代謝工程概述

主要參參考書書代謝工工程，，趙學學明等等譯，，化學學工業(yè)業(yè)出版版社，，北京京。2003年年12月Biotechnology,2nded.Vol.1;BiologicalFundamentals.RehmH-JBBiotechnology,3ndedVol.3;Bioprocessing.RehmH-JB途徑工工程，，張惠惠展，，2003基因工工程原原理，，吳乃乃虎，，2004代謝工工程，，張蓓蓓等，，天津津大學學出版版社，，200301緒緒論代代謝謝工程程概述述授課教教師：：李強強本章內內容§1.1代代謝工工程的的產生生和概概念的的演變變§1.2代代謝工工程的的研究究內容容§1.3代代謝謝工程程的應應用領領域和和前景景第一節(jié)節(jié)代謝工工程的的產生生和概概念的的演變變現代生生物技技術手手段主主要包包括基基因工工程(GeneEngineering)、、細胞胞工程程(CellEngineering)、發(fā)發(fā)酵工工程(FermentationEngineering)、、酶工工程(EnzymeEngineering)和和生化化工程程(BiochemicalEngineering)，，現代代生物物技術術在化化工、、醫(yī)藥藥衛(wèi)生生、農農林牧牧漁、、輕工工食品品、能能源和和環(huán)境境等領領域都都將發(fā)發(fā)揮重重要作作用，，可促促進傳傳統(tǒng)產產業(yè)的的改造造和新新型產產業(yè)的的形成成，對對人類類社會會產生生深遠遠影響響。其其中發(fā)發(fā)酵工工程是是生物物技術術的重重要組組成部部分，，是生生物技技術轉轉化成成產品品的重重要環(huán)環(huán)節(jié)。。20世紀紀90年代代提出出的代代謝工工程發(fā)發(fā)展迅迅速，，被視視為繼繼傳統(tǒng)統(tǒng)的蛋蛋白質質多肽肽單基基因表表達（（第一一代基基因工工程））、基基因定定向突突變（（第二二代基基因工工程））之后后的第第三代代基因因工程程。代謝研研究的的產生生和發(fā)發(fā)展歷歷史微生物物發(fā)酵酵已經經有幾幾千年年的歷歷史。。早在2000年年以前前，人人們就就開始始利用用微生生物進進行白白酒、、黃酒酒、清清酒的的發(fā)酵酵，此此時的的發(fā)酵酵為天天然發(fā)發(fā)酵時時代。。20世世紀40年年代，，隨著著抗生生素青青霉素素的發(fā)發(fā)酵生生產的的大規(guī)規(guī)模進進行，，開始始了現現代發(fā)發(fā)酵工工業(yè)時時代。。通過過自然然選擇擇的方方法，，人們們用10-6的突變幾幾率來篩篩選所謂謂的高產產菌株。。由于沒有有代謝控控制發(fā)酵酵理論作作為指導導，直到到20世世紀60年代現現代發(fā)酵酵工業(yè)仍仍處于盲盲目階段段。1957年，日日本的木木下等人人開始了了谷氨酸酸的發(fā)酵酵研究。。隨著各各國對代代謝發(fā)酵酵理論的的深入研研究，許許多國家家轉向發(fā)發(fā)酵菌株株本身的的研究，，獲得了了許多的的氨基酸酸高產菌菌株。隨后，核核酸類物物質發(fā)酵酵生產菌菌也以代代謝控制制發(fā)酵理理論為指指導進行行選育，，并奮起起直追成成為后起起之秀。。早期的代代謝研究究主要內內容*早期研研究中側側重應用用過程中中采用的的方法及及所達到到的目標標，通常常是對細細胞特定定的代謝謝途徑進進行改造造。**代謝謝控制發(fā)發(fā)酵就是利用用遺傳學學的方法法或生物物化學方方法，人人為地在在DNA分子水水平上改改變和控控制微生生物的代代謝，使使目的產產物大量量的生成成、積累累的發(fā)酵酵。