實時熒光定量PCR技術

實時熒光定量PCR技術ABI熒光定量PCR儀ABI7000羅氏的熒光定量PCR儀濾鏡輪CCD相機多孔板物鏡均一的激發(fā)和檢測，無光程差采用折疊光路增加光程，降低激發(fā)高度羅氏LC480教學安排定量過程化學原理定量原理的數學依據定量要素應用實例實時熒光定量PCR定義在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實現(xiàn)了實時監(jiān)測整個PCR進程，對起始模板進行定量分析的方法。傳統(tǒng)的終點PCR定量終點法的結果96個樣品的重復性PCR擴增曲線Rn(熒光信號)循環(huán)數CycleNumber指數增長期平臺期SampleNoTemplateThresholdBaselineRn-Cq閾值和Cq值Rn+標準曲線教學安排定量過程定量原理的數學依據化學原理定量要素應用實例PCR理論方程Where:Rn=TotalfluorescencesignalRB=BasefluorescencesignalXO=InitialnumberoftargetmoleculesEX=Efficiencyoftargetamplificationn=NumberofcycleRS=Fluorescencesignalpertargetmolecule當n=Cq時，Rn=Rq，即設定的閾值Rq=RB+XO(1+Ex)CqRs

log(Rq-RB)=logXO+Cqlog(1+Ex)+logRsCqlog(1+Ex)=log(Rq-RB)-logXO-logRs

Cq=a·logXO

+b教學安排定量過程定量原理的數學依據化學原理定量的要素應用實例化學原理TaqMan?探針SYBR?GreenISYBR?GreenI熒光原理變性延伸擴增完成SYBR?GreenI熔解曲線TaqMan?探針5’3’5’5’3’5’RQ正向引物TaqMan?

探針反向引物5’3’5’5’3’5’QR正向引物反向引物其它類型的熒光標記分子信標LUX

引物熒光分子比較以上是來自Invitrogen公司的比較。

TaqMan

ProbesMolecularBeaconsSYBR

GreenILUXPrimers靈敏度**********動態(tài)范圍**********特異性*********多重反應****N/A***熔解曲線分析N/AN/A******設計簡單********費用********教學安排定量過程化學原理定量原理的數學依據定量的要素應用實例目標基因未知樣品產生標準曲線標準品監(jiān)控試劑、系統(tǒng)陽性對照監(jiān)控污染陰性對照數據之間可比性內對照(IPC)校正操作誤差參比熒光(ROX)降低定量誤差3-6復管定量的要素目標基因可以是DNA、cDNA或者質粒；RNA需要先反轉錄成cDNA；DNA純度：OD260/OD280=1.8，可以在1.6~2.0之間

=1.8:純DNA>2.0:RNA污染<1.6:蛋白質/酚污染DNA用量：基因組DNA：0.1ng–1ug

目標基因

標準品用來生成標準曲線，建立CT值與濃度之間的數學關系。

PCR擴增效率盡量接近，越一致誤差越小。同樣條件下完成：同樣的儀器、試劑、循環(huán)參數、同一次實驗。同樣質量的模板、同樣Tm值的引物和探針。標準品陽性對照已知必定可以成功、得到擴增曲線的樣品用于判斷儀器、試劑、操作是否存在問題（假陰性）陰性對照/空白對照除了模板DNA或RNA，具備其他全部成分以水代替模板用于判斷系統(tǒng)是否存在污染（假陽性）陽性對照和陰性對照內對照(IPC)同樣重量或體積的樣品并不來源于同樣數目的細胞，即使細胞培養(yǎng)的起始量相同、條件相同IPC一般選用基因組中單拷貝的管家基因，其定量結果代表了基因組的數量，也就是檢材中細胞的數量CT

