醫(yī)學(xué)第三章液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)課件

第三章液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用的原理及應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)主要可解決如下幾方面的問(wèn)題：不揮發(fā)性化合物分析測(cè)定；極性化合物的分析測(cè)定；熱不穩(wěn)定化合物的分析測(cè)定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析測(cè)定；沒(méi)有商品化的譜庫(kù)可對(duì)比查詢，只能自己建庫(kù)或自己解析譜圖。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用要解決的重要問(wèn)題液相色譜流動(dòng)相對(duì)質(zhì)譜工作條件的影響質(zhì)譜離子源溫度對(duì)液相色譜分析源的影響

一、LC-MS聯(lián)用的接口技術(shù)常用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的接口主要有移動(dòng)帶技術(shù)（MB）、熱噴霧接口、粒子束接口（PB）、快原子轟擊（FAB）、電噴霧接口（ESI）等。其中，電噴霧接口的應(yīng)用極為廣泛。1.電噴霧（ESI）1）特點(diǎn)：具有高的離子化效率，對(duì)蛋白質(zhì)而言接近100%；有多種離子化模式可供選擇；對(duì)蛋白質(zhì)而言，穩(wěn)定的多電荷離子的產(chǎn)生，使蛋白質(zhì)分子量測(cè)定范圍可高達(dá)幾十萬(wàn)甚至上百萬(wàn)；“軟”離子化方式使熱不穩(wěn)定化合物得以分析并產(chǎn)生高豐度的準(zhǔn)分子離子峰。2）ESI接口的結(jié)構(gòu)ESI源主要由五部分組成：（1）流動(dòng)相導(dǎo)入裝置；（2）真正的大氣壓離子化區(qū)域；（3）離子取樣孔；（4）大氣壓到真空的界面；（5）離子光學(xué)系統(tǒng)。電噴霧：現(xiàn)在常見(jiàn)的噴嘴是內(nèi)徑為0.1mm的金屬毛細(xì)管。在它上面施加3～8kV的電壓時(shí)。由于毛細(xì)管的頂端很窄，形成的電場(chǎng)強(qiáng)度可高達(dá)106V/m。當(dāng)流速為0.5～5μL／min的LC流出物溢出金屬毛細(xì)管頂端時(shí)，會(huì)形成扇狀噴霧。它是細(xì)小的液珠和溶劑蒸氣的混合體。由于高壓電場(chǎng)的作用，溶液中帶某種電荷的溶質(zhì)會(huì)向液體表面移動(dòng)，使液珠表面該種電荷過(guò)剩。表面過(guò)量電荷的正負(fù)，視施加在毛細(xì)管電極上的電壓正負(fù)而定。

電噴霧電離源ESINeedle噴霧針多層套管構(gòu)成溶液霧化氣（N2/Air）NebulizingGas干燥氣DryingGas（N2）加快溶劑揮發(fā)電噴霧電離源ESITaylor錐庫(kù)侖分裂Rayleigh穩(wěn)定限形成正/負(fù)氣相離子被吸入質(zhì)量分析器電噴霧接口的主要缺點(diǎn)是它只能接受非常小的液體流量（1～10μL?min-1）將氣動(dòng)輔助電噴霧技術(shù)運(yùn)用在接口中，使得接口可與大流量（約1mL?min-1）的HPLC聯(lián)機(jī)使用大氣壓化學(xué)電離源APCINeedle噴霧針（加熱）CoronaNeedle電暈針reagentgas試劑氣離子-分子反應(yīng)電噴霧與大氣壓化學(xué)電離的比較電離機(jī)理：電噴霧采用離子蒸發(fā)，而APCI電離是高壓放電發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移而生成[M＋H]+或[M-H]-離子。樣品流速：APCI源可從0.2到2mL／min；而電噴霧源允許流量相對(duì)較小,一般為0.2-1mL／min.斷裂程度；APCI源的探頭處于高溫，對(duì)熱不穩(wěn)定的化合物就足以使其分解.靈敏度：通常認(rèn)為電噴霧有利于分析極性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更適合于分析極性較小的化合物。多電荷：APCI源不能生成一系列多電荷離子二、LC-MS分析條件的選擇和優(yōu)化1.接口的選擇：ESI適合于中等極性到強(qiáng)極性的化合物分子，特別是那些在溶液中能預(yù)先形成離子的化合物和可以獲得多個(gè)質(zhì)子的大分子（如蛋白質(zhì)）。APCI不適合可帶多個(gè)電荷的大分子，其優(yōu)勢(shì)在于弱極性或中等極性的小分子的分析。5.輔助氣體流量和溫度的選擇

