9基因工程抗體和抗體工程

第五五節(jié)節(jié)抗抗體體工工程程抗體體研研究究進(jìn)進(jìn)展展3個(gè)個(gè)階階段段：：①1890年年白白喉喉抗抗毒毒素素，，多多克克隆隆抗抗體體；；②1975年年雜雜交交瘤瘤技技術(shù)術(shù)單單克克隆隆抗抗體體；；③1994年年基基因因工工程程抗抗體體；；Cgenescodefortheconstantregionsofimmunoglobulinproteinchains.Vgeneissequencecodingforthemajorpartofthevariable(N-terminal)regionofanimmunoglobulinchain.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFigure24.4Heavyandlightchainscombinetogenerateanimmunoglobulinwithseveraldiscretedomains.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFigure24.4Heavyandlightchainscombinetogenerateanimmunoglobulinwithseveraldiscretedomains.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesTable24.1EachimmunoglobulinfamilyconsistsofaclusterofVgeneslinkedtoitsCgene(s).ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFamilyVGenesCGenesManMouseManMouseLambda<3002>64Kappa<300~100011Heavy~300>100098Figure24.5ThelambdaCgenesegmentisprecededbyaJsegment,sothatV-Jrecombinationgeneratesafunctionallambdalight-chaingene.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFigure24.6ThekappaCgenesegmentisprecededbymultipleJsegmentsinthegermline.V-JjoiningmayrecognizeanyoneoftheJsegments,whichisthensplicedtotheCgenesegmentduringRNAprocessing.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFigure24.7Heavygenesareassembledbysequentialjoiningreactions.FirstaDsegmentisjoinedtoaJsegment;thenaVgenesegmentisjoinedtotheDsegment.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFigure24.8ThelambdafamilyconsistsofVgenesegmentslinkedtoasmallnumberofJ-Cgenesegments.ThediversityofgermlineinformationFigure24.9ThehumanandmousekappafamiliesconsistofVgenesegmentslinkedto5JsegmentsconnectedtoasingleCgenesegment.ThediversityofgermlineinformationFigure24.10Asinglegeneclusterinmancontainsalltheinformationforheavy-chaingeneassembly.ThediversityofgermlineinformationFigure24.12Consensussequencesarepresentininvertedorientationateachpairofrecombiningsites.Onememberofeachpairhasaspacingof12bpbetweenitscomponents;theotherhas23bpspacing.RecombinationbetweenVandCgenesegmentsgeneratesdeletionsandrearrangementsFigure24.13Breakageandreunionatconsensussequencesgeneratesimmunoglobulingenes.RecombinationbetweenVandCgenesegmentsgeneratesdeletionsandrearrangementsFigure15.8Reciprocalrecombinationbetweendirectrepeatsexcisesthematerialbetweenthem;eachproductofrecombinationhasonecopyofthedirectrepeat.RecombinationbetweenVandCgenesegmentsgeneratesdeletionsandrearrangementsFigure15.9Reciprocalrecombinationbetweeninvertedrepeatsinvertstheregionbetweenthem.一、噬菌體抗抗體庫技術(shù)的的

基本方法法⒈獲取目的基基因⒉抗體庫技術(shù)術(shù)的載體⒊淘篩⒋表達(dá)與鑒定定它是在PCR技術(shù)和PhageDisplay的基礎(chǔ)上上實(shí)現(xiàn)的。其其過程是把用用PCR法得得到的抗體基基因插入絲狀狀噬菌體的DNA，與噬噬菌體外殼蛋蛋白的基因相相連，在輔助助噬菌體的幫幫助下，噬菌菌粒包裝成絲絲狀噬菌體，，抗體分子通通過與PⅢⅢ或PⅧ相連連，在噬菌體體表面的一端端或分散分布布，然后可直直接對(duì)噬菌體體表面的抗體體分子進(jìn)行篩篩選。噬菌體抗體庫庫技術(shù)1990年McCafferty等成功地建建立了噬菌體體表面展示系系統(tǒng)，通過將將抗溶菌酶單單鏈抗體基因因克隆于fd噬菌體基因因3的下游，，使ScFv以融合蛋白白的形式展示示于噬菌體表表面，利用親親和層析，兩兩輪富集達(dá)106倍。該技術(shù)的的成功給抗體體基因的篩選選工作帶來了了革命性的變變革。噬菌體表面展展示系統(tǒng)(phagesurfacedisplaysystem)噬菌體表面展展示文庫技術(shù)術(shù)的要點(diǎn):外源基因表達(dá)達(dá)多肽以融合合蛋白形式展展示在外殼蛋蛋白N端將基因組合文文庫插入噬菌菌體編碼膜蛋蛋白的基因g3或g8的先導(dǎo)系系列的緊靠下下游隨機(jī)克隆入相相應(yīng)載體形成成組合文庫從免疫或未被被免疫的B細(xì)細(xì)胞中PCR擴(kuò)增抗體全全套基因片段段用固相化抗原原經(jīng)“親和結(jié)結(jié)合一洗脫一一擴(kuò)增”數(shù)個(gè)個(gè)循環(huán)直接、、方便、簡(jiǎn)捷捷、高效地篩篩選出表達(dá)特特異性好、親親和力強(qiáng)的抗抗體噬菌體庫庫。使翻譯出的抗抗體分泌到細(xì)細(xì)菌的質(zhì)周腔腔內(nèi)，形成游游離的抗體片片段，經(jīng)過純純化即可獲得得目的抗體。。篩選到的噬菌菌體再將基因因g3或g8切除后，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌，該項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)優(yōu)點(diǎn):將抗體的基因型型和表型緊密密聯(lián)系起來;可繞過雜交瘤瘤技術(shù)，不需需要復(fù)雜的基基因工程技術(shù)術(shù);抗體基因篩選選的范圍廣;技術(shù)穩(wěn)定、可可靠、生產(chǎn)周周期短;可規(guī)規(guī)模化生產(chǎn);適用范圍廣，，既可用于抗抗體制備，也也適用于其它它蛋白如激素素、酶、藥物物、隨機(jī)多肽肽等的生產(chǎn)。。