產(chǎn)胞外多糖菌株的篩選及對水體凈化的影響

產(chǎn)胞外多糖菌株的篩選及對水體凈化的影響摘要：從滏陽河水體中篩選到高產(chǎn)胞外多糖菌株巨大芽抱桿菌FY-33(Bacillusmegateriumstrain),搖床培養(yǎng)多糖產(chǎn)量可達(dá)1683.25mg/L。以FY-33和千屈菜為材料，以總氮、總磷為指標(biāo)，單因素結(jié)果顯示：接種量3%、植株栽培后20d接種、植株密度9株/m2為水體凈化的合適條件；正交試驗(yàn)結(jié)果顯示：接種量為3%、植株栽培后20d接種、植株密度為12株/m2為水體凈化最佳組合，總氮、總磷降解率最高，分別達(dá)到73.2%和65.4%。正交試驗(yàn)條件下，活菌數(shù)定植試驗(yàn)中，活菌數(shù)比對照組增加了2?4倍，且含有大量FY-33。FY-33可以提高千屈菜的根系活力，接種20d、30d根系活力分別提高45.2%和52.5%； FY-33可以提高千屈菜全氮、全磷含量，根、莖、葉全N、全P含量高于對照組，葉較為明顯，葉較對照全N和全P含量分別提高了31.5%、28.3%。全N測定用凱氏定氮法，全P測定用釩鉬黃比色法。利用滏陽河生態(tài)浮床進(jìn)行了菌株對水生植物千屈菜水體凈化試驗(yàn)，滏陽河富營養(yǎng)化區(qū)域生態(tài)浮床千屈菜根部接種FY-33菌株58d后，水質(zhì)指標(biāo)達(dá)到三類水的標(biāo)準(zhǔn)，水體凈化結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室結(jié)果一致。高產(chǎn)胞外多糖FY-33可以促進(jìn)其在水生植物根際定植、提高植物根系活力和全N、全P含量，形成微生物與植物凈化水體的合力，提高水生植物水體凈化能力，應(yīng)用前景廣闊。關(guān)鍵詞：滏陽河；胞外多糖；細(xì)菌篩選；千屈菜；水體凈化微生物胞外多糖(EPS)是微生物在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外的糖類高聚物，是一種次級代謝產(chǎn)物，由單一的或多種的單糖和糖類衍生物單元組成［1］o微生物多糖應(yīng)用于土壤結(jié)構(gòu)改良正日益受到人們的關(guān)注［2-3］，微生物在溶解磷中的作用相關(guān)研究也越來越廣泛［4］，植物在水體凈化中的研究更是日益凸顯［5"6］o本研究以衡水市區(qū)滏陽河水上生態(tài)浮床為載體，研究產(chǎn)胞外多糖微生物與植物的聯(lián)合作用，促進(jìn)水生植物對水體的凈化作用。1材料與方法1.1主要儀器與試驗(yàn)材料主要儀器：超凈工作臺BJ-2CD，生化培養(yǎng)箱SPX-150B-Z,高速冷凍離心機(jī)GL-20G-H，T-9紫外分光光度計(jì)，伯樂PCR基因擴(kuò)增儀，KDN-102c定氮儀，消煮爐，500mL球形索氏提取器，30mL古氏坩蝸，WXG-4旋光儀。分離培養(yǎng)基：葡萄糖50g/L，酵母膏0.05g/L，MgSO4*7H2Q0.7g/L，KH2PO43.48g/L，(NHQ2SO42g/L，Na2HPO4?12H2。1.5g/L，pH7.0，采用115°C滅菌30min。發(fā)酵培養(yǎng)基［7］：蔗糖40g/L,酵母膏3g/L,MgSO4?7H2O2g/L,KH2PO42.6g/L,FeSO4?7H2O1mg/L,CaCl20.5g/L,pH7.0,采用115°C滅菌30min。供試水生植物及載體：千屈菜，生態(tài)浮床。試驗(yàn)容器：50cmX40cmX30cm玻璃缸若干。1.2試驗(yàn)方法1.2.1產(chǎn)胞外多糖菌株的分離篩選1.2.1.1樣品采集2018年4月采集滏陽河的水體樣品。水樣采集深度分別為水表層、水面下0.5m、1m,利用2L的有機(jī)玻璃采水器進(jìn)行水樣采集，將水樣低溫保存?zhèn)溆谩?.2.1.2菌種篩選將采集的新鮮水樣1mL放于9mL無菌水中，混合均勻后做系列稀釋，取稀釋液0.2mL涂布于含有分離培養(yǎng)基的平板上，37C培養(yǎng)48h。