操作中溫度的選擇和優(yōu)化主要是指接口的干燥氣體而言，一般情況下選擇干燥氣溫度高于分析物的沸點(diǎn)20℃左右即可。對(duì)熱不穩(wěn)定性化合物，要選用更低的溫度以避免顯著的分解。選用干燥氣溫度和流量大小時(shí)還要考慮流動(dòng)相的組成，有機(jī)溶劑比例高時(shí)可采用適當(dāng)?shù)偷臏囟群土髁啃∫稽c(diǎn)的。六大禁止禁止高濃度待測(cè)樣品<1ppm禁止用洗滌劑清洗玻璃容器禁止用塑料容器裝有機(jī)溶劑禁止用不揮發(fā)性緩沖鹽禁止高濃度有機(jī)緩沖鹽<10mM

禁止無(wú)機(jī)樣品進(jìn)樣建議采用等度洗脫采用甲醇作為流動(dòng)相比例偏大采用小內(nèi)徑的色譜柱如2.1mm除MRM模式不能超過(guò)4個(gè)通道一個(gè)色譜峰的數(shù)據(jù)點(diǎn)在15-25個(gè)建議

ESI廣泛適用

APCI效果更佳

正模式廣泛適用負(fù)模式本底更低，信噪比更高影響分子量測(cè)定的因素1）pH的影響：正離子方式pH要低些，負(fù)離子方式pH要高些，除對(duì)離子化有影響，還影響LC的峰形。2）氣流和溫度：水含量高及流量大時(shí)要相應(yīng)增加。3）溶劑和緩沖液流量：流速適當(dāng)高可以提高出峰的靈敏度。4）溶劑和緩沖液的類型：通常正離子用甲醇好，負(fù)離子乙腈好些5）選擇合適的液相色譜類型：正相、反相、選擇合適的色譜柱6）合適的電壓：DP電壓高時(shí)，樣品在源內(nèi)分解或碎裂；高DP電壓時(shí)會(huì)使多電荷離子比例低，多聚體也減少7）樣品結(jié)構(gòu)和性質(zhì)8）雜質(zhì)的影響：溶劑的純度、水的純凈程度等。當(dāng)成分復(fù)雜，雜質(zhì)太多時(shí)，競(jìng)爭(zhēng)使被測(cè)物離子化不好，同時(shí)使LC分離不好9）樣品濃度分子量測(cè)定中的誤判溶劑中的雜質(zhì)來(lái)自于塑料添加劑的峰樣品容器不干凈，常見(jiàn)表面活性劑的峰進(jìn)樣系統(tǒng)污染樣品在源內(nèi)碎裂，形成碎片離子分子量測(cè)定失敗的原因

a）流動(dòng)相不合適b）不揮發(fā)性鹽的影響c）成分復(fù)雜，雜質(zhì)太多d)樣品濃度不夠e）pH值不合適f）樣品在源內(nèi)分解或碎裂目標(biāo)化合物分析（1）選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）SIM用于檢測(cè)已知或目標(biāo)化合物，比全掃描方式能得到更高的靈敏度。這種數(shù)據(jù)采集的方式一般用在定量目標(biāo)化合物之前，而且往往需要已知化合物的性質(zhì)。若幾種目標(biāo)化合物用同樣的數(shù)據(jù)采集方式監(jiān)測(cè)，那么可以同時(shí)測(cè)定幾種離子。三、LC-MS的應(yīng)用醫(yī)藥學(xué)：藥物代謝、藥物動(dòng)力學(xué)、雜質(zhì)分析、天然產(chǎn)物分析生物化學(xué)：肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、糖環(huán)境化學(xué)：農(nóng)藥和農(nóng)殘分析、有機(jī)污染物、土壤/食品/水分析臨床醫(yī)學(xué)：新生兒檢查、糖化血紅蛋白（糖尿?。?、血紅蛋白變異、膽酸食品科學(xué)：香料、添加物、包裝物、蛋白質(zhì)、致癌物法醫(yī)學(xué)：濫用藥物、爆炸物、興奮劑檢測(cè)獸醫(yī)學(xué)：興奮劑、磺胺類藥物、抗體合成化學(xué)：有機(jī)金屬化合物、有機(jī)合成物有機(jī)化學(xué)：表面活性劑、染料LC-MS應(yīng)用小分子化合物分析Mesocarb(雙苯斯酮胺)

