環(huán)境工程微生物學(xué)實驗指導(dǎo)

實驗一光學(xué)顯微鏡的操作及細(xì)菌、放線菌和藍(lán)細(xì)菌個體形態(tài)的觀測

Ⅰ、顯微鏡的使用

一、實驗原理微生物學(xué)研究用的顯微鏡通常有低倍物鏡(16mm，10′)高倍物鏡(4mm，40-45′)和油鏡(1.8mm，95-100′)三種。油鏡常標(biāo)有黑圈或紅圈，它是三者中放大倍數(shù)最大的。使用油鏡時，油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與接物鏡之間，不是隔一層空氣，而是隔一層油質(zhì)，稱為油浸系。這種油常選用香柏油，因香柏油的折射率n＝1.52，與玻璃基本相同。當(dāng)光線通過載玻片后，可直接通過香柏油進(jìn)入物鏡而不發(fā)生折射。假如玻片與物鏡之間的介質(zhì)為空氣，則稱為干燥系；當(dāng)光線通過玻片后，受到折射發(fā)生散射現(xiàn)象，進(jìn)入物鏡的光線顯然減少，這樣視野的照明度就減低了(圖Ⅰ-1)。運(yùn)用油鏡不僅能增長照明度；更重要的是能增長數(shù)值口徑。由于顯微鏡的放大效能由其數(shù)值孔徑?jīng)Q定的。所謂數(shù)值孔徑，即光線投射到物鏡上的最大角度(稱鏡口角)的一半正弦，乘上玻片與物鏡間介質(zhì)折射率所得的乘積，可用下列公式表達(dá)：式中數(shù)值孔徑的大小又是衡量一臺顯微鏡分辨力強(qiáng)弱的依據(jù)；分辨力是指顯微鏡能辨別物體兩點(diǎn)間最小距離的能力。式中l(wèi)=光波波長由上述可知若n值和α角越大則N·A越大或光波波長越短，則顯微鏡的分辨力越大(圖Ⅰ-2)。一些物質(zhì)的折射率：水1.33玻璃1.52空氣1.0香柏油1.515。二、實驗器材1、