用無菌牙簽輕輕挑取菌落向外拉，能形成拉絲現(xiàn)象的單菌落即初步鑒定為產(chǎn)胞外多糖的菌株。初篩菌株保藏于LB斜面上，置于4C冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.1.3粗多糖的提取與測定采用發(fā)酵培養(yǎng)基對篩選的菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。取5mL發(fā)酵液加入離心管內(nèi)，10000r/min、于4C離心15min,除去菌體后取上清液加入三氯乙酸至質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%,反應(yīng)12h后，10000r/min,于4C離心45min除去蛋白，于上清液中加入3倍體積的95%的乙醇溶液，于4C條件下浸提12h, 10000r/min、于4C離心45min并收集沉淀，棄去上清液后，分別用丙酮、乙醚和無水乙醇洗滌一次后離心，將獲得的最終沉淀用去離子水溶解定容即為粗多糖溶液［8］。制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及胞外多糖含量測定采用硫酸苯酚法［9］。1.2.1.4菌株的純化和保存用平板劃線法將高產(chǎn)胞外多糖菌株純化，在LB平板上反復(fù)劃線培養(yǎng)，直至長出形態(tài)一致的菌落為止。將單菌落制片、染色，觀察菌體形態(tài)，以菌體形態(tài)是否一致為標(biāo)準(zhǔn)。對純化的菌株，于斜面4C保存，備用。1.2.1.5菌株的分子生物學(xué)鑒定采用16SrDNA鑒定方法。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由北京三博測序公司進(jìn)行16SrDNA序列測序。將所測得的16SrDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已有序列進(jìn)行同源性比較。1.2.2產(chǎn)胞外多糖菌株對水生植物水體凈化的單因素試驗(yàn)1.2.2.1菌懸液的制備將篩選到的產(chǎn)胞外多糖含量最高的作為優(yōu)勢菌株接種到LB斜面培養(yǎng)基，37C培養(yǎng)48h后，將菌苔輕輕刮起，洗入盛有100mL無菌水帶玻璃珠的250mL三角瓶中，200r/min振蕩15min。取2mL菌懸液接種于盛有100mLLB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于37 180r/min震蕩培養(yǎng)48h,以菌數(shù)達(dá)到108cfu/mL為宜，該菌液為接種試驗(yàn)樣品，對照為同樣條件下的不含菌的液體培養(yǎng)基。1.2.2.2接種量對水生植物水體凈化效果的影響選取同樣體積的玻璃缸6個(gè)，每個(gè)缸內(nèi)裝入采集自滏陽河富營養(yǎng)化區(qū)域的水樣40L。按9株/m2的株密度同時(shí)栽種千屈菜，每株有浮體材料支撐，千屈菜栽種15d后，將優(yōu)勢菌株按1%、2%、3%、4%、5%、6%接種量分別噴施于不同玻璃缸的植物根部，20d后測定水體總氮、總磷和氨氮等水質(zhì)指標(biāo)?？偟獪y定采用過硫酸鉀氧化-紫外分光光度法；總磷測定采用鑰酸銨分光光度法；硝酸鹽氮采用酚二磺酸光度法；亞硝酸鹽氮采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法；氨氮測定采用納氏比色法；COD測定采用重鉻酸鉀法。1.2.2.3接種時(shí)間對水生植物水體凈化效果的影響分別在千屈菜栽種5d、10d、15d、20d、25d和30d后，于其根部噴施4%的菌液，噴施后20d分別進(jìn)行水體總氮、總磷和氨氮等指標(biāo)測定。