代謝謝控制發(fā)發(fā)酵的核核心為：：解除微微生物代代謝控制制機制，，打破微微生物正正常的代代謝調節(jié)節(jié)，人為為地控制制微生物物的代謝謝。隨著代謝控制制發(fā)酵理論的的日臻完善，，目前已發(fā)展展出一個重要要的研究分支支——代謝工工程。它是近近年來分子生生物學、生物物化學、化學學工程學和計計算機科學的的發(fā)展與交差差的產物，從從而使生物技技術突飛猛進進的發(fā)展，使使有關的研究究進入了細胞胞水平。從細細胞的代謝途途徑出發(fā)，運運用工程學原原理進行代謝謝調控，使之之向產物積累累的方向發(fā)展展，由此創(chuàng)建建了一個新興興的領域，即即“代謝工程程”。途徑工程Pathwayengineering利用DNA重組技術修飾各種代謝途徑，提高特定代謝物的產量1988，Macquitty代謝工程Metabolicengineering利用DNA重組技術優(yōu)化細胞酶活、運輸和調控功能，提高細胞活力1991，Bailey代謝途徑工程Metabolicpathwayengineering生化途徑的修飾、設計與構建1991，Tongetal代謝工程Metabolicengineering利用DNA重組技術對代謝進行目的性修飾1993，Cameron代謝工程/代謝設計Pathwayengineering/Metabolicdesign改造細胞代謝途徑，提高提高天然最終產物產量或合成新產物1994，pieperberg**代謝工程程概念演變代謝工程Metabolicengineering對生化反應的代謝網絡進行目的性修飾1994，Gregory代謝工程Metabolicengineering為達到所需目標對活細胞的代謝途徑進行修飾1996，william代謝工程Metabolicengineering利用分子生物學原理系統(tǒng)分析代謝途徑，設計合理的遺傳修飾戰(zhàn)略，從而優(yōu)化細胞生物學特性1999，koffasl**代謝工程程的現代概念念代謝工程也被被人們成為““途徑工程””，它屬于基基因工程的一一個重要的分分支。它應用用重組DNA技術和應用用分析生物學學相關的遺傳傳手段，進行行有精確目標標的遺傳操作作，改變酶的的功能輸送體體系的功能，，以改進細細胞某些方面面的代謝活性性的整套操作作（包括代謝謝分析、代謝謝設計、遺傳傳操作、目的的代謝活性的的實現）是一一種生物化學學反應代謝網網絡有目的的的修飾。代謝工程的一一些基本定義義底物：培養(yǎng)基基質中的化合合物，是能被被細胞進一步步代謝或直接接利用構成細細胞組分。碳碳源、氮源、、能源物質以以及滿足細胞胞功能必須的的各種礦物質質元素均屬于于細胞代謝的的底物。代謝產物：由由細胞合成的的化合物，可可以是初級代代謝產物（二二氧化碳、乙乙醇等），也也可以是次級級代謝產物或或者蛋白質。。生物基質要素素：構成生物物質大分子池池的一類物質質，包括DNA、RNA、蛋白質等等代謝工程的一一些基本定義義代謝流和碳骨骨架物質流：：代謝物在代代謝途徑中流流動形成代謝謝流。在代謝謝工程領域代代謝流往往是是指骨架物質質流。代謝主流：在在一定的培養(yǎng)養(yǎng)條件下，代代謝物再代謝謝網絡中流動動，流量相對對集中的代謝謝流叫做該條條件下的代謝謝主流。代謝謝途徑的延伸伸和改變都會會改變代謝主主流，從而實實現新基質的的利用和新產產品的開發(fā)。。代謝主流的的測定是代謝謝工程的重要要組成部分。。代謝工程的一一些基本定義義載流途經：代代謝主流流經經的代謝途徑徑為主要載流流途經，簡稱稱載流途經。。在代謝工程程研究中載流流途經是指碳碳流在代謝網網絡中通過的的主要途徑。。