儀器顯微鏡；2、

材料巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)標(biāo)本片，香柏油，二甲苯，擦鏡紙。三、操作環(huán)節(jié)1、取鏡顯微鏡是光學(xué)精密儀器，使用時應(yīng)特別小心。從鏡箱中取出時，一手握鏡臂，一手托鏡座，放在實驗臺上。在使用時要特別小心。使用前一方面要熟悉顯微鏡的結(jié)構(gòu)和性能，檢查各部零件是否完全合用，鏡身有無塵土，鏡頭是否清潔。做好必要的清潔和調(diào)整工作。顯微鏡構(gòu)造見圖Ⅰ-32、調(diào)節(jié)光源1)將低倍物鏡旋到鏡筒下方，旋轉(zhuǎn)粗調(diào)螺旋，使鏡頭和載物臺距離約為0.5厘米左右。2)上升聚光器，使之與載物臺表面相距1毫米左右。圖Ⅰ-3光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造1.物鏡轉(zhuǎn)換器2.接物鏡3.游標(biāo)卡尺4.載物臺5.聚光器6.彩虹光闌7.光源8.鏡座9.電源開關(guān)10.光源滑動變阻器11.粗調(diào)螺旋12.微調(diào)螺旋13.鏡臂14.鏡筒15.目鏡16.標(biāo)本移動螺旋3)左眼看目鏡調(diào)節(jié)反光鏡鏡面角度(在天然的光線下觀測，一般用平面反光鏡；若以燈光為光源，則一般多用凹面反光鏡)。開閉光圈，調(diào)節(jié)光線強(qiáng)弱，直至視野內(nèi)得到最均勻最適宜的照明為止。一般染色標(biāo)本油鏡檢核對，光度宜強(qiáng)，可將光圈開大，聚光器上升到最高，反光鏡調(diào)至最強(qiáng)；未染色標(biāo)本，在低倍鏡或高倍鏡觀測時，應(yīng)適本地縮小光圈，下降聚光器，調(diào)節(jié)反光鏡，使光度減弱，否則光線過強(qiáng)不易觀測。3、低倍鏡觀測低倍物鏡(8′或10′)視野面廣，焦點(diǎn)深度較深，為易于發(fā)現(xiàn)目的擬定檢查位置，故應(yīng)先用低倍鏡觀測為宜。操作環(huán)節(jié)：1)先將標(biāo)本玻片置于載物臺上(注意標(biāo)本朝上)，并將標(biāo)本部位處在物鏡的正下方、轉(zhuǎn)動粗調(diào)螺旋，上升載物臺使物鏡至距標(biāo)本約0.5厘米處。2)左眼看目鏡，同時反時針方向慢慢旋轉(zhuǎn)粗調(diào)節(jié)螺旋使載物臺緩慢上升，至視野內(nèi)出現(xiàn)物象后，改用細(xì)調(diào)節(jié)螺旋，上下微微轉(zhuǎn)動，仔細(xì)調(diào)節(jié)焦距和照明，直至視野內(nèi)獲得清楚的物象，及時擬定需進(jìn)一步觀測的部位。3)移動推動器。將所要觀測的部位置于視野中心，準(zhǔn)備換高倍鏡觀測。4、高倍鏡觀測將高倍物鏡(40′)轉(zhuǎn)至鏡筒下方(在轉(zhuǎn)換物鏡時，要從側(cè)面注視。以防低倍鏡未對好焦距而導(dǎo)致鏡頭與玻片相撞)，調(diào)節(jié)光圈和聚光鏡，使光線亮度適中，再仔細(xì)反復(fù)轉(zhuǎn)動微調(diào)螺旋，調(diào)節(jié)焦距，獲得清楚物象，再移動推動器選擇最滿意的鏡檢部位將染色標(biāo)本移至視野中央，待油鏡觀測。5、油鏡觀測1)用粗調(diào)螺旋提起鏡筒，轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器將油鏡轉(zhuǎn)至鏡筒正下方。在標(biāo)本鏡檢部位滴上一滴香柏油。右手順時針方向慢慢轉(zhuǎn)動粗調(diào)螺旋，上升載物臺，并及時從側(cè)面注視使油浸物鏡浸入油中，直到幾乎與標(biāo)本接觸時為止(注意切勿壓到標(biāo)本，以免壓碎玻片，甚至損壞油鏡頭)。2)左眼看目鏡，右手反時針方向微微轉(zhuǎn)動粗調(diào)螺旋，下降載物臺(注意：此時只準(zhǔn)下降載物臺，不能向上調(diào)動)，當(dāng)視野中有模糊的標(biāo)本物象時，改用細(xì)調(diào)螺旋，并移動標(biāo)本直至標(biāo)本物象清楚為止。3)假如向上轉(zhuǎn)動粗調(diào)螺旋已使鏡頭離開油滴又尚未發(fā)現(xiàn)標(biāo)本時，可重新按上述環(huán)節(jié)操作直到看清物象為止。4)觀測完畢，下降載物臺，取下標(biāo)本片。先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾少量二甲苯擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。切忌用手或其他紙擦鏡頭，以免損壞鏡頭，可用綢布擦凈顯微鏡的金屬部件。5)將各部分還原，反光鏡垂直于鏡座，將接物鏡轉(zhuǎn)成八字形，再向下旋。罩上鏡套，然后放回鏡箱中。四、注意事項1、顯微鏡鏡頭的保護(hù)和保養(yǎng)2、使用顯微鏡時應(yīng)據(jù)不同的物鏡而調(diào)節(jié)光線Ⅱ、細(xì)菌、放線菌和藍(lán)細(xì)菌個體形態(tài)的觀測一、儀器和材料顯微鏡、擦鏡紙、香柏油或液體石蠟、二甲苯。示范片：大腸桿菌（桿狀）、小球菌（球狀）、硫酸鹽還原菌（弧形）、枯草芽孢桿菌、放線菌、顫藻、魚腥藻或念珠藻等。二、實驗內(nèi)容和操作方法嚴(yán)格按照光學(xué)顯微鏡操作方法，依低倍、高倍和油鏡的順序觀測桿狀、球狀、弧狀和絲狀的細(xì)菌示范片，用鉛筆分別繪出各種細(xì)菌的形態(tài)圖。同法逐個觀測放線菌的示范片，分別繪出其形態(tài)圖。同法逐個觀測顫藻、魚腥藻或念珠藻的示范片，分別繪出其形態(tài)圖。實驗二酵母菌、霉菌、藻類、原生動物及微型后生動物個體形態(tài)的觀測一、實驗?zāi)康?、進(jìn)一步熟悉和掌握顯微鏡的操作方法。2、觀測幾種真核微生物的個體形態(tài)，掌握生物圖的繪制方法。3、學(xué)習(xí)壓片滴法制作標(biāo)本片。二、儀器和材料1、顯微鏡、擦鏡紙、吸水紙。2、酵母菌、霉菌示范片，藻類培養(yǎng)液及生活污泥混合液。三、實驗內(nèi)容和操作方法1、嚴(yán)格按照光學(xué)顯微鏡操作方法，依低倍、高倍和油鏡的順序觀測酵母菌和霉菌示范片，用鉛筆分別繪出其形態(tài)圖。2、用壓滴法制作藻類、原生動物和微型后生動物的標(biāo)本片。方法：取一片干凈的載玻片放在實驗臺上，用一支滴管吸取試管中藻類培養(yǎng)液于載玻片的中央，用干凈的蓋玻片覆蓋在液滴上（注意不要產(chǎn)氣憤泡）即成標(biāo)本片，然后用低倍鏡和高倍鏡觀測（教師示范）。3、用壓滴法觀測原生動物和微型后生動物（制作方法同上）。思考題你一共觀測到幾種微生物，繪出他們的形態(tài)圖。實驗三微生物的染色

