生物膜特征指標(biāo)測(cè)定方法

生物膜特征指標(biāo)測(cè)定方法生物膜特征指標(biāo)測(cè)定方法生物膜特征指標(biāo)測(cè)定方法V:1.0精細(xì)整理，僅供參考生物膜特征指標(biāo)測(cè)定方法日期：20xx年X月第2章生物膜特征指標(biāo)測(cè)定方法選擇合適的生物膜指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定和評(píng)價(jià)非常重要。本研究課題主要的生物膜指標(biāo)包括：生物膜量、生物膜胞外聚合物的量、活性生物量和生物膜的活性。下面分別介紹它們的測(cè)定方法。2.1生物膜量2.1.1生物膜的剝落生物膜固定在載體的表面，很難直接測(cè)量生物膜干重。因此，評(píng)價(jià)載體生物膜量前，必須首先把生物膜從載體表面剝落下來。生物膜的剝落方法很多，其中，有效剝落方法主要有機(jī)械剝落、超聲剝落和超聲加化學(xué)剝落。在生物膜剝落在生物膜的多項(xiàng)分析中起關(guān)鍵作用，剝落回收率的高低直接影響其他分析的精確度。（1）機(jī)械剝落。對(duì)生物膜載體使用簡(jiǎn)單的機(jī)械方法，使生物膜脫離載體的表面。這種剝落方法，簡(jiǎn)單、易于操作。但該法卻不適用于表面具有孔隙或表面粗糙度較大的載體。生物膜機(jī)械剝落方法在生物膜反應(yīng)器中得到廣泛應(yīng)用。（2）超聲剝落。利用超聲波沖擊剝落生物膜?？筛鶕?jù)具體情況，選擇合適的超聲波工作功率。（3）超聲加化學(xué)剝落。考慮到生物膜胞外聚合物對(duì)生物膜的膠聯(lián)特性，若單純使用超聲波進(jìn)行生物膜剝落，一般需要超聲波的功率較高，作用時(shí)間較長(zhǎng)。Liu（1994）提出可將生物載體首先置于1M的堿液中，并水浴30分鐘，溫度控制在60～80℃。經(jīng)處理后，生物膜與載體表面的膠聯(lián)度大大降低。這時(shí)，再經(jīng)過超聲波處理，可在較低功率及較短時(shí)間作用就可得到非常好的剝落效果。2.1.2評(píng)價(jià)生物膜量的指標(biāo)（1）生物膜干重。生物膜剝落后，含有生物膜的溶液經(jīng)事先稱重的0.45μm濾膜過濾，把濾膜置于溫控105℃的干燥箱內(nèi)，干燥至恒重，過濾前后的重量之差即為剝落生物膜干重。生物膜干重是生物膜參數(shù)中最為常用的指標(biāo)。（2）生物膜揮發(fā)性干重（VSS）。生物膜干重反映的是生物膜總量。生物膜的生物化學(xué)活性只與活性生物量相關(guān)，而生物膜揮發(fā)性干重可以反映生物膜活性生物量。為了獲得較準(zhǔn)確的活性生物量信息，在生物膜的研究中，常常選用可揮發(fā)性生物膜重(Amezianeetal.,2002)。在生物膜干重測(cè)量后，將樣品置于550℃的馬福爐內(nèi)灼燒至恒重，總干重的失重即為可揮發(fā)性生物膜部分。揮發(fā)性生物膜重量反映了生物膜中有機(jī)組分的含量。（3）生物膜TOC。細(xì)胞的結(jié)構(gòu)骨架主要是有機(jī)碳組成。通過測(cè)定生物膜總有機(jī)碳含量，即TOC，可間接了解生物膜量的變化。特別是對(duì)于硝化生物膜等增長(zhǎng)緩慢的微生物，其生物膜量一般較少，不便用直接干重法測(cè)量。在這種情況下，生物膜TOC的分析更具有準(zhǔn)確性。目前，TOC的分析已經(jīng)儀器化。（4）生物膜COD。生物膜的化學(xué)需氧量（COD）可間接描述生物膜量，在生物膜反應(yīng)器動(dòng)力學(xué)研究中應(yīng)用較廣(Liuetal.,2007)。剝落后的生物膜樣品可由傳統(tǒng)法測(cè)定生物膜COD,也可應(yīng)用半自動(dòng)法測(cè)定（Jirkaetal,1975）。2.2生物膜胞外聚合物生物膜胞外聚合物（EPS）是生物膜中圍繞在細(xì)菌周圍的高度含水的多聚大分子,其組成和物理化學(xué)屬性決定生物膜的粘附、構(gòu)型及生物學(xué)特性；EPS由多種有機(jī)物組成，包括多糖、蛋白質(zhì)、核酸、磷脂、褐藻酸、腐質(zhì)等，主要是多糖和蛋白質(zhì)(蒲曉芬等,2005)。在生物膜研究中，常常用生物膜中的胞外聚多糖和蛋白質(zhì)的量代表生物膜中EPS。2.2.1胞外聚多糖聚多糖（Polysaccharide）是細(xì)胞增長(zhǎng)過程中的一種代謝物質(zhì)，在細(xì)胞固定以及形成生物膜過程中起著重要作用。多聚糖在細(xì)胞的分泌、積累與細(xì)胞活性及其數(shù)量有關(guān)，它在生物膜研究中是經(jīng)常測(cè)定的參數(shù)之一。