代謝主流的變變動性和選擇擇性：生物細細胞的代謝主主流處于不斷斷的變化之中中，其方向、、流量甚至代代謝主流的載載流途經都可可能發(fā)生變化化。這就是代代謝主流的變變動性和代謝謝主流對代謝謝網絡途徑的的選擇性。這這種變動和選選擇的根據在在于生物細胞胞的遺傳物質質，選擇的原原因在于細胞胞所處的環(huán)境境條件的變化化。代謝工程的一一些基本定義義代謝途徑定義義為：一連串串可以進行的的并可觀測的的生物化學反反應步驟，這這些反應步驟驟是以指定的的一組輸入和和輸出代謝物物所連結。代謝工程的一一些基本定義義代謝網絡：在在代謝過程中中,通過特定定的生物化學學反應,一些些物質被分解解,從而為基基本的生命過過程提供能量量,同時合成成另一些生命命所必需的物物質。發(fā)生在在某物種的活活細胞內所有有代謝反應構構成了此物種種的代謝網絡絡。對蛋白質層次次的代謝網絡絡來說，一個個代謝物分子子就是一個節(jié)節(jié)點，而節(jié)點點之間的連結結則是生化反反應。大部分分的分子只參參加一種或兩兩種反應，但但少數分子參參與許多反應應，它們實際際上就是代謝謝流的集散中中心或通用代代謝物代謝工程的一一些基本定義義代謝通量定義義為：輸入代代謝物反應生生成輸出代謝謝物的速率。。胞內代謝通量量的確定稱為為代謝通量分分析（metabolicfluxanalysis，MFA）），其在代代謝工程處于于中心地位。。代謝工程的一一些基本定義義代謝控制分析析(MCA)*ＭetabolicControlAnalysis，簡稱ＭＭＣＡ代謝工程的一一個主要目標標就是對代謝謝通量控制的的理解。其是通過途徑徑中酶的活性性、代謝物、、效應物和其其它參數所施施加的通量控控制程度進行行定量表述。。代謝控制的關關鍵參數確定定以后，人們們需要實施這這些變化從而而最有效地達達到預定目標標。在實施通量控控制的策略中中，無論采用用哪種路線，，為獲得最佳的的結果，都應應將基因修飾飾和環(huán)境條件件改變結合起起來使用。第二節(jié)代謝工程的研研究內容代謝工程的實實質在于對代代謝網絡進行行定量分析，，并且在此基基礎上進行代代謝改造（代代謝網絡重組組），以最大大限度地提高高代謝產物的的產率。主要內容：生物合成相關關代謝調控和和代謝網絡理理論代謝流的定量量分析代謝網絡的重重新設計中心代謝作用用機理及相關關代謝分析基因操作代謝工程研研究的目的的通過重組DNA技術術構建具有有能合成目目標產物的的代謝網絡絡或具有高高產能力的的工程菌(細胞株、、生物個體體)并用于于生產是代代謝工程研研究的主要要目的。代謝網絡理理論代謝網絡理理論是把細細胞的生化化反應以網網絡整體而而不是孤立立地考慮。。細胞代謝謝的網絡由由上萬種酶酶催化的系系列反應系系統(tǒng)、膜傳傳遞系統(tǒng)、、信號傳遞遞系統(tǒng)組成成，并且既既受精密調調節(jié)，又彼彼此互相協(xié)協(xié)調。代謝網絡理理論是代謝謝工程研究究的基礎代謝分析代謝分析是是代謝工程程的重要組組成部分，，它涉及代代謝流的定定量和定向向、研究細細胞內代謝謝物濃度的的反應工程程方法以及及細胞內穩(wěn)穩(wěn)態(tài)流分析析等代謝工程的的實質代謝工程最最重要的貢貢獻在于其其強調在胞胞內條件下下代謝通量量及其調控控。代謝工程的的實質是：：將通量及及其控制進進行量化的的方法與分分子生物學學技術結合合起來，用用以執(zhí)行所所建議的基基因修飾任任務。當反反復利用代代謝工程方方法時，它它就為在很很廣范圍內內系統(tǒng)改進進細胞的性性質提供了了一種強有有力的方法法。通量是細胞胞生理學的的一個基本本決定因素素，也是代代謝途徑中中最重要的的參數。