1.2.2.4植株密度對水體凈化效果的影響千屈菜栽種株密度分別為3株/m2、6株/m2、9株/m2、12株/m2、15株/m2、18株/m2,以4%接種量分別噴施于不同玻璃缸的植物根部噴施后20d分別進(jìn)行水體總氮、總磷和氨氮等指標(biāo)測定。1.2.3菌株對水生植物水體凈化效果影響的正交試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以接種量（%）、接種時(shí)間即植株栽培時(shí)間（d）、植株密度（m2）為影響因素設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)（L9（33））。以不接種的為對照，計(jì)算不同試驗(yàn)組總氮和總磷的降解率。接種量設(shè)計(jì)為2、3、4；接種時(shí)間設(shè)計(jì)為10、20、30；植株密度設(shè)計(jì)為6、9、12。降解率（%）=[1—（試驗(yàn)樣實(shí)測含量/對照樣實(shí)測含量）]X100%。1.2.4利用正交試驗(yàn)條件進(jìn)行室內(nèi)試驗(yàn)利用正交試驗(yàn)結(jié)果，在最適條件下，合適接種量、合適的接種時(shí)間、合適的植株密度，根據(jù)各試驗(yàn)設(shè)計(jì)需求測定各種指標(biāo)。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)三組平行，計(jì)算結(jié)果為平均值。1.2.4.1菌株定植活菌數(shù)測定接種15d開始第一次采集千屈菜根際微生物樣品，每隔5d采集一次，共采集5次。利用平板計(jì)數(shù)法測定植物根際細(xì)菌活菌數(shù)，以不接菌的為對照。1.2.4.2菌株對水生植物根系活力的影響分別于接種后10d、20d、30d測定根系活力，根系活力的測定采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法。1.2.4.3菌株對水生植物全氮全磷指標(biāo)的影響接種30d時(shí)同時(shí)測定根、莖、葉全N、全P含量。全N用凱氏定氮法，全P用釩鉬黃比色法。1.2.5菌株對水生植物水體凈化室外試驗(yàn)利用正交試驗(yàn)結(jié)果，2018年7月在滏陽河選擇500m2試驗(yàn)區(qū)，并利用防水布及重物懸掛（置入底泥）的形式進(jìn)行防水圍隔。利用合適接種量、選擇相對比較合適的室外植株密度進(jìn)行室外試驗(yàn)。菌種擴(kuò)大培養(yǎng)用發(fā)酵液體培養(yǎng)基。發(fā)酵液做成凍干制劑備用。接種后28d內(nèi)每7d測定一次水質(zhì)指標(biāo)，28d后每15d測定一次，共計(jì)測定6次。2結(jié)果與分析2.1高產(chǎn)胞外多糖菌株的篩選用1g/L葡萄糖溶液，分別制得質(zhì)量濃度為0、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200mg/L的葡萄糖溶液，利用蒽酮比色法，在600nm處比色，以空白做對照，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。通過分離篩選獲得12株具有黏性拉絲現(xiàn)象的單菌落。將初篩獲得的菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定胞外多糖含量，結(jié)合復(fù)篩結(jié)果篩選出3株多糖產(chǎn)量較高的菌株。命名為FY-14、FY-33和FY-49。其中，產(chǎn)量最高的FY-33發(fā)酵48h后，靜置和搖床培養(yǎng)多糖產(chǎn)量可達(dá)1372.69~1683.25mg/L。同時(shí)，圖2中表明，好氧條件更適合微生物產(chǎn)胞外多糖。