=CTSmpl-CTIPC將定量結果校正為以基因組為單位，不同樣品之間具可比性絕對定量和相對定量絕對定量：確定待測樣品中某一目的基因的絕對量值，即確切拷貝數。

標準曲線法相對定量：確定待測樣品中某一目的基因在不同條件下的表達差異（倍數關系）。

雙標準曲線法；2-ΔΔc(q)法教學安排定量過程化學原理定量原理的數學依據定量的要素應用實例應用實例定量檢測絕對定量：基因表達研究、轉基因食品檢測、病原體檢測相對定量：基因在不同組織中的表達差異、藥物療效考核點突變檢測SNP檢測與疾病相關的等位基因點突變檢測轉基因食品檢測轉基因生物又稱遺傳修飾生物（GeneticallyModifiedOrganisms，GMO）食物中轉基因成分規(guī)定：歐盟出臺轉基因產品的標識制度(1990)，規(guī)定0.9%閾值標準（2003)標準品：GMO生物與對應的非GMO生物按不同比例混合，提取DNA；選擇目標基因A(只有GMO生物表達)與內標基因B(在GMO和非GMO生物中等量表達)，分別擴增得到不同混合比例下的Cq值。材料RoundupReady大豆（RTC公司，IRMM-41050-56）普通非轉基因大豆從超市買來的測試樣品：大豆餅,豆制甜點和兩個牌子的大豆粉標準品的制備:

轉基因成分含量分別為0%,0.1%,0.5%,1%,2%和5%目標基因：EPSPS；內標基因：Lectin轉基因大豆檢測%GMO=A/B（A,EPSPS;B,lectin)log(%GMO)=log(A/B)=logA-logB=ΔC(q)*MDNAfromStandard/SamplePCRmixGMOprimersTUBE1TUBE2PCRmixLectinprimers轉基因大豆檢測Standards/SampleC(q)epspsC(q)Lectin?C(q)0ND22.6ND0.1ND22.6ND0.528.222.55.71.027.222.54.72.026.222.83.45.024.622.71.9SoyDessert24.622.42.1SoyFlourND22.2NDSoyBurger24.223.40.7y=-0.264x+1.202R2=0.998-0.40-0.200.000.200.400.600.800123456?C(q)LogpercentGMO轉基因大豆檢測結果Standards/Sample?C(q)%GMOSoyDessert2.14.40SoyFlourND<0.5SoyBurger0.7>5ERBB2

在乳腺腫瘤組織標本中的表達差異（雙標準曲線法/2-ΔΔc(q)

法）已知在50%的乳腺腫瘤樣本中，ERBB2表達異常，因此可以作為一個檢測標準;選用GAPDH作為內標基因FAM標記的ERBB2探針VIC標記的GAPDH探針雙標準曲線Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2樣品擴增：正常vs腫瘤PMT1-FAMdetection-ERBB2PMT2-VICdetection-GAPDH腫瘤腫瘤正常正常實驗結果MultiplexReactions:C(q)HealthyRNACarcinoma28.4027.3628.4627.1228.43±0.0426.24±0.17ERBB2表達MultiplexReactions:C(q)HealthyRNACarcinoma23.2722.8123.4122.8623.34±0.1022.83±0.03GAPDH表達實驗結果HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800ERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.0190.0110.0180.018/0.011＝1.6300.20.40.60.811.21.41.61.82HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpressionHealthyRNATumorRNA2-ΔΔc(t)

法HealthyRNAERBB2GAPDHΔC(t)28.4023.275.1328.4623.415.0528.43±0.0423.34±0.105.09±0.18CarcinomaRNAERBB2GAPDHΔC(t)27.3622.814.5527.1222.864.2626.24±0.1722.83±0.034.41±0.21ΔΔC(t)=4.41-5.09=-0.68±0.182-ΔΔc(t)=1.41~1.82結果與雙標準曲線法相近SNP檢測SNP（單核苷酸多態(tài)性）人類基因組中的單堿基突變大約93%的基因至少含有一個SNPSNP分型的意義可能引起疾病或疾病的易感性作為基因缺陷型疾病的標志物SNP的漂變可作為進化研究手段藥物的抗藥性研究SNP檢測AACCTGCATAATGCCAG AACCTGCAGAATGCCAG單核苷酸多態(tài)性SingleNucleotidePolymorphismsFAM=等位基因II純合子VIC=等位基因I純合子FAM+VIC=等位基因I、II雜合子SNP檢測（等位基因分型）