Ⅰ、細(xì)菌簡樸染色法

一、實驗原理細(xì)菌的涂片和染色是微生物學(xué)實驗中的一項基本技術(shù)。細(xì)菌的細(xì)胞小而透明，在普通光學(xué)顯微鏡下不易辨認(rèn)，必須對它們進(jìn)行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀測到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。所謂簡樸染色法是運(yùn)用單一染料對細(xì)菌進(jìn)行染色的一種方法。此法操作簡便，可用以觀測微生物的形狀、大小及細(xì)胞排列狀態(tài)，是微生物技術(shù)中應(yīng)用廣泛，操作簡便的染色法。用于生物染色的染料重要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合。因細(xì)菌蛋白質(zhì)等電點(diǎn)較低，當(dāng)它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負(fù)電荷，所以通常采用堿性染料使其著色。例如，美藍(lán)(亞甲藍(lán))事實上是氯化亞甲藍(lán)鹽(methylenebluechloride，縮寫為MBC)；它可被電離成正、負(fù)離子：MBC?methyleneblue++chloride-帶正電荷的染料離子可使細(xì)菌細(xì)胞染成藍(lán)色。常用的堿性染料除美藍(lán)外，尚有結(jié)晶紫(crystalviolet)、堿性復(fù)紅(basicfuchsin)、番紅(又稱沙黃，safranine)等。酸性染料的離子帶負(fù)電荷，能與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合。當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時，細(xì)菌所帶正電荷增長，因此易被伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結(jié)合物又稱復(fù)合染料，如伊紅美藍(lán)、伊紅天青等。染色前必須先固定細(xì)菌，其目的有二：一是殺死細(xì)菌，使細(xì)胞質(zhì)凝固，菌體粘附于玻片上；二是增長其對染料的親和力。常用的有加熱和化學(xué)固定兩種方法。固定期應(yīng)盡量維持細(xì)胞原有形態(tài)，防止細(xì)胞膨脹或收縮。二、實驗器材1、

菌種巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)或蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)；2、

儀器顯微鏡；3、

材料接種環(huán)，酒精燈，火柴，載玻片，洗瓶，廢液缸，擦鏡紙，吸水紙；4、

染料草酸銨結(jié)晶紫或石碳酸復(fù)紅。三、操作環(huán)節(jié)1、涂片在潔凈無油膩的玻片中央放一小滴蒸餾水，用灼燒滅菌冷卻后的接種環(huán)挑取少量菌體與水滴充足混勻，涂成極薄的菌膜。2、干燥將涂片于空氣中自然晾干，或?qū)⑼科糜诨鹧娓咛幬岷娓桑荒苤苯釉诨鹧嫔虾婵?，以免菌體變形。3、固定手執(zhí)玻片一端，有菌膜的一面朝上，通過迅速通過火焰2-3次(用手指觸涂片反面，以不燙手為宜)。待玻片冷卻后，再加染料；4、染色玻片置于玻片擱架上，加適量(以蓋滿菌膜為度)結(jié)晶紫染色液(或石炭酸復(fù)紅液)于菌膜部位，染l-2min。5、水洗傾去染色液，用洗瓶中的自來水自玻片一端輕輕沖洗，至流下的水中無染色液的顏色時為止。6、干燥自然干燥或用吸水紙蓋在涂片部位以吸去水分(注意勿擦去菌體)。7、鏡檢用油鏡觀測并繪出細(xì)菌形態(tài)圖。8、清理實驗完畢，擦凈顯微鏡。有菌的玻片置消毒缸中，清洗、晾干后備用。四、注意事項1、玻片要潔凈無油，否則菌液涂不開。2、挑菌量宜少，涂片宜薄，過厚則不易觀測。Ⅱ、革蘭氏染色法

一、實驗原理革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家C．Gram所創(chuàng)建的。革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)兩大類，是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別性染色法。革蘭氏染色法的重要環(huán)節(jié)是先用結(jié)晶紫進(jìn)行初染；再加媒染劑--碘液，以增長染料與細(xì)胞間的親和力，使結(jié)晶紫和碘在細(xì)胞膜上形成分子量較大的復(fù)合物；然后用脫色劑(乙醇或丙酮)脫色；最后用蕃紅復(fù)染。凡細(xì)菌不被脫色而保存初染劑的顏色(紫色)者為革蘭氏陽性菌，如被脫色后又染上復(fù)染劑的顏色(紅色)者為革蘭氏陰性菌。該染色法所以能將細(xì)菌分為G+菌和G-菌，是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。G-菌的細(xì)胞壁中具有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，并且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質(zhì)，增長了細(xì)胞壁的通透性，使結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)蕃紅復(fù)染后就成紅色。G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑解決后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性減少，因此細(xì)菌仍保存初染時的顏色。二、實驗器材1、菌種牛肉膏瓊脂斜面28℃培養(yǎng)24h的大腸桿菌(Escherichiacoli)斜面菌種，牛肉膏瓊脂斜面282、儀器顯微鏡；3、材料載玻片，香柏油，二甲苯，擦鏡紙，吸水紙，染色缸等。4、染料草酸銨結(jié)晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番紅染色液；三、操作環(huán)節(jié)1、