代謝工程與與隨機誘變變的區(qū)別盡管定向性性從某種意意義上來講講是所有菌菌種改進工工作的固有有特性，但但是代謝工程與與隨機誘變變相比，其其工作焦點點致力于定定向性，以以致其在目目標酶的選選擇、實驗驗設計以及及數據分析析等方面都都起著重要要的作用。。另一方面，，細胞的定定向改進應應解釋為合合理的途徑徑設計與修修飾，因此此在這個意意義上說，，代謝工程程與隨機誘誘變是完全全不同的。。實際上,通過隨機機誘變而得得到的性能能優(yōu)良的菌菌株能夠作作為關于途途徑結構與與控制方面面重要信息息的來源，，這可經由由反向代謝謝工程獲取取。代謝工程也也包括兩個個明確的步步驟：即分分析與合成成。因為代代謝工程是是隨著DNA重組而而出現的可可行技術，，所以最初初代謝工程程幾乎都集集中于這個個領域的合合成方面:如在各種種宿主細胞胞中新基因因的表達、、內源酶的的擴增、基基因的缺失失或酶活性性的調節(jié)、、轉錄的或或酶的解除除調控等。。因此，代代謝工程在在很大程度度上曾是應應用分子生生物學的技技術體現，，而很少帶帶有工程方方面的內容容。*代謝工程程的主要特特征代謝工程的的主要特征征就是利用用DNA重重組技術，，重建代謝謝網絡，改改變代謝流流及分支代代謝速度，，以改進代代謝產物及及蛋白類產產品，由于于外源DNA的引入入擴展了固固有的代謝謝途徑，獲獲得了新的的化學物質質。改變轉轉化蛋白的的過程，減減少不必要要的廢物。。**代謝工工程研究的的主要問題題提高細胞已已有的代謝謝途徑中天天然產物的的產量改變細胞已已有代謝途途徑，合成成新產物對不不同同細細胞胞的的代代謝謝途途徑徑進進行行整整合合，，構構建建全全新新的的代代謝謝途途徑徑優(yōu)化化細細胞胞的的生生物物學學特特性性，，如如生生長長速速率率、、耐耐受受性性等等。。代謝謝工工程程的的研研究究手手段段1.采采用用遺遺傳傳學學手手段段的的遺遺傳傳操操作作（1））基基因因工工程程技技術術的的應應用用（2））常常規(guī)規(guī)誘誘變變技技術術的的應應用用2.生生物物合合成成途途徑徑的的代代謝謝調調控控（1））生生物物合合成成中中間間產產物物的的定定量量生生物物測測定定（2））共共合合成成法法在在生生物物合合成成中中的的應應用用（3））酶酶的的誘誘導導合合成成和和分分解解代代謝謝產產物物阻阻遏遏（4））無無機機磷磷對對生生物物合合成成的的調調節(jié)節(jié)3.研研究究生生物物合合成成機機制制的的常常用用方方法法（1））刺刺激激實實驗驗法法（2））同同位位素素示示蹤蹤法法（3）洗洗滌菌絲絲懸浮法法（4）無無細胞抽抽提法（5）遺遺傳特性性誘變法法代謝工程程的研究究方法1分子生生物學方方法：構構建特殊殊的基因因轉移系系統(tǒng)，尤尤其對于于具有較較高生產產價值的的微生物物，具有有重要意意義。例例如Backman等等利用切切割載體體獲得Tyr營營養(yǎng)突變變型，為為構建苯苯丙氨酸酸的生產產菌株奠奠定基礎礎。2分析化化學及檢檢測方法法：代謝謝工程的的研究對對象是代代謝途徑徑，因此此必須對對代謝通通路中的的一些酶酶及產物物進行研研究和分分析。傳傳統(tǒng)的分分析通路路阻斷的的手段有有：物質質平衡、、同位素素標記、、分析障障礙突變變體等，，目前它它們仍然然是必不不可少的的手段，，而核磁磁共振、、流氏細細胞術的的應用則則為這一一領域的的發(fā)展增增添了新新的活力力。3數學及及計算機機工具：：研究代代謝工程程不僅需需要遺傳傳學知識識，而且且需要對對宿主菌菌的生化化代謝途途徑和生生理學有有深入的的理解，，所以將將DNA數據庫庫的信息息應用于于代謝工工程并開開發(fā)出適適合的軟軟件系統(tǒng)統(tǒng)是十分分必要的的，Karp等等構建了了981個生命命體化合合物數據據庫，為為未來的的發(fā)展奠奠定了基基礎。