噬菌體抗體庫庫技術(shù)的發(fā)展展具有很大優(yōu)優(yōu)越性。它簡(jiǎn)簡(jiǎn)單易行，篩篩選容量大，，效率高，繞繞過了細(xì)胞融融合及免疫等等步驟，而且且在表型一基基因型的統(tǒng)一一和識(shí)別一增增殖過程上模模擬了B細(xì)胞胞的成熟過程程，從而在實(shí)實(shí)際應(yīng)用上具具有很大意義義。二、噬菌體抗抗體庫技術(shù)的的

特點(diǎn)⒈模擬天然全全套抗體庫⒉避開了人工工免疫和雜交交瘤技術(shù)⒊可獲得高親親和力的人源源化抗體單克隆抗體噬噬菌體抗體雜雜交交瘤技術(shù)展展示技術(shù)宿主細(xì)胞:雜雜交瘤細(xì)細(xì)菌篩選范圍:~103107109時(shí)間:幾幾個(gè)個(gè)月幾幾周周操作:繁繁雜相相對(duì)簡(jiǎn)單免疫:必必須可可避免人源抗體:+費(fèi)用:高高低低生產(chǎn)量:有有限無無限基因獲取:再再克隆直直接接應(yīng)用前景:有有限限不不可估三、基因工程程抗體表達(dá)⒈原核細(xì)胞表表達(dá)⒉真核細(xì)胞表表達(dá)⒊轉(zhuǎn)基因植物物表達(dá)⒋轉(zhuǎn)基因動(dòng)物物表達(dá)第六節(jié)抗抗體診斷試劑劑一、血清學(xué)鑒鑒定用的抗體體類試劑⒈鑒定病原菌菌的抗體試劑劑⑴常用診斷血血清的品種和和用途①沙門氏菌屬屬診斷血清②志賀氏菌屬屬診斷血清③病原性大腸腸埃希氏菌診診斷血清⑵診斷斷血清清的制制備步步驟①制備備細(xì)菌菌抗原原②免疫疫動(dòng)物物和制制備抗抗體血血清⑶診斷斷血清清診斷斷方法法⒉乙型型肝炎炎病毒毒表面面抗原原的反向被被動(dòng)血血凝診診斷試試劑⒊妊娠娠診斷斷試劑劑⒋抗ABO血型型系統(tǒng)統(tǒng)血清清二、免免疫標(biāo)標(biāo)記技技術(shù)用用的抗抗體類類試試劑⒈熒光光抗體體診斷斷試劑劑⑴熒光光抗體體的制制備⑵免疫疫熒光光測(cè)定定方法法⒉免疫疫酶抗抗體診診斷試試劑⑴免疫疫酶染染色法法用抗抗體診診斷試試劑⑵酶免免疫測(cè)測(cè)定用用抗體體診斷斷試劑劑①HBsAg酶酶標(biāo)診診斷試試劑②HBeAg酶酶標(biāo)診診斷試試劑③HAVAg（（甲型型肝炎炎病毒毒抗原原）酶標(biāo)診診斷試試劑④測(cè)定定HIV（（人免免疫缺缺陷病病毒））抗原的酶酶標(biāo)抗抗體診診斷試試劑⑤甲胎胎蛋白白（AFP）酶酶標(biāo)抗抗體診診斷試劑劑⑥癌胚胚抗原原（CEA）的的酶標(biāo)標(biāo)抗體體診斷試試劑⒊放射射免疫疫用抗抗體診診斷試試劑放射免免疫技技術(shù)是是將放放射性性核素素分析析的高高度靈靈敏性性與抗抗原抗抗體反反應(yīng)的的特異異性結(jié)結(jié)合起起來建建立的的檢測(cè)測(cè)技術(shù)術(shù)。放射性性核素素標(biāo)記記抗體體的方方法：：①氯胺胺-T法②Iodogen氏氏法抗原的的測(cè)定定有：：①夾心心法②間接接法③竟?fàn)帬?zhēng)法3.競(jìng)競(jìng)爭(zhēng)法法Ag※Ag※Ab+AbAg(標(biāo)本本)(定定量)AgAbEE終止液液標(biāo)本本酶標(biāo)標(biāo)抗抗體體底物物顯色色顯色色固相相固相相標(biāo)本本酶標(biāo)標(biāo)二二抗抗底物物1.夾夾心心法法2.