涂片在一張載玻片上加兩滴蒸餾水后，分別涂布枯草芽孢桿菌和大腸桿菌(注意涂片切不可過于濃厚)。2、

固定將制成的涂片干燥固定，固定期通過火焰1-2次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。3、染色⑴初染將玻片置于玻片擱架上，加草酸銨結(jié)晶紫染色液(加量以蓋滿菌膜為度)，染色1-2min。傾去染色液，用自來水小心地沖洗。⑵媒染滴加(Lugol)碘液，染1-2min，水洗。⑶脫色滴加95%乙醇，脫色20-25s立即水洗，以終止脫色。⑷復(fù)染滴加蕃紅，染色2-3min，水洗。最后用吸水紙輕輕吸干。4、鏡檢干燥后，置油鏡觀測。被染成紫色者即為革蘭氏陽性菌(G+)；被染成紅色者是革蘭氏陰性菌(G-)。四、注意事項1、革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色時間。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而被誤認(rèn)為是革蘭氏陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被認(rèn)為是革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受涂片厚薄、脫色時玻片晃動的快慢及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴(yán)格規(guī)定。一般可用已知革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌作練習(xí)，以掌握脫色時間。當(dāng)要確證一個未知菌的革蘭氏反映時，應(yīng)同時做一張已知革蘭氏陽性菌和陰性菌的混合涂片，以資對照。2、染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。3、選用培養(yǎng)16-24h菌齡的細(xì)菌為宜。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反映。實驗四培養(yǎng)基的制備和滅菌

Ⅰ、培養(yǎng)基的制備

一、實驗原理培養(yǎng)基是按照微生物生長發(fā)育的需要，用不同組分的營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。人工制備培養(yǎng)基的目的，在于給微生物發(fā)明一個良好的營養(yǎng)條件。把一定的培養(yǎng)基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的環(huán)境和場合。自然界中，微生物種類繁多，由于微生物具有不同的營養(yǎng)類型，對營養(yǎng)物質(zhì)的規(guī)定也各不相同，加之實驗和研究上的目的不同，所以培養(yǎng)基在組成原料上也各有差異。但是，不同種類和不同組成的培養(yǎng)基中，均應(yīng)具有滿足微生物生長發(fā)育的水分、碳源、氮源、無機(jī)鹽和生長素以及某些特需的微量元素等。此外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的酸堿度(pH值)和一定緩沖能力及一定的氧化還原電位和合適的滲透壓。根據(jù)制備培養(yǎng)基對所選用的營養(yǎng)物質(zhì)的來源，可將培養(yǎng)基分為天然培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基三類。按照培養(yǎng)基的形態(tài)可將培養(yǎng)基分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)基使用目的，可將培養(yǎng)基分為選擇培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基及鑒別培養(yǎng)基等。培養(yǎng)基的類型和種類是多種多樣的，必須根據(jù)不同的微生物和不同的目的進(jìn)行選擇配制，本實驗分別配制常用培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌和真菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號合成培養(yǎng)基和馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中添加凝固劑制成的，常用的凝固劑有瓊脂、明膠和硅酸鈉，其中以瓊脂最為常用，其重要成份為多糖類物質(zhì)，性質(zhì)較穩(wěn)定，一般微生物不能分解，故用凝固劑而不致引起化學(xué)成份變化。瓊脂在95℃的熱水中才開始融化，融化后的瓊脂冷卻到45℃才重新凝固。因此用瓊脂制成的固體培養(yǎng)基在一般微生物的培養(yǎng)溫度范圍內(nèi)(二、實驗器材1、

藥品瓊脂，1NNaOH溶液，1NHCl溶液，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號合成培養(yǎng)基和馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基的配方藥品；2、