人人們已在在實驗的的基礎上上結合數數學和化化學的理理論，發(fā)發(fā)展了一一些人工工智能程程序。代謝工程程的基本本過程1、代謝謝分析與與代謝設設計：代代謝工程程的研究究對象是是代謝途途徑，因因此必須須對代謝謝網絡中中的一些些酶及產產物進行行研究和和分析。。根據代代謝流的的分析確確定代謝謝設計的的合理靶靶點，設設計合適適的代謝謝工程操操作手段段，對于于靶點進進行改造造，達到到改造代代謝的目目的。代謝工程程的基本本過程2、基因因操作：：代謝改改造的核核心是在在分子水水平上對對于靶基基因或基基因簇進進的克隆隆、表達達、修飾飾、敲除除、調控控、構建建特殊的的基因轉轉移系統(tǒng)統(tǒng)以及重重組基因因在細胞胞染色體體DNA上的穩(wěn)穩(wěn)定整合合。代謝工程程的基本本過程3、效果果分析：：通常一一次性的的代謝設設計和基基因操作作往往不不能達到到實際生生產所要要求的產產量、速速率或濃濃度。因因此對于于一次代代謝改造造的效果果分析，，得到本本次操作作的優(yōu)點點和缺點點數據，，改進缺缺陷，綜綜合優(yōu)勢勢，進行行下一次次代謝改改造，經經過不斷斷的改造造和分析析，可以以得到好好的結果果。代謝工程程的三個個基本觀觀點隨著生物物化學、、細胞生生物學、、應用分分子生物物學、遺遺傳工程程和代謝謝工程的的發(fā)展，，工業(yè)發(fā)發(fā)酵正在在經歷一一個從技技藝到科科學的重重大變化化，正在在向微生生物生物物工程過過渡。在在生物工工程受到到廣泛重重視的今今天，有有必要把把微生物物(菌種種選育)、微生生物學過過程(發(fā)發(fā)酵工藝藝)和微微生物學學體系(生物反反應器)作為一一個整體體，在科科學的水水平上對對工業(yè)發(fā)發(fā)酵進行行重新審審視。代謝工程程的三個個基本觀觀點從工業(yè)發(fā)發(fā)酵的現現狀出發(fā)發(fā)，主要要根據對對碳元素素代謝及及其控制制，菌種種是化能能異養(yǎng)型型微生物物，產物物是微生生物細胞胞排出細細胞的代代謝中間間產物的的工業(yè)發(fā)發(fā)酵，提提出了3個基本本觀點。。**代謝工程程的三個個基本觀觀點1．1生生物能能支撐觀觀點微生物細細胞是工工業(yè)發(fā)酵酵產物的的生產者者，微生生物細胞胞的生長長和維持持需要由由其自身身的能量量轉換機機構或從從其他形形式的能能量轉化化形成的的生物能能來支撐撐。因此此，工業(yè)業(yè)發(fā)酵具具有生物物學屬性性。1．2代代謝網網絡觀點點由生化反反應網絡絡和跨輸輸送步驟驟組成的的代謝網網絡既沒沒有絕對對的起點點，也沒沒有絕對對的終點點。代謝謝網絡中中任何一一種中間間產物(或可借借助生物物學、化化學方法法與代謝謝網絡聯(lián)聯(lián)網的任任何一種種化合物物)都可可能被開開發(fā)成為為工業(yè)發(fā)發(fā)酵的目目的產物物或原料料。1．3細細胞經經濟觀點點微生物細細胞的經經濟性是是在自然然選擇的的過程中中逐漸形形成的。。野生的的(未經經人工變變異的)微生物物細胞在在自然選選擇的過過程中逐逐漸形成成競爭型型的細胞胞經濟。。而工業(yè)業(yè)發(fā)酵往往往要以以目的產產物的生生產為主主導，調調整代謝謝網絡中中的代謝謝流，構構建一種種導向型型細胞經經濟。從從競爭型型細胞經經濟的轉轉變取決決于遺傳傳和環(huán)境境因素的的信息導導向，這這種導向向必須遵遵循細胞胞經濟的的基本運運行規(guī)律律。