180160009CIQffi索芋O.8.64.21.8.64.2OIXC.IIUoo140120100806050100葡萄糖濃度/（mg/L）圖1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線y160009CIQffi索芋O.8.64.21.8.64.2OIXC.IIUoo140120100806050100葡萄糖濃度/（mg/L）圖1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0085xR2=0.994440200■靜置培養(yǎng)■搖床培養(yǎng)FY- FY- FY-初篩菌不同培養(yǎng)條件下復(fù)篩菌株胞外多糖產(chǎn)量2.2菌株分子生物學(xué)鑒定高產(chǎn)胞外多糖菌株FY-33與序列登錄號為JF895489.1的巨大芽抱桿菌的相似度為99.9%，因此判斷FY-33屬于巨大芽抱桿菌類群(Bacillusmegateriumstrain)?2.3 FY-33接種量對水生植物水體凈化效果的影響FY-33接種量對水生植物水體凈化效果的影響見圖3。圖中A1為總氮變化情況、A2為總磷變化情況、A3為氨氮變化情況。由圖3可以看出，接種量為1%和2%時(shí)總氮、總磷和氨氮數(shù)值較高，3%時(shí)數(shù)值變小，之后變化較緩，3%接種量較為合適。001 2 3 4 5 6接種量/%圖3不同接種量水質(zhì)指標(biāo)變化4.21.8.642110.0.0.0.2.4 FY-33接種時(shí)間對水生植物水體凈化效果的影響FY-33接種時(shí)間對水生植物水體凈化效果的影響見圖4。從圖4可以看出，植物的栽培時(shí)間直接影響接種后對植物凈化水體的作用。植物的栽培時(shí)間不同，根系發(fā)達(dá)程度不同，接種后的效果不同，合適的根系發(fā)達(dá)程度，化感效應(yīng)明顯，對菌株的吸附效果好，菌株的有機(jī)氮、磷轉(zhuǎn)化能力通過與植物的相互作用，促進(jìn)植物對水體的凈化作用。圖4表明植株栽培后20d為合適的接種時(shí)間。接種時(shí)間/d接種時(shí)間/d不同接種時(shí)間水質(zhì)指標(biāo)變化圖4不同接種時(shí)間水質(zhì)指標(biāo)變化圖5表明植株密度不同，對水體的凈化能力不同，千屈菜栽2.5植株密度對水體凈化效果的影響植株密度對水體凈化效果的影響見圖圖5表明植株密度不同，對水體的凈化能力不同，千屈菜栽種株密度達(dá)到9株/m2時(shí)，總氮、總磷及氨氮含量都明顯下降，表明植物凈水能力顯著提高，之后變化較小。9株/m2的植株密度根系的覆蓋度已基本合適，利于菌株附著和生長，從而提高植物的水體凈化效果。

(mm)/骯蚩*1.6(mm)/骯蚩*1.6圖5不同植株密度水質(zhì)指標(biāo)變化2.6 FY-33對水生植物水體凈化效果影響的正交試驗(yàn)結(jié)果表1正交試驗(yàn)結(jié)果顯示接種量為3%、接種時(shí)間為植物栽培后20d、植株密度為12株/m2的組合總氮降解率（%）最高，達(dá)到73%。該組合為總氮降解水體凈化合適的處理?xiàng)l件。表2表明總磷降解的最佳組合與總氮降解的最佳組合結(jié)果一致，總磷降解率達(dá)到65%。由于植物自身有一定的凈水能力，產(chǎn)多糖菌株與植物的協(xié)同作用可以顯著增強(qiáng)植物的水體凈化能力。表1總氮降解率直觀分析表 表2總磷降解率直觀分析表接種量/%接種時(shí)間/d植株密度/m2總氮降解率/%接種量/%接種時(shí)間/d植株密度/m2總磷降解率/%實(shí)驗(yàn)111119.3實(shí)驗(yàn)11117.4實(shí)驗(yàn)212236.6實(shí)驗(yàn)212212.9實(shí)驗(yàn)313330.2實(shí)驗(yàn)313320.6實(shí)驗(yàn)421263.9實(shí)驗(yàn)421243.7實(shí)驗(yàn)522373.2實(shí)驗(yàn)522365.4實(shí)驗(yàn)623144.8實(shí)驗(yàn)623131.7實(shí)驗(yàn)731367.9實(shí)驗(yàn)731352.6實(shí)驗(yàn)832145.7實(shí)驗(yàn)832128.5實(shí)驗(yàn)933256.1實(shí)驗(yàn)933241.9均值128.70050.36736.600均值113.63334.56722.533均值260.63351.83352.200均值246.93335.60032.833均值356.56743.70057.100均值341.00031.40046.200極差31.9338.13320.500極差33.3004.20023.6672.7利用正交試驗(yàn)條件進(jìn)行室內(nèi)試驗(yàn)在接種量為3%、接種時(shí)間為植物栽培后20d、植株密度為12株/m2的條件下進(jìn)行室內(nèi)試驗(yàn)。