Rubisco及其活化酶抗體的制備及其在作物中的應(yīng)用

Rubisco及其活化酶抗體的制備及其在作物中的應(yīng)用研究生：陳相輝學(xué)號：01143 指導(dǎo)老師：王忠教授（揚州大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)系，揚州225009）Rubisco（1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶，ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase）是光合碳代謝中的關(guān)鍵酶，處于光合碳還原和光合碳氧化這兩個方向相反但又相互連鎖的循環(huán)的交叉點上，調(diào)節(jié)著光合作用和光呼吸的代謝比例，其活性大小對光合速率起著決定性作用。1、 選題依據(jù)Rubisco和Rubisco活化酶的特性一直是光合作用研究的熱點問題，如何提高作物中這兩種酶的含量和活性也一直是個懸而未解決的難題。目前，國內(nèi)外多以煙草、菠菜作為研究Rubisco和Rubisco活化酶的材料，涉及小麥和水稻等作物方面的內(nèi)容較少，尤其有關(guān)小麥Rubisco活化酶的研究仍然是國內(nèi)外研究中的空白。2、 研究目的和意義本試驗擬用小麥為研究對象，研究Rubisco及其活化酶的酶學(xué)特性和調(diào)節(jié)機制。在研究方法上，酶的分離和提純方法采用最新技術(shù)，并有所改進；而在含量測定上，將免疫學(xué)技術(shù)與植物生理生化技術(shù)相結(jié)合，采用抗體抗原特異性反應(yīng)的原理來測定，這也為免疫學(xué)在植物上的進一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。在研究內(nèi)容上，不僅研究自然生長狀態(tài)下，Rubisco及其活化酶的含量和活性，而且設(shè)置多重處理，研究不同處理條件下和C3、C4植株體內(nèi)Rubisco，Rubisco活化酶含量、活性的變化，并結(jié)合光合速率、ATP、RuBP含量、葉綠素含量的測定，探討它們之間的內(nèi)在相關(guān)性。本實驗創(chuàng)新之處是利用免疫化學(xué)技術(shù)提供一個快速、準確而簡易的定量測定Rubisco和Rubisco活化酶的方法，從而可以預(yù)測光合潛力和估計由于礦質(zhì)營養(yǎng)、水分供給、光照、植物生長調(diào)節(jié)素和基因調(diào)控發(fā)生變化而引起光合作用和產(chǎn)量的變化。進一步對Rubisco和Rubisco活化酶做深入的研究。3、 研究內(nèi)容3.1、 Rubisco和Rubisco活化酶的提取和純化3.2、 Rubisco和Rubisco活化酶抗體的制備3.3、 Rubisco和Rubisco活化酶ELISA標準曲線的制定3.4、 C3、C4植物中Rubisco和Rubisco活化酶含量比較及其與光合作用的關(guān)系3.5、 光暗處理對小麥光合作用及Rubisco、Rubisco活化酶的影響3.6、 不同施氮水平對小麥光合速率和Rubisco、Rubisco活化酶的影響3.7、 Rubisco和Rubisco活化酶單克隆抗體制備初探4、材料和方法注射器JTTOC\o"1-5"\h\z4.1材料 與％,1.1.1植物材料 二、、揚麥5號(’liiiicumaestivumL.CV.Yangmi :.5),田間自然生長，苗期葉片用于酶的提純，后期旗葉用于光合速率、Rubisco活性和含量的測 " '定。 圖1新西蘭大白兔4.1.2動物材料健康的新西蘭大白兔，體重2?3公斤，首先免疫三聯(lián)苗(兔瘟、巴氏桿菌病、魏氏梭菌病)，一周后進行試驗。4.2試劑與儀器液相層析收集系統(tǒng),Bio-Rad垂直板電泳系統(tǒng)，高速冷凍離心機,Gene-System紫外分光光度計；SephadexG-25,DEAE-纖維素(DEAE-TOYOPEARL-650M,日本)，PMSF,Benzamidine，F(xiàn)reund氏完全和不完全佐劑，ATP，Leupetine，HEPES，DTT，已純化且具有活性的Rubisco為本實驗室保存。