代謝工程程研究的的設計思思路在具體的的設計和和操作中中,一般般從以下下方面著著手:1)提高高通向目目標產物物的代謝謝流;2)擴展展代謝途途徑;3)構建建新的代代謝途徑徑。提高高通向目目標產物物的代謝謝流的手手段通常常有:a、增強強催化限限速反應應的酶的的表達量量或活性性,從而而提高代代謝流;b、在有有競爭途途徑(如如分支代代謝途徑徑)存在在時,阻阻斷有害害的或無關關的競爭爭代謝途途徑代謝謝產物的的合成,從而達達到改變變代謝流流,提高高目標產產物產量量的目的的。擴展代謝謝途徑一一般是指指通過基基因工程程手段引引入外源源基因(簇)等等,使原原有代謝謝途徑進進一步向向前或向向后延伸伸,從而而可利用用新的原原料用于于合成目目標產物物或產生生新的末末端代謝謝產物。。構建新新的代謝謝途徑一一般是指指引入外外源基因因(簇)來改造造和修飾飾代謝網網絡,使使細胞從從不能合合成某種種代謝產產物轉變變?yōu)槟軌驂蚝铣纱舜舜x產產物。常用的手手段有:a、轉移移代謝途途徑,即即將多個個特定代代謝途徑徑中的相相關基因因(簇)轉移到到無這些些基因的的菌株(或植物物細胞等等)中,從而達達到使其其能合成成新的目目標產物物的目的的;b、將無無關的代代謝途徑徑相連,形成新新的代謝謝途徑,從而合合成新的的目標產產物。習題ＭetabolicControlAnalysis，簡簡稱ＭＣＣＡ第三節(jié)、、代謝工工程的應應用領域域和前景景代謝工程程和微生生物發(fā)酵酵工業(yè)要要解決的的根本問問題是:如何有有效地改改造微生生物菌種種,使其其高效地地發(fā)酵生生產各種種產品。。代謝工程程是利用用基因工工程技術術改造細細胞的代代謝，以以改善細細胞的性性能的一一門新興興學科。。2003年美美國貝克克萊大學學J.Keasling，采采用酵母母細胞表表達天然然植物藥藥箐篙素素分子，，實現工工程微生生物代謝謝工程制制藥。采采用系統(tǒng)統(tǒng)生物學學原理和和轉基因因生物技技術、計計算機軟軟件輔助助設計技技術，將將細胞內內次生代代謝反應應鏈重新新設計、、人工合合成基因因與基因因調控網網絡，從從而進入入了代謝謝工程、、基因工工程的合合成生物物學-系統(tǒng)統(tǒng)生物學學基礎的的遺傳工工程時代代。代謝工工程的的主要要目標標是識識別特特定的的遺傳傳操作作和環(huán)環(huán)境條條件的的控制制，以以增強強生物物技術術過程程的產產率及及生產產能力力，或或對細細胞性性質進進行總總體改改性。。本書書最主主要的的內容容包括括途徑徑集成成和把把代謝謝通量量作為為細胞胞生理理學的的基本本決定定因素素來考考慮的的重要要性。。代謝謝工程程把數數學的的復雜雜性減減到最最小，，并同同時提提供一一些必必要的的補充充說明明作為為不同同數學學運算算的背背景材材料發(fā)酵產產品代謝工工程研研究的的第一一步必必然是是先確確定要要發(fā)酵酵生產產什么么產品品。微微生物物發(fā)酵酵產品品主要要分為為3大大類:可再再生能能源、、大宗宗化學學品(和生生物材材料)、精精細化化合物物?？煽稍偕茉丛搭惸磕壳把醒芯康牡谋容^較多的的是纖纖維素素乙醇醇、生生物柴柴油、、丁醇醇,然然而目目前的的生物物能源源有著著很多多缺陷陷,將將來很很有必必要開開發(fā)品品質高高、原原材料料豐富富的下下一代代生物物能源源,如如長鏈鏈醇、、油酯酯和碳碳氫化化合物物。大大宗化學品類目目前研究比比較多的是是檸檬酸、、溶劑、乳乳酸、聚羥羥基烷酸、、1,3-丙二醇、、丁二酸以以及這些化化學品聚合合生產的生生物材料(如生物塑塑料、生物物橡膠）然而目前能能工業(yè)化發(fā)發(fā)酵生產的的大宗化學學品數量還還非常有限限。將來很很有必要繼繼續(xù)開發(fā)生