2.7.1 FY-33定植活菌數(shù)測定FY-33定植活菌數(shù)測定結(jié)果見表3。表3中BM為接種組，CK組為不接菌的對照組。表3結(jié)果顯示,接種組活菌數(shù)隨著時(shí)間的延長有不同程度的增長，活菌中有大量的FY-33,因?yàn)槠浒舛嗵钱a(chǎn)出明顯。活菌數(shù)比對照組增加了2~5倍，對照組的活菌數(shù)隨時(shí)間變化較小。說明FY-33在千屈菜根際有很好的定植。表3千屈菜根際FY-33活菌數(shù)15d20d25d30d35dBM/105cfu3.2186.3897.6628.3929.156CK/103cfu1.8451.8262.0522.1042.1282.7.2 FY-33對水生植物全氮全磷指標(biāo)的影響FY-33對水生植物全氮全磷指標(biāo)的影響見表4。表4表明，接種FY-33菌株30d后千屈菜根、莖、葉各器官全N含量和全P含量明顯高于對照組CK,葉較為明顯，較對照全N和全P分別提高了31.5%、28.3%。說明千屈菜吸收了水體中更多的氮和磷，F(xiàn)Y-33產(chǎn)生的胞外多糖，一方面增加其在植物根系的定植，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還說明FY-33促進(jìn)植物對氮和磷的吸收，促進(jìn)植物對水體的凈化。表4千屈菜各器官全N含量和全P含量組織全N含量全P含量BMCKBMCK葉13.66±0.23a9.35±0.31a1.27±0.04a0.91±0.02b莖9.78±0.25a7.43±0.24b1.12±0.03a0.89±0.03a根8.52±0.26b7.82±0.33a0.58±0.03a0.51±0.01a注：a、b、c均表示顯著水平a=0.052.7.3菌株對水生植物水體凈化在圍隔區(qū)內(nèi)，根據(jù)水的體積將凍干制劑FY-33以3%的接種量接入滏陽河水上生態(tài)浮床千屈菜根際，表5顯示不同時(shí)間水體各指標(biāo)呈現(xiàn)出隨時(shí)間增加水質(zhì)逐漸變好的趨勢。與FY-33的增殖促進(jìn)植物對氮磷的吸收有關(guān)。在水體凈化時(shí)，該類菌株適合在植物相對密集區(qū)使用。表5滏陽河水上生態(tài)浮床水體凈化效果 mg/L10.770.0210.431.5242.330.4820.690.0180.381.3736.520.3930.610.0160.311.2631.550.3240.540.0130.251.1726.920.2650.440.0090.210.9821.450.2160.390.0060.130.5414.380.14取樣次序測定指標(biāo)氨氮含量亞硝酸鹽氮含量硝酸鹽氮含量總氮含量COD值總磷含量2.7.4 FY-33對水生植物根系活力的影響接種組BM組在接種FY-33不同的時(shí)間內(nèi)根系活力明顯高于對照CK組。20d時(shí)已經(jīng)比較明顯，BM組達(dá)到1.26mg/(g-h)，20d、30d根系活力分別提高45.2%和52.5%。說明FY-33對千屈菜的根系活力有明顯的促進(jìn)作用。3討論與結(jié)論初級生產(chǎn)者與初級消費(fèi)者是淡水生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的重要組成，是維持系統(tǒng)生產(chǎn)力、多樣性和穩(wěn)定性功能的基礎(chǔ)。其中，高等水生植物和浮游植物作為河流和湖泊生態(tài)系統(tǒng)中的主要初級生產(chǎn)者，是維持湖泊生態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的重要組分。利用水生植物來降解凈化水污染，已經(jīng)在很多水體恢復(fù)試