檳榔有效成分的分析檳榔含有多種人體所需的營(yíng)養(yǎng)元素和有益物質(zhì)，同時(shí)也含有多種藥理活性成分，主要包括生物堿、酚類化合物、脂肪油以及多種氨基酸和各種各樣的礦物質(zhì)等。檳榔的主要作用是由檳榔堿的功效體現(xiàn)的。檳榔堿(Arecoline)屬于生物堿，是一種含氮雜環(huán)的有機(jī)物，分子式C8H13O2N，沸點(diǎn)209℃，溶于醇、醚、氯仿和苯等有機(jī)溶劑，不溶于水。1．根據(jù)“氮規(guī)律”質(zhì)量數(shù)奇數(shù)可以得到該化合物含有奇數(shù)個(gè)N原子。2．結(jié)合計(jì)算機(jī)檢索系統(tǒng)，根據(jù)同位素豐度，對(duì)于荷質(zhì)比155的分子離子峰可以得到一個(gè)環(huán)加兩個(gè)雙鍵的數(shù)值。3．由于是正離子電離方式，中性離子丟失不多，且分子離子在首先消去一個(gè)中性分子甲基后得到最穩(wěn)定的140質(zhì)量數(shù)的最高峰。同時(shí)根據(jù)Beynon表及其最小碎片質(zhì)量數(shù)42的所有可能性可以得到該化合物只能含有不超過(guò)兩個(gè)N原子。（1個(gè)）4．對(duì)于含有雙鍵和雜環(huán)的化合物，它們的分子離子比較穩(wěn)定，這從譜圖和檢索系統(tǒng)的碎片質(zhì)量數(shù)上可以得到它們的一些穩(wěn)定的碎片峰。生物大分子分析多電荷離子指帶有2個(gè)或更多電荷的離子，常見(jiàn)于蛋白質(zhì)或多肽等離子。有機(jī)質(zhì)譜中，單電荷離子是絕大多數(shù)，只有那些不容易碎裂的基團(tuán)或分子結(jié)構(gòu)-如共軛體系結(jié)構(gòu)-才會(huì)形成多電荷離子。它的存在說(shuō)明樣品是較穩(wěn)定的。采用電噴霧的離子化技術(shù)，可產(chǎn)生帶很多電荷的離子，最后經(jīng)計(jì)算機(jī)自動(dòng)換算成單質(zhì)/荷比離子。 ESI在大氣壓和環(huán)境溫度下進(jìn)行，被分析物的分子在電離過(guò)程中通常產(chǎn)生多重質(zhì)子化的離子。下圖是典型的ESI質(zhì)譜圖，由一簇不同程度質(zhì)子化的分子離子峰組成，相鄰兩峰相差一個(gè)質(zhì)子。對(duì)于任意相鄰兩峰，由下列公式計(jì)算所含的質(zhì)子數(shù)(n)和樣品的分子量(M)。13＋14+川牛膝HPLC—MS分析tR=17.67min的色譜峰，一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)(ESI，MS其為含量最大的峰，結(jié)合杯莧甾酮(分子量為520.3)是川牛膝的主要成分，推測(cè)該離子峰為杯莧甾酮分子加合一個(gè)甲酸根后形成的準(zhǔn)分離子峰[M+HCOO]-。又其二級(jí)碎片圖中有m/z=519.2，其應(yīng)為杯莧甾酮分子失去一個(gè)質(zhì)子形成的碎片離子峰[M-H]-。有m/z=501.4，這應(yīng)是由于甾酮類物質(zhì)中含有較多的羥基，其施加碰撞能后以水分子的形式失去而形成碎片離子峰[M-H-H2O]-。再結(jié)合其它的碎片離子與杯莧甾酮的結(jié)構(gòu)相符，因此推斷該化合物為杯莧甾酮。tR=16.22min的色譜峰，一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù),結(jié)合川牛膝中成分b-胡羅卜苷的分子量(576.2)推測(cè)其是b-胡羅卜苷分子失去一個(gè)質(zhì)子而形成的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-。再結(jié)合b-胡羅卜苷的結(jié)構(gòu)中含有羥基以及其二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子531.2[M-H-H2O]-,513.0[M-H-2H2O]-,431.1、341.0、233.2，與b-胡羅卜苷的結(jié)構(gòu)相符，因此推斷該化合物為b-胡羅卜苷。麻黃類生物堿HPLC-MS結(jié)合麻黃的正離子一級(jí)質(zhì)譜全掃描圖和麻黃中三對(duì)主要生物堿的分子量(151.1、165.1、179.2)，發(fā)現(xiàn)色譜峰均為被測(cè)物質(zhì)加合一個(gè)質(zhì)子后形成的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，說(shuō)明麻黃生物堿類物質(zhì)在電噴霧電離(ESI)條件下易得到質(zhì)子而帶正電荷。麻黃中的三對(duì)同分異構(gòu)體為空間異構(gòu)，因此每對(duì)物質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜圖是相同的。由于麻黃中的三對(duì)同分異構(gòu)體的分子結(jié)構(gòu)比較相似，均含有烷基、羥基等，容易失去水分子、碳分子、烷烴等而形成相應(yīng)的碎片離子峰。根據(jù)此規(guī)律，結(jié)合三對(duì)同分異構(gòu)體麻黃堿的分子量對(duì)其成分推測(cè)如下：M/Z=152.1的分子離子峰，由其質(zhì)譜數(shù)據(jù)(ESI.MS)M/Z：152.1[M+H]+、l34.1[M+H-H2O]+、l07.1[M+H-H2O-CH3-C]+、89[M+H-2H2O-CH3-C]+，因此推斷其為去甲基麻黃堿或去甲基偽麻黃堿。m/z=166.l的分子離子峰，由其一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)m/z：166.1[M+H]+以及二級(jí)質(zhì)譜碎片離子148.1；[M+H-H2O]+、l35.1[M+H-H2O-CH2]+、124.1，推斷其為麻黃堿或偽麻黃堿。m/z=180.1的分子離子峰，由其質(zhì)譜數(shù)據(jù)m/z：l62.2[M+H-H2O]+、l47.4[M+H-H2O-CH2]+、134.1[M+H-2CH2]+、l15.9[M+H-CH2-NH4]+、l03.1[M+H-H2O-CH2-C]+、88.8，推斷其為甲基麻黃堿或甲基偽麻黃堿。高效液相色譜―電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定清開(kāi)靈復(fù)方中膽酸