多聚糖的測(cè)定可根據(jù)Dubois等人（Duboisetal,1956）提出的苯酚-硫酸比色法，具體方法如下：生物膜經(jīng)剝落后懸浮于溶液中，將其pH調(diào)到中性，完全混合；取1mL懸浮樣品放入清潔試管內(nèi)，然后加入1mL50g·L-1的苯酚溶液，經(jīng)10～20s的振蕩混合后，再加入5mL95%的硫酸溶液，讓其在黑暗中反應(yīng)10min.；反應(yīng)結(jié)束后，再振蕩10s；最后，置試管于20～30℃水浴中10min.;水浴后，在490nm處比色分析。苯酚-硫酸比色法在確定生物膜多聚糖研究中已經(jīng)非常成功（Belkhadiretal,1988;Liuetal,1994）。2.2.2蛋白質(zhì)與生物膜重量概念相比，生物膜中蛋白質(zhì)最重要的特性在于它反映了生物膜的活性。蛋白質(zhì)是活性細(xì)胞的重要組成部分。一般認(rèn)為生物膜總的蛋白質(zhì)的含量不超過生物膜總重的5%（Lazarovaetal,1994）。目前，較為常用的細(xì)胞總蛋白質(zhì)的分析方法是Bradford(Bradford,1976)提出的，又稱考馬斯亮藍(lán)法；這種方法與其他蛋白質(zhì)分析方法相比具有簡(jiǎn)便、省時(shí)、準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)。具體分析方法如下：第一步要準(zhǔn)備Bradford試劑，取100mgBrilliantindocyaninG（考馬斯亮藍(lán)G-250）溶于50mL乙醇中，然后加入100mL85%的磷酸溶液，輕輕震動(dòng)均勻，最后加入超純水，并定容至1000mL,然后對(duì)其過濾處理，所得到濾液即為Bradford試劑。經(jīng)超聲波加堿液剝落的生物膜樣品，經(jīng)加入磷酸把其pH調(diào)到中性。完全混合生物膜懸浮液后，取1mL樣品放入清潔試管中，然后加入5mLBradford試劑，振蕩混合10s后，讓其在黑暗處反應(yīng)10min.。結(jié)束后，在595處比色分析。Bradford所提出的細(xì)胞蛋白質(zhì)分析法在好氧異養(yǎng)生物膜、厭氧生物膜、硝化生物膜動(dòng)力學(xué)研究中應(yīng)用極為廣泛（Belkhadiretal,1988;Capdevilleetal,1990;Chenetal.,2007）。該法的突出優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、測(cè)定簡(jiǎn)便快速以及干擾物質(zhì)少。2.2.3本課題測(cè)定胞外聚合物的方法在本課題研究中，聚多糖的測(cè)定采用苯酚-硫酸比色法；蛋白質(zhì)的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford,1976)。2.3生物膜的活性雖然生物膜中的活性物質(zhì)占生物膜總量的比例很小，但這些活性物質(zhì)卻與生物膜中的生物化學(xué)反應(yīng)密切相關(guān)。了解生物膜的活性，對(duì)研究和了解生物膜的特性具有很重要的意義（Lazarovaetal,1995;劉雨等，2000）。在本課題研究中，生物膜微生物的活性通過氯化三苯基四氮唑(TTC)-脫氫酶活性測(cè)定法進(jìn)行。利用氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC；ShanghaiReagentCo.,Ltd,Shanghai,China)的還原性產(chǎn)物TTC-甲瓚(TF)的量，來表示微生物的活性。主要步驟如下：（1）生物膜樣品的制備取10g載體生物膜，用蒸餾水潤(rùn)洗2次，置于錐形瓶中，用玻璃珠劇烈搖動(dòng)將生物膜打碎，用生理鹽水20mL稀釋，用玻棒攪動(dòng)，使成懸液，備用。（2）主要儀器和試劑氯化三苯基四氮唑(TTC)-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液:TTC分析純0.1g與葡萄糖lg共溶于100mL蒸餾水中，棕色試劑瓶保存；甲苯(分析純)；三氯甲烷(分析純)；三羥甲基氨基甲烷(Tris)-HCI緩沖溶液，pH值為8．6；其它：硫化鈉。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作在分液漏斗中依次注入l，2，3，4，5，6mL濃度為lg·L-1TTC-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，2mLTris-HCI緩沖溶液及l(fā)mL10％Na2S新配溶液,搖勻；待溶液充分顯色后，準(zhǔn)確加入甲苯溶液5mL，振搖，完全提取TF。