材料具刻度1000毫升塘瓷盅或小鋁鍋，天平，10×200mm試管，量筒，小燒杯，玻璃棒，骨匙，pH試紙，分裝漏斗，試管盒，紗布，棉花，報紙，麻繩，標(biāo)簽。三、操作環(huán)節(jié)1、計算稱量根據(jù)配方，計算出實驗中各種藥品所需要的量，然后分別稱(量)取。2、溶解一船情況下，幾種藥品可一起倒入燒杯內(nèi)、先加入少于所需要的總體積水進(jìn)行加熱溶解(但在配制化學(xué)成分較多的培養(yǎng)基時，有些藥品，如磷酸鹽和鈣鹽、鎂鹽等混在一起容易產(chǎn)生結(jié)塊、沉淀，故宜按配方依次溶解。個別成分如能分別溶解，經(jīng)分開滅菌后混合，則效果更為抱負(fù))。加熱溶解時，要不斷攪拌。如有瓊脂在內(nèi)，更應(yīng)注意。待完全溶解后，補(bǔ)足水分到需要的總體積。3、調(diào)節(jié)pH用滴管逐滴加入1NNaOH或lNHCl邊攪動；邊用精密的pH試紙測其pH值，直到符合規(guī)定期為止。pH值也可用pH計來測定。4、過濾要趁熱用四層紗布過濾。A.培養(yǎng)基的分裝B.棉塞的做法1.對的2.管內(nèi)太短，外部太松3.整個棉塞太松4.管內(nèi)太緊，外部太短松圖Ⅴ-1培養(yǎng)基的分裝裝置與棉塞5、分裝按照實驗規(guī)定進(jìn)行分裝。裝入試管中的量不宜超過試管高度的1/5，裝入三角燒瓶中的量以燒瓶總體積的一半為限。在分裝過程中，應(yīng)注意勿使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口、以免弄濕棉塞，導(dǎo)致污染。6、加塞培養(yǎng)基分裝好以后，在試管口或燒瓶口上應(yīng)加上一只棉塞。棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)，防止由此而引起的污染；另一方面保證有良好的通氣性能，使微生物能不斷地獲得無菌空氣。因此棉塞質(zhì)量的好壞對實驗的結(jié)果有很大影響。7、滅菌在塞上棉塞的容器外面再包一層牛皮紙，便可進(jìn)行滅菌。培養(yǎng)基的滅菌時間和溫度，需按照各種培養(yǎng)基的規(guī)定進(jìn)行，以保證滅菌效果和不損壞培養(yǎng)基的必要成分。假如分裝的斜面，要趁熱擺放并使斜面長度適當(dāng)(為試管長度1/3-l/2，不能超過1/2)。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，應(yīng)保溫培養(yǎng)2-3天，檢查滅菌效果，無菌生長者方可使用。四、注意事項配制固體培養(yǎng)基用的瓊脂應(yīng)先行用冷水浸泡，紗布過濾，在調(diào)好pH值后加入。2、