Rubisco活化酶的純化取100g新鮮小麥葉片，放入液氮中速凍10min，取出后先在碾缽中碾碎，再加入2g不溶性PVP和少量石英砂以及300mLRubisco活化酶提取液(50mmol/LHEPES-KOHPH7.0,1mmol/LEDTA,5mmol/LMgCl2,0.4mmol/LATP,15mmol/LDTT,1mmol/LPMSF,2mmol/LBenzamidine,0.01mmol/LLeupeptin)。將混合物在0°C下?lián)v碎15~20min，勻漿后用4層紗布過濾，30000g離心45min，上清液用飽和(NH4)2SO4(pH7.0)鹽析，取20%~35%的蛋白質(zhì)段，沉淀用5mL含35%飽和(NH4)2SO4的緩沖液(20mmol/LHEPES-KOHpH7.0,0.4mmol/LATP,10mmol/LDTT,100mmol/LKCl)懸浮，10000g離心10min后，沉淀用3mL不含(NH4)2SO4的緩沖液溶解，離心，經(jīng)SephadexG-25(1.5X20cm)脫鹽，用緩沖液平衡和洗脫，收集到的蛋白質(zhì)峰在液N2中過夜。次日，沉淀溶解后20000g離心10min，上清液經(jīng)DEAE-纖維素(DEAE-TOYOPEARL-650M)陰離子交換柱(1.5X20cm)，先用25mL洗脫液(20mmol/LHEPES-KOHpH7.0,4mmol/LDTT)洗脫，然后用60mL含0~0.5mol/LKCl的洗脫液梯度洗脫。洗脫速度為1mL/min，每1mL收集一管，蛋白質(zhì)峰進行活性和純度鑒定。得到的蛋白質(zhì)峰加ATP至1mmol/L，經(jīng)SDS檢驗酶純度后，用于酶特性分析。其余酶液先用液氮保存，后轉(zhuǎn)入-70C低溫冰箱中，用作制備Rubisco活化酶抗體。為了減少酶的失活，純化過程均在4C下進行。Rubisco活化酶的SDS分析配置12%分離膠，3.2%濃縮膠，將20pl樣品與4pl的6倍上樣緩沖液混合煮沸3min，自然冷卻后，上樣。在120V、40mA條件下恒壓電泳2.5h。電泳結(jié)束后用含2%考馬斯亮蘭(G250)染色液染色30min，7.5%冰醋酸和5%的甲醇脫

色液過夜脫色。Rubisco活化酶抗體的制備按Sambrood[50]等皮下多位點分數(shù)次注射法免疫大白兔。第一次免疫將0.5mL抗原與0.5mLFreund氏完全佐劑充分混合制成油包水乳劑，皮下注射于每只兔子背部多個部位，每個部位0.20?0.25mL,4?5點。半個月之后，進行第二次免疫，方法同第一次，只是將Freund氏完全佐劑換成Freund氏不完全佐劑即可。以后每隔兩周進行一次皮下多點注射免疫，方法與第二次完全一樣。三免后可從耳緣靜脈采血，檢測抗血清滴度，如滿足實驗要求，則通過心臟采血，全血以10000rpm離心1min，后放置于4°C冰箱中過夜，次日吸取其上清即可用于實驗。如滴度太低不滿足需要，則可繼續(xù)以第二次免疫方法進行加強免疫。Rubisco抗體的制備方法類同于活化酶抗體的制備，只是將抗原換成Rubisco即可。4.7蛋白質(zhì)含量的測定用紫外分光光度法，分別測定260nm、280nm吸光度。以O(shè)D280X1.45-OD260X0.74計算出蛋白質(zhì)濃度（mg?mL-1）。4.8ELISA法測定酶含加KubiMo抗慷JiUKubiscofA體加酵標第二抗體加磋物抗血加KubiMo抗慷JiUKubiscofA體加酵標第二抗體加磋物抗血igg 血3房珈抗體Ruhjsco抗體與 酶促底物成附于裁體表新與抗原結(jié)合 酵標策二抗體站肖顯色反應(yīng)用一系列已知濃度的標準抗原（Rubisco和Rubisco活化酶）與制備的Rubisco和Rubisco活化酶的抗體反應(yīng)，制成一條標準曲線，再將待測樣品與原的含量。之相比較，求得樣品中抗圖2之相比較，求得樣品中抗圖2ELISA法實驗原理4.9蛋白質(zhì)含量的測定依Folin-酚試劑法（薛應(yīng)龍，1985）測定，以BSA作標準曲線。4.10光合速率和葉綠素含量的測定采用美國CID公司的CID31OPC便攜式光合速率測定儀測光合速率；用日本產(chǎn)SPAD型葉綠素計測定，用綠色程度表示劍葉葉綠素的相對含量。5、實驗進展提取和純化了Rubisco和Rubisco活化酶。6、研究計劃6.1、 Rubisco和Rubisco活化酶抗體的制備6.2、 Rubisc