放置片刻；待溶液分層后，取有機(jī)溶液層,移至lcm比色皿中,穩(wěn)定2min用752紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)485nm處，測(cè)對(duì)應(yīng)的吸光度(A)值，對(duì)脫氫酶活性作圖，以試劑空白作對(duì)照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（4）生物膜脫氫酶活性測(cè)定取生物膜制備液2mL于帶塞試管中，依次加入Tris-HCl緩沖液、0.1mol·L-1葡萄糖液、0.5％TTC各2mL，置入37±1℃恒溫箱中培養(yǎng)6h后取出，加2滴濃硫酸終止反應(yīng)，準(zhǔn)確加入5mL甲苯，振搖，在4000rpm下離心5min，取有機(jī)溶劑層比色。在上述條件下，將1h產(chǎn)生1μgTF的量為1個(gè)酶活力單位。2.4活性生物量2.4.1活性生物量的分析方法目前，測(cè)定生物膜中活性生物量的主要方法有平板計(jì)數(shù)法和生物化學(xué)成分分析法（何振立，1994）。前者是在顯微鏡下計(jì)數(shù)，并測(cè)定各類微生物體的體積大小，然后根據(jù)一定觀察面積上微生物的數(shù)目、體積及微生物的比重計(jì)算出每克生物膜所含的微生物量；或根據(jù)微生物體的干物質(zhì)含量及干物質(zhì)含碳量(通常為47％)，進(jìn)一步換算成每克生物膜微生物體的碳含量。微生物的比重、干物質(zhì)含量及含碳量等參數(shù)一般通過純培養(yǎng)試驗(yàn)獲得。直接計(jì)數(shù)法技術(shù)難度大，計(jì)數(shù)和體積測(cè)量都可能發(fā)生較大誤差，因此不太適宜用作常規(guī)分析(BakkenandOlsen,1983;Bratbak,1985)。后者主要有總腺苷酸法、胞壁酸法和脂磷法等，這些方法也受轉(zhuǎn)換因子的限制具有一定的不確定性；此外，這些方法，技術(shù)比較繁瑣、耗時(shí)，在某些測(cè)定中，需要比較貴重的儀器等。為方便有效地測(cè)定生物膜活性生物量，F(xiàn)indlay等人(Findlayetal.,1989)對(duì)脂磷生物化學(xué)法的提取、消化和比色等程序加以改進(jìn)，經(jīng)過改進(jìn)后，脂磷法使用更容易，適用范圍更廣泛。磷脂存在于所有活性細(xì)胞的細(xì)胞膜中，是所有細(xì)胞中生物膜（biologicalmembrane）的主要組分，這些磷脂能被非常靈敏地提取和定量；當(dāng)細(xì)胞衰亡時(shí)，磷脂會(huì)很快被降解，所以，死細(xì)胞中脂磷含量很低。因此，可以用脂磷含量近似表示活性生物量的多少，即通過測(cè)定與脂結(jié)合的磷的方法來定量生表示生物膜的活性生物量。脂磷分析法測(cè)定的是樣品的生物總量。脂磷法已經(jīng)被證明是一種測(cè)定生物膜活性生物量的好方法(Arnaizetal.,2007)。生物量的結(jié)果以nmolLipid-P·g-1填料（或nmolLipid-P·mL-1填料）表示，1nmolP約相當(dāng)于大腸桿菌（E.Coli）大小的細(xì)胞108個(gè)。2.4.2本課題測(cè)定生物膜活性生物量方法本課題實(shí)驗(yàn)采用脂磷法測(cè)定生物膜活性生物量。具體方法為：（1）試劑過硫酸鉀、抗壞血酸、鉬酸鹽溶液按總磷測(cè)定的鉬酸銨分光光度法制備。（2）工作曲線的繪制以KH2PO4溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(標(biāo)準(zhǔn)貯備液：50μgP·mL-1；標(biāo)準(zhǔn)溶液：吸取標(biāo)準(zhǔn)貯備液1mL移入50mL容量瓶中，稀釋至刻度線，搖勻，濃度為1μgP·mL-1)。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00mL，0.05mL，0.10mL，0.20mL，0.40mL，0.75mL，1.00mL，1.50mL，2.00mL加入10mL比色管中，稀釋至10mL標(biāo)線。分別向每個(gè)比色管中加入抗壞血酸0.2mL，混勻，30s后加入0.4mL鉬酸鹽溶液，充分混勻，室溫下放置15min。以水為參比，700nm波長(zhǎng)，30mm比色皿比色，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)。（3）樣品測(cè)定取適量填料，將待測(cè)物置于100mL具塞三角瓶中，加入氯仿、甲醇和水的萃取混合液(體積比為1∶2∶0.8)19mL，用力振搖10min，靜置12h。向三角瓶中加入氯仿和水各5mL，使得最終氯仿：甲醇：水為1：1：0.9,靜置12h。取出含有脂類組分的下層氯仿相5mL轉(zhuǎn)移至10mL具塞刻度試管，水浴蒸干。向試管中加入0.8mL5%過硫酸鉀溶液，并加水至10mL刻度，在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)121℃消解30min，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定消