配制高氏一號合成培養(yǎng)基時應(yīng)小心溶解淀粉，不要成團(tuán)。

Ⅱ、滅菌與消毒

滅菌是用物理或化學(xué)的方法來殺死或除去物品上或環(huán)境中的所有微生物。消毒是用物理或化學(xué)的方法殺死物體上絕大部分微生物(重要是病原微生物和有害微生物)。消毒事實上是部分滅菌。在微生物實驗、生產(chǎn)和科研工作中，需要進(jìn)行純培養(yǎng)不能有任何雜菌，因此，對所用器材、培養(yǎng)基要進(jìn)行嚴(yán)格滅菌，對工作場合進(jìn)行消毒，以保證工作順利進(jìn)行。一、消毒與滅菌的方法消毒與滅菌的方法很多，一般可分為加熱、過濾、照射和使用化學(xué)藥品等方法。㈠、加熱法加熱法又分干熱滅菌和濕熱滅菌兩類。1、干熱滅菌有火焰燒灼滅菌和熱空氣滅菌兩種?；鹧鏌茰缇嫌糜诮臃N環(huán)、接種針和金屬用品如鑷子等，無菌操作時的試管口和瓶口也在火焰上作短暫燒灼滅菌。通常所說的干熱滅菌是在電烘箱內(nèi)滅菌，此法合用于玻璃器皿如吸管和培養(yǎng)皿等的滅菌，在熱空氣160℃2、濕熱滅菌⑴高壓蒸汽滅菌法此法是將物品放在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)1.05kg／cm2(15磅/英寸2)，121.3℃⑵間歇滅菌法有少數(shù)培養(yǎng)基例如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、含糖培養(yǎng)基等用干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌均會受到破壞，則必須用間歇滅菌法。此法是用阿諾氏流動蒸汽滅菌器進(jìn)行滅菌。該器底層盛水，頂部插有溫度計，加熱后水蒸汽溫度達(dá)成100℃時，即循環(huán)流于器內(nèi)，水蒸汽碰到器內(nèi)物體時，又凝成水，流至底層貯水處，故不至干涸。滅菌時，將培養(yǎng)基放在器內(nèi)，天天加熱100℃30分鐘、連續(xù)三天，第一天加熱后，其中的營養(yǎng)體被殺死，將培養(yǎng)基取出放室溫下18-24小時，使其中的芽孢發(fā)育成為營養(yǎng)體，第二日再加熱l⑶煮沸消毒法注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般微生物學(xué)實驗室中煮沸消毒時間為10-15分鐘，人用注射器和手術(shù)器械在有條件的地方，一般均采用高壓蒸汽滅菌法或干熱滅菌法滅菌。㈡、過濾滅菌許多材料例如血清與糖溶液應(yīng)用一般加熱消毒滅菌方法，均會被熱破壞，因此，采用過濾除菌的方法。應(yīng)用最廣泛的過濾器有蔡氏(Seitz)過濾器和膜過濾器。蔡氏過濾器是用銀或鋁等金屬做成的，分為上、下兩節(jié)、過濾時，用螺旋把石棉板緊緊地夾在上、下兩節(jié)濾器之間，然后將溶液置于濾器中抽濾。每次過濾必須用一張新濾板，蔡氏過濾器的結(jié)構(gòu)如圖。濾膜過濾器的結(jié)構(gòu)與蔡氏過濾器相似，只是濾膜是一種多孔纖維素(乙酸纖維素或硝酸纖維素)，孔徑一般為0.45m㈢、紫外線滅菌紫外線波長在200-300nm，具有殺菌作用，其中以265-266nm殺菌力最強(qiáng)。無菌室或無菌接種箱空氣可用紫外線燈照射滅菌。㈣、化學(xué)藥品滅菌化學(xué)藥品消毒滅菌法是應(yīng)用能殺死微生物的化學(xué)制劑進(jìn)行消毒滅菌的方法。實驗室桌面、用品以及洗手用的溶液均常用化學(xué)藥品進(jìn)行消毒滅菌。常用的有2%煤酚皂溶液(來蘇爾)、0.25%新潔爾滅、1%升汞、3-5%的甲醛溶液、75%酒精溶液等，見表Ⅴ-1。表Ⅴ-1常用化學(xué)殺菌劑應(yīng)用范圍和常用濃度表二、實驗室常用滅菌方法㈠干熱滅菌用干燥熱空氣(170℃干熱滅菌操作環(huán)節(jié)：1、裝箱將準(zhǔn)備滅菌的玻璃器具洗滌干凈、晾干，用紙包裹好，放入滅菌的長鐵盒(或鋁盒)內(nèi)，放入干熱滅菌箱內(nèi)，關(guān)好箱門。2、滅菌接通電源，打開干熱滅菌箱排氣孔，等溫度升至80-100℃時關(guān)閉排氣孔，繼續(xù)升溫至160-l703、滅菌結(jié)束后，斷開電源，自然降溫至60℃注意事項：1、滅菌物品不能堆得太滿、太緊，以免影響溫度均勻上升。2、滅菌物品不能直接放在電烘箱底板上，以防止包紙供焦。3、滅菌溫度恒定在l60-l70℃4、降溫時待溫度自然降至60℃㈡加壓蒸汽滅菌法高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時由于蒸汽不能溢出，而增長了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100℃在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其因素有三：一是濕熱中細(xì)菌菌體吸取水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增長，所需凝固溫度減少(表Ⅴ-2)，二是濕熱的穿透力比干熱大(表Ⅴ-3)；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100℃表Ⅴ-2蛋白質(zhì)含水量與凝固所需溫度的關(guān)系表Ⅴ-3干熱與濕熱穿透力及滅菌效果比較在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，由于空氣膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當(dāng)水蒸汽中具有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關(guān)系見表Ⅴ-4。一般培養(yǎng)基用1.05kg/cm2，121.3℃15-30分鐘可達(dá)成徹底滅菌的目的。滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質(zhì)和容量等具體情況而有所改變。例如含糖培養(yǎng)基用0.56kg/cm2(8磅/英寸2)，112.6℃滅菌15分鐘，但為了保證效果，可將其他成分先行121.3℃，20分鐘滅菌，然后以無菌操作手續(xù)加入滅菌的糖溶液。又如盛于試管內(nèi)的培養(yǎng)基以1表Ⅴ-4滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關(guān)系蒸汽壓力所用單位為kg/cm2(公斤/厘米2)，它與1b/in2(磅/英寸2)和溫度的換算關(guān)系見表Ⅴ-5。表Ⅴ-5蒸汽壓力與蒸汽溫度換算關(guān)系實驗室中常用的高壓蒸汽滅菌鍋有立式、臥式和手提式等幾種。本實驗介紹手提式高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法。手提式高壓蒸汽滅菌鍋的使用操作環(huán)節(jié)：1、一方面將內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。2、放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。3、加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。4、用電爐或煤氣加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除渦內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增長而逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。本實驗用1.05kg/cm2，121.3℃5、滅菌所需時間到后，切斷電源或關(guān)閉煤氣，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至0時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。假如壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內(nèi)壓力忽然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，導(dǎo)致棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。6、將取出的滅菌培養(yǎng)基放入37℃實驗五細(xì)菌純種分離、培養(yǎng)和接種技術(shù)Ⅰ、微生物平板菌落法數(shù)法