間間接接法法①HBsAg放放射射性性核核素素標(biāo)標(biāo)記記抗抗體體診斷斷試試劑劑②HBeAg放放射射性性核核素素標(biāo)標(biāo)記記抗抗體體診斷斷試試劑劑③HAV抗抗原原放放射射性性核核素素標(biāo)標(biāo)記記抗抗體體診斷斷試試劑劑④AFP放放射射性性核核素素標(biāo)標(biāo)記記抗抗體體診斷斷試試劑劑⑤CEA放放射射性性核核素素標(biāo)標(biāo)記記抗抗體體診斷斷試試劑劑常用用標(biāo)標(biāo)記記抗抗體體試試劑劑有有：：三、、導(dǎo)導(dǎo)向向診診斷斷藥藥物物放射射性性核核素素標(biāo)標(biāo)記記抗抗體體腫瘤瘤放放射射免免疫疫顯顯像像放射射免免疫疫顯顯像像優(yōu)優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)：：①在在體體內(nèi)內(nèi)確確切切腫腫瘤瘤定定位位作作用用，，準(zhǔn)準(zhǔn)確確性性達(dá)達(dá)90%，，靈靈敏敏度度達(dá)達(dá)100%。。②在在體體內(nèi)內(nèi)可可檢檢出出0.5cm大大小小的的病病灶灶，，并并可可檢檢出出肺肺腦腦的的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移灶灶。。③小小分分子子抗抗體體易易到到達(dá)達(dá)腫腫瘤瘤部部位位，，可顯顯著著提提高高N/NT值值。。④抗抗體體在在腫腫瘤瘤部部位位可可保保留留6～～9日日⑤能觀觀擦擦抗抗體體在在血血中中的的半半衰衰期期和和可能能出出現(xiàn)現(xiàn)的的不不良良反反應(yīng)應(yīng)。。放射射免免疫疫顯顯像像定定位位技技術(shù)術(shù)將抗抗腫腫瘤瘤單單克克隆隆抗抗體體（（Ab））與與二二乙乙基基三三胺胺五五乙乙酸酸（（DTPA））在在體體外外偶偶聯(lián)聯(lián)成成Ab-DTPA，，再再注注入入體體內(nèi)內(nèi)后后，，就就能能與與體體內(nèi)內(nèi)組組織織相相結(jié)結(jié)合合。。由由于于抗抗體體分分子子量量大大，，需需3天天完完成成。。3天天后后注注入入放放射射性性核核素素In-113M（（半半衰衰期期100m）），，因因DTPA是是重重金金屬屬離離子子絡(luò)絡(luò)合合劑劑，，所所以以In-113M可可以以結(jié)結(jié)合合到到DTPA分分子子上上，，使使腫腫瘤瘤組組織織顯顯像像。。這這一一過過程程在在2小小時(shí)時(shí)內(nèi)內(nèi)可可完完成成。。建立立預(yù)預(yù)定定位位技技術(shù)術(shù)需需解解決決3個(gè)個(gè)問問題題：：①抗抗體體在在腫腫瘤瘤組組織織滯滯留留要要7天天以以上上。。②②Ab-DTPA偶偶聯(lián)聯(lián)物物比比較較穩(wěn)穩(wěn)定定；；③內(nèi)內(nèi)源源性性金金屬屬離離子子對(duì)對(duì)DTPA的的封封閉閉作用用要要小小。。第六節(jié)抗抗體體治療藥藥物以抗體為為載體的的導(dǎo)向治治療藥物物，還不不成熟。。一、放射射性核素素標(biāo)記的的抗體治治療藥物物抗體作為為放射性性核素的的導(dǎo)向載載體，標(biāo)標(biāo)記操作作簡(jiǎn)便用用量小。。放射性性核素標(biāo)標(biāo)記的抗抗體對(duì)腫腫瘤細(xì)胞胞殺傷較較大。二、抗癌癌藥物偶偶聯(lián)的抗抗體藥物物⒈常用的的抗癌藥藥物氨甲喋呤呤（MTX）、、阿霉素素（ADM）、、絲裂霉霉素（MMC））等。以以人血漿漿白蛋白白作為中中間載體體，可明明顯提高高每分子子抗體所所攜帶的的MTX量，使使體外細(xì)細(xì)胞毒性性體高二二倍。⒉抗體類類藥物逆逆轉(zhuǎn)耐藥藥性腫瘤細(xì)胞胞對(duì)抗原原藥物可可產(chǎn)生多多藥耐藥藥性（MDR））。MDR是是由基因因調(diào)控的的，其編編碼蛋白白稱為P糖蛋白白，其中中P170是與與腫瘤耐耐藥相關(guān)關(guān)的主要要蛋白，，由Mdr1基基因編碼碼，1280氨氨基酸殘殘基，分分子量170K。認(rèn)為P蛋蛋白是ATP酶酶依賴性性藥泵，，藥物進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞胞后與P蛋白結(jié)結(jié)合，利利用ATP水解解釋放的的能量將將藥物泵泵出胞外外，使胞胞內(nèi)藥物物蓄積減減少，因因而