guān)系

生物化學(xué)與分子生物學(xué)關(guān)系最為密切。兩者同在我國(guó)教委和科委頒布的一個(gè)二級(jí)學(xué)科中，稱(chēng)為“生物化學(xué)與分子生物學(xué)”。生物化學(xué)主要從化學(xué)角度研究生命現(xiàn)象，它著重研究生物體內(nèi)各種分子的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)化和新陳代謝。傳統(tǒng)生物化學(xué)的主要內(nèi)容是各種物質(zhì)代謝。分子生物學(xué)則著重闡明核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制。細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)關(guān)系也十分密切。遺傳學(xué)與分子生物學(xué)關(guān)系密切。由于分子生物學(xué)涉及認(rèn)識(shí)生命的本質(zhì)，它也就自然廣泛的滲透到醫(yī)學(xué)各學(xué)科領(lǐng)域中，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)重要的基礎(chǔ)。

生理學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)、藥理學(xué)以及臨床各學(xué)科，分子生物學(xué)都正在廣泛地形成交叉與滲透。

五、分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

（一）在中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究中的應(yīng)用2、治則治法的研究科研人員用抑癌扶正行氣活血法治療經(jīng)二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的肝癌大鼠，采用DD-PCR（差異顯示技術(shù)）和Northernbolt對(duì)治療后大鼠肝組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)肝癌組織若干癌基因轉(zhuǎn)錄水平降低。（見(jiàn)P8）五、分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

（二）在中醫(yī)臨床上的應(yīng)用吳志奎等進(jìn)行了“補(bǔ)腎生血方對(duì)β-地中海貧血基因水平的影響”的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎生血藥能明顯提高β-地中海貧血患者血紅蛋白（Hb）和抗堿血紅蛋白（HbF），提高血紅蛋白的珠蛋白鏈比。起作用機(jī)制可能是補(bǔ)腎生血藥能提高珠蛋白鏈γ/β+γ比值，促進(jìn)γ-珠蛋白基因的表達(dá)，誘導(dǎo)HbF合成，從而代償了β-珠蛋白基因功能缺陷。五、分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

（三）在針灸研究中的應(yīng)用1、針刺鎮(zhèn)痛與C-fos、C-jun、CC-k基因的研究2、耳針與表皮生長(zhǎng)因子RACTH的研究3、電針抗癇與CCK基因表達(dá)的研究4、電針與抗腦缺血與C-fos原癌基因表達(dá)的研究5、針刺抑制老年大鼠與垂體細(xì)胞因子基因表達(dá)6、電針對(duì)細(xì)胞凋亡的影響7、針刺對(duì)脊髓背角內(nèi)生長(zhǎng)期相關(guān)蛋白GAP43表達(dá)的影響8、針刺對(duì)雌性大鼠垂體雌激素受體mRNA表達(dá)和血雌二醇（E2）水平影響的研究9、“醒腦開(kāi)竅”針?lè)▽?duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死大鼠腦細(xì)胞核糖核酸的影響（四）在中藥研究中的應(yīng)用1、鑒定中藥材及藥用植物資源保護(hù)常用DNA分子標(biāo)記法，其是指以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記。

DNA分子遺傳標(biāo)記常用的方法是RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA——隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)DNA)是1990年由Williams等發(fā)展起來(lái)的。分子標(biāo)記主要應(yīng)用：

遺傳育種

生藥鑒定和藥材道地性

五、分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

2、獲取有效成分一是有關(guān)代謝途徑基因工程的研究。

二是有關(guān)轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物反應(yīng)器構(gòu)建的研究。

3、在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerasechainreaction，PCR）是1985年由美國(guó)PE-Cetus公司的人類(lèi)遺傳研究室Mullis等人發(fā)明，具有劃時(shí)代的意義的。PCR技術(shù)能以其準(zhǔn)確、無(wú)誤、迅速、簡(jiǎn)捷和毫無(wú)置疑的檢測(cè)結(jié)果，證明藥材的真?zhèn)?，從而能夠從根本上徹底解決中藥材的造假問(wèn)題。4、新藥開(kāi)發(fā)中藥治療癌癥主要以扶正為主，提高機(jī)體本身的防御能力，我國(guó)二類(lèi)抗癌新藥還有攻擊癌細(xì)胞的作用。如“威麥寧膠囊”以野生植物為原料，他對(duì)癌細(xì)胞RNA逆轉(zhuǎn)錄酶有抑制作用。

5、中藥藥理研究唐利龍等研究川穹嗪對(duì)原代培養(yǎng)血管平滑