2022年醫(yī)學(xué)專題-細(xì)菌檢測

Chapter7

食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(jiǎncè)技術(shù)第一頁，共七十八頁。學(xué)習(xí)(xuéxí)目標(biāo)掌握學(xué)習(xí)食品中菌落總數(shù)檢測程序和方法(fāngfǎ)。掌握學(xué)習(xí)食品中大腸菌群檢測程序和方法。掌握食品中菌落總數(shù)和大腸菌群檢測結(jié)果的報(bào)告方式。第二頁，共七十八頁。主要(zhǔyào)內(nèi)容食品中菌落總數(shù)的測定S1食品中大腸菌群的測定S2第三頁，共七十八頁。

S1菌落(jūnluò)總數(shù)的測定

第四頁，共七十八頁。一、菌落(jūnluò)總數(shù)

是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件(tiáojiàn)下培養(yǎng)后,所得1mL(g)或1cm2面積檢樣中所含菌落的總數(shù).以菌落形成單位（colonyformingunitCFU）表示。

第五頁，共七十八頁。二、菌落(jūnluò)總數(shù)測定的意義1、判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量。2、預(yù)測食品存用的期限長短(chángduǎn)。3、了解細(xì)菌在食品中的繁殖動態(tài)。第六頁，共七十八頁。三、菌落總數(shù)測定(cèdìng)的方法※平板傾注(qīngzhù)法＃平板表面涂布法平板表面點(diǎn)滴法第七頁，共七十八頁。四、平板傾注法測定菌落(jūnluò)總數(shù)檢驗(yàn)(jiǎnyàn)步驟(程序)：檢樣→稀釋處理→做平板→培養(yǎng)→菌落計(jì)數(shù)→報(bào)告結(jié)果第八頁，共七十八頁。（一）、樣品稀釋(xīshì)及做平板1ml1ml1ml1ml1:101:10001:1001:100001ml1ml1ml加入(jiārù)46℃營養(yǎng)瓊脂12~15ml25g/ml樣品(yàngpǐn)生理鹽水第九頁，共七十八頁。Note：檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜(bùyí)超過20min，以防止細(xì)菌有所死亡或繁殖第十頁，共七十八頁。（二）培養(yǎng)(péiyǎng)普通(pǔtōng)食品:37℃48h倒放平板清涼飲料、調(diào)味品、糕點(diǎn)、酒類：37℃24h水產(chǎn)品:30℃48h第十一頁，共七十八頁。（三）計(jì)數(shù)(jìshù)和報(bào)告

到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時間(shíjiān)，應(yīng)立即計(jì)數(shù)。如果不能立即計(jì)數(shù)，應(yīng)將平板放置于0－4℃，但不得超過24h。第十二頁，共七十八頁。（1）、單個菌做一個菌落(jūnluò)計(jì)（2）、呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，作為一個菌落計(jì)，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應(yīng)按一個菌落計(jì)算。（3）、如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。1.菌落(jūnluò)的選擇第十三頁，共七十八頁。2、平板菌落計(jì)數(shù)(jìshù)的選擇（1）、選取菌落數(shù)在30～300之間的平板（SN標(biāo)準(zhǔn)(biāozhǔn)要求為25～250個菌落），若有二個稀釋度均在30～300之間時，比值小于或等于2取平均數(shù)，比值大于2則其較小數(shù)字。第十四頁，共七十八頁。（2）、如均大于300，則取最高稀釋(xīshì)度的平均菌落數(shù)乘以稀釋(xīshì)倍數(shù)報(bào)告（3）、如均小于30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報(bào)告（4）、如菌落數(shù)有的大于300，有的又小于30，不在30～300之間，以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告（5）、如所有稀釋度均無菌落生長，則應(yīng)按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。

第十五頁，共七十八頁。3、菌落(jūnluò)數(shù)的報(bào)告菌落數(shù)在1～100時，按實(shí)有數(shù)字報(bào)告，如大于100時，則報(bào)告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計(jì)算。固體檢樣以克（g)為單位報(bào)告，液體檢樣以毫升(háoshēnɡ)（ml）為單位報(bào)告，表面涂擦則以平方厘米（cm2）報(bào)告。

第十六頁，共七十八頁。(四)、檢驗(yàn)(jiǎnyàn)注意事項(xiàng)1、對照平板出現(xiàn)幾個菌落時，要追加對照平板；2、吸管進(jìn)出瓶子或試管(shìguǎn)時，吸管口不得觸及瓶口、管口的外圍部分；3、吸管插入試樣液內(nèi)的深度不得小于2.5cm,調(diào)整時要使管尖與容器內(nèi)壁緊貼;4、進(jìn)行稀釋時,吸管口不得與稀釋液接觸;5、檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min.6、稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，不可作為檢樣計(jì)數(shù)報(bào)告的依據(jù)。第十七頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)

三、嗜熱菌（芽孢）計(jì)數(shù)