采用HPLC/MS/MS技術(shù)，從清開(kāi)靈注射液中，通過(guò)分子量、二級(jí)質(zhì)譜碎片信息定性測(cè)定了清開(kāi)靈復(fù)方中的膽酸。直接進(jìn)樣實(shí)驗(yàn)。清開(kāi)靈注射液經(jīng)過(guò)初步化學(xué)處理后采用電噴霧（ESI）離子源，在負(fù)離子掃描方式下，得到一極質(zhì)譜圖、即分子離子峰[M-H]-，再用二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）掃描目標(biāo)分子離子的碎片峰。再以相同的實(shí)驗(yàn)條件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，做出其一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖。通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行分子離子峰的掃描發(fā)現(xiàn)[M-H]-的峰中有一個(gè)很強(qiáng)的407，根據(jù)樣品處理過(guò)程以及對(duì)復(fù)方各單味藥材的研究，其應(yīng)該為一有機(jī)酸的負(fù)離子峰，并初步推斷其為膽酸。（膽酸的分子量為408）。如圖所示：通過(guò)對(duì)照樣品(右)和標(biāo)準(zhǔn)品（左）的二級(jí)質(zhì)譜圖，發(fā)現(xiàn)其主要碎片峰均吻合較好。檢測(cè)硝基呋喃類代謝物以第一步測(cè)得值為母離子，做PRODUCTIONSCAN（MS2），調(diào)節(jié)CE等參數(shù)，使母，子離子都具有一定強(qiáng)度，平滑后得到MS2譜，從各母離子中各選擇2個(gè)最高的子離子，分別為

呋喃它酮AMOZ：M/Z291，262；

呋喃唑酮AOZ：M/Z134，104；

呋喃妥因AHD：M/Z134，104或178；

呋喃西林SEM：M/Z192，166，AMOZAMOZ-D5AOZAHDAHD內(nèi)標(biāo)（選252/134）SEM內(nèi)標(biāo)（選212/195）以第二步選定的離子對(duì)，例如335.1/262.2等，做MRMS