一、實驗原理微生物的稀釋平板計數(shù)是根據(jù)在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落，即是由一個單細(xì)胞繁殖而成，且肉眼可見的子細(xì)胞群體這一生理及培養(yǎng)特性進(jìn)行的。也就是說一個菌落即代表一個單細(xì)胞。計數(shù)時，一方面將待測樣品制成均勻的一系列不同稀釋液，并盡量使樣品中的微生物細(xì)胞分散開來，使成單個細(xì)胞存在(否則一個菌落就不只是代表一個菌)，再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板中，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)。經(jīng)培養(yǎng)后，由單個細(xì)胞生長繁殖形成菌落，記錄菌落數(shù)目，即可計算出樣品中的含菌數(shù)。此法所計算的菌數(shù)是培養(yǎng)基上長出來的菌落數(shù)，故又稱活菌計數(shù)，一般用于某些成品檢定(如殺蟲菌劑等)、生物制品檢定、土壤含菌量測定及食品、水源的污染限度的檢定。二、實驗器材1、

90ml、45ml和9ml無菌水、1ml和5ml無菌吸管、無菌平板；2、

天平、稱樣瓶、記號筆；3、

待測樣品、所需各類培養(yǎng)基。三、操作環(huán)節(jié)(混菌法)1、樣品稀釋液的制備準(zhǔn)確稱取待測樣品10g，放入裝有90ml無菌水并放有小玻珠的250mL三角瓶中，用手或置搖床上振蕩20min，使微生物細(xì)胞分散，靜置約20-30s，即成10-1稀釋液；再用1ml無菌吸管，吸取10-1稀釋液1ml移入裝有9ml無菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液混合均勻，即成10-2稀釋液；再換一支無菌吸管吸取10-2菌液1mL移入裝有9ml無菌水試管中，即成10-3稀釋液；以此類推，一定要每次更換吸管，連續(xù)稀釋，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等一系列稀釋度的菌液，供平板接種使用(如圖Ⅴ-2)。圖Ⅴ-2平板計數(shù)法中樣品的稀釋和稀釋液的取樣用稀釋平板計數(shù)時，待測菌稀釋度的選擇應(yīng)根據(jù)樣品擬定。樣品中所含待測菌的數(shù)量多時，稀釋度應(yīng)高，反之則低。通常測定細(xì)菌菌劑含菌數(shù)時，多采用10-7、10-8、10-9稀釋度的菌液；測定土壤細(xì)菌數(shù)量時，多采用10-4、10-5、10-6稀釋度的菌液；測定放線菌和真菌數(shù)量時，多采用10-3、10-4、10-5稀釋度的菌液。2、平板接種培養(yǎng)平板接種培養(yǎng)有混合平板培養(yǎng)法和涂抹平板培養(yǎng)法兩種方法。該實驗采用混合平板培養(yǎng)法計數(shù)：將無菌平板編上10-7、10-8、10-9號碼，每一號碼設(shè)立三個反復(fù)，用1毫升無菌吸管按無菌操作規(guī)定吸取10-9稀釋液各1毫升放入編號10-9的3個平皿中，同法吸取10-8稀釋液各1毫升放入編號10-8的3個平皿中，再吸取10-7稀釋液各1毫升，放入編號10-7的3個平皿中(由低濃度向高濃度時，吸管可不必更換)。然后在9個平皿中分別倒入已融化并冷卻至45-50℃3、結(jié)果計算計算結(jié)果時，常按下列標(biāo)準(zhǔn)從接種后的3個稀釋度中，選擇一個合適的稀釋度，求出每克待測樣品中的含菌數(shù)。⑴從三個稀釋度中先出一個稀釋度(即計算稀釋度)，每個平皿中的菌落數(shù)，細(xì)菌、放線菌、酵母菌以每皿30-300個菌落為宜，霉菌以每皿10-100個菌落為宜。這是由于稀釋度過高，菌數(shù)少，誤差大，稀釋度過低菌數(shù)多，不易得到分散的菌落，也不易數(shù)清。選出計算稀釋度后，數(shù)出該稀釋度中三個反復(fù)的菌落數(shù)，并求出平均的菌落數(shù)。⑵同一稀釋度的各個反復(fù)的菌數(shù)相差(平行誤差)不能太懸殊。⑶從低稀釋度到高稀釋度，以菌落數(shù)遞減10倍為標(biāo)準(zhǔn)，各稀釋度間的誤差(遞減誤差)越小越好。⑷含菌數(shù)的計算含菌數(shù)通常以每克樣品(烘干重或風(fēng)干重)中具有的測定菌的數(shù)量來表達(dá)?？砂聪旅娴墓接嬎?。四、注意事項1、在整個實驗過程中的無菌操作。2、應(yīng)根據(jù)實驗所測的樣品決定最高稀釋度。3、混菌法倒培養(yǎng)基時應(yīng)當(dāng)注意培養(yǎng)基不能過燙或過冷。

Ⅱ、微生物菌落形態(tài)觀測

一、

實驗原理菌落形態(tài)是指某種微生物在一定的培養(yǎng)基上由單個菌體形成的群體形態(tài)。細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌，每一類微生物在一定培養(yǎng)條件下形成的菌落各具有某些相對的特性，運(yùn)用觀測這些特性，來區(qū)分各大類微生物及初步辨認(rèn)、鑒定微生物，方法簡便快速，在科研和生產(chǎn)實踐中常被采用。二、實驗器材1、菌種大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，擬霉芽孢桿菌，靈桿菌，鉀細(xì)菌，5406細(xì)黃鏈霉菌，紫色直絲鏈霉菌，黑化鏈霉菌，小單孢菌，諾卡氏菌，白酵母，紅酵母，青霉菌，赤霉菌，黑曲霉，根霉，毛霉等；2、培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號合成培養(yǎng)基和馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等；3、材料無菌平皿，接種環(huán)(針)，三、操作環(huán)節(jié)1、制備菌落平板分別用上述不同培養(yǎng)基制成平板，然后用上述的細(xì)菌、放線菌、酵母菌以劃線法制成已知菌平板，而霉菌則用點(diǎn)種法(一點(diǎn)或三點(diǎn)均可)制成已知菌平板。2、細(xì)菌菌落特性的觀測觀測菌落的大小、表面狀況、透明度、色澤、邊沿、隆起度、透光性、是否分泌色素等特點(diǎn)來掌握細(xì)菌菌落的形態(tài)特性。3、放線菌菌落特性的觀測觀測菌落的大小、表面形狀(呈崎嘔、褶皺或平滑)，氣生菌絲的形狀(呈絨狀、粉狀或茸毛狀)，有無同心環(huán)以及菌落的顏色等特點(diǎn)，以便掌握放線菌菌落的形態(tài)特性。4、酵母菌菌落特性的觀測大多數(shù)酵母菌形成的菌落與細(xì)菌的相似、但較細(xì)菌的菌落大而厚些濕潤、粘稠、易被挑起。菌落多呈乳白色，少數(shù)為紅色(如紅酵母)，酵母菌菌落的顏色、光澤、質(zhì)地、表面和邊沿特性均為辨認(rèn)時的重要依據(jù)。5、霉菌菌落特性的觀測霉菌菌落通常以擴(kuò)散方式向四周蔓延，菌絲較粗而長，形成的菌落較疏松、呈絨毛狀、絮狀或蜘蛛網(wǎng)狀，一般比細(xì)菌菌落大幾倍到幾十倍。菌落背面呈現(xiàn)不同顏色。四、注意事項1、在觀測過程中應(yīng)注意比較并區(qū)分放線菌與霉菌、酵母菌與細(xì)菌的菌落特性。2、制備菌落平板時應(yīng)注意培養(yǎng)基的選用和培養(yǎng)時間的控制。

Ⅲ、微生物的平板劃線分離純化

一、實驗原理在土壤、水、空氣或人及動、植物體中，不同種類的微生物絕大多數(shù)都是混雜生活在一起，當(dāng)我們希望獲得某一種微生物時，就必須從混雜的微生物類群中分離它，以得到只具有這一種微生物的純培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)。一般是根據(jù)該微生物對營養(yǎng)、酸堿度、氧等條件規(guī)定不同，而供應(yīng)它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某種克制劑導(dǎo)致只利于此菌生長，而克制其他菌生長的環(huán)境，從而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或平板劃線分離法等分離、純化該微生物，直至得到純菌株。土壤是微生物生活的大本營，在這里生活的微生物無論總數(shù)量和種類都是極其多樣的，因此，土壤是我們開發(fā)運(yùn)用微生物資源的重要基地，可以從其中分離、純化到許多有用的菌株。本實驗用平板劃線法從土壤中分離純化微生物。二、實驗器材1、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號合成培養(yǎng)基和馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等；2、盛9ml無菌水的試管，盛90m1無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，1ml和5ml無菌吸管，無菌培養(yǎng)皿；3、接種環(huán)，土樣等。三、操作環(huán)節(jié)圖Ⅴ-3平板劃線操作示意圖1、倒平板將加熱融化的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號合成培養(yǎng)基和馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基分別倒平板，并標(biāo)明培養(yǎng)基的名稱。2、劃線在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取經(jīng)稀釋10倍的土壤懸液-環(huán)在平