（一）儀器用具冰箱、培養(yǎng)箱、高壓滅菌(mièjūn)鍋、恒溫水浴鍋、托盤天平、可調(diào)式電爐、吸管、廣口瓶、三角瓶、平皿、試管等。

（二）培養(yǎng)基和試劑1．葡萄糖-胰蛋白胨瓊脂（同上）2．亞硫酸鹽瓊脂將胰蛋白胨10g、硫酸鈉1g、硫乙醇酸鈉5g溶解于1000mL蒸餾水中，加入5％檸酸酸鐵10mL，加入瓊脂，加熱煮沸，使瓊脂溶化，pH自然。分裝燒瓶，121℃高壓滅菌20min。3．去氧肝湯第十八頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(jiǎncè)技術(shù)（三）操作步驟將檢樣25g加入到盛有225mL無菌水的三角燒瓶內(nèi)，迅速煮沸5min以殺死細(xì)菌繁殖體及耐熱性低的芽孢，然后將燒瓶浸于冷水中冷卻。

1．平酸菌計(jì)數(shù)在5只無菌培養(yǎng)皿中各注入2mL樣液，用葡萄糖-胰蛋白瓊脂做傾注平板，凝固后在50～55℃培養(yǎng)48～72h，計(jì)算5個平板上菌落的平均數(shù)。平酸菌在葡萄糖-胰蛋白瓊脂平板上的菌落為圓形，直徑2～5mm，具不透明的中心及黃色暈，暈很狹，產(chǎn)酸弱的細(xì)菌其菌落周圍不存在，或不易觀察到。平板從培養(yǎng)箱內(nèi)取出后應(yīng)立即進(jìn)行計(jì)數(shù)，因?yàn)辄S色會很快消退(xiāotuì)。如在培養(yǎng)48h后不易辨別是否產(chǎn)酸，則可培養(yǎng)到72h。第十九頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)2．不產(chǎn)生硫化氫的嗜熱性厭氧菌檢驗(yàn)將已處理過的樣品加入等量新制備的去氧肝湯（總量為20mL）于試管中，以2％無菌瓊脂封頂，先加熱到50～55℃，然后在55℃中培養(yǎng)72h，當(dāng)有氣體生成（瓊脂塞破裂，氣味(qìwèi)似干酪）時，可以認(rèn)為有嗜熱性厭氧菌存在。

3．產(chǎn)生硫化氫的嗜熱性厭氧菌計(jì)數(shù)將已處理過的樣品加入到已熔化的亞硫酸鹽瓊脂試管中（總量為20mL），共6份。將試管浸于冷水中，培養(yǎng)基固化后，加熱到50～55℃，然后在55℃培養(yǎng)48h。能產(chǎn)生硫化氫的細(xì)菌會在亞硫酸鹽瓊脂管內(nèi)形成特征性的黑小片（因?yàn)榱蚧瘹浔晦D(zhuǎn)化為硫化鐵等硫化物）。計(jì)算黑小片數(shù)目。某些嗜熱菌不生成硫化氫，但代之以生成強(qiáng)大還原性氫，使全部培養(yǎng)基變黑色。第二十頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(jiǎncè)技術(shù)

四、厭氧菌計(jì)數(shù)

（一）儀器用具冰箱、培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、恒溫水浴鍋、托盤天平(tiānpíng)、可調(diào)式電爐、吸管、廣口瓶、三角瓶、平皿、試管等。

（二）培養(yǎng)基和試劑硫乙醇酸鹽瓊脂的配制：將胰消化干酪素15g、L-胱氨酸0.5g、酵母浸膏5g、葡萄糖5g、氯化鈉2.5g、硫乙醇酸鈉0.5g、刃天青0.001g溶解于1000mL蒸餾水中，加入瓊脂15g，加熱煮沸，使瓊脂溶化。調(diào)pH為7.0～7.1，分裝燒瓶、試管中，121℃高壓滅菌15min。第二十一頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(jiǎncè)技術(shù)（三）操作步驟1．傾注平板將檢樣稀釋液lmL，注入于已溶化并晾至45～50℃的硫乙醇酸鈉瓊脂管內(nèi)，搖勻，傾注平板。

2．疊一層瓊脂冷凝后，在其上再疊一層3％無菌瓊脂。

3．培養(yǎng)、計(jì)數(shù)凝固(nínggù)后，在37℃培養(yǎng)96h，然后取出進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。第二十二頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)

五、革蘭氏陰性菌計(jì)數(shù)

（一）儀器用具冰箱、培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、恒溫水浴鍋、托盤天平(tiānpíng)、可調(diào)式電爐、吸管、廣口瓶、三角瓶、平皿、試管等。

（二）培養(yǎng)基和試劑VRB瓊脂的制備：將胰蛋白胨7g、酵母浸膏5g、氯化鈉5g、乳糖10g、膽鹽1.5g溶解于1000mL蒸餾水中，加入瓊脂15g，加熱煮沸，使瓊脂溶化，再加入中性紅0.03g、結(jié)晶紫0.002g，再煮沸2min。pH7.4±0.2

（三）操作步驟1．制備營養(yǎng)瓊脂平板傾注15～20mL營養(yǎng)瓊脂于無菌培養(yǎng)皿中，凝固后，在37℃烘去表面水分。第二十三頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)

2．涂布吸注檢樣稀釋液0.1mL于平板上，共2份，立即用無菌L形玻棒涂開，放置片刻。

3．層疊VRB瓊脂層疊已溶化并涼到45～50℃的VRB瓊脂3～4mL。

4．培養(yǎng)、計(jì)數(shù)(jìshù)在30℃培養(yǎng)48h后，計(jì)數(shù)菌落。第二十四頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)

S2大腸菌群的測定(cèdìng)

第二十五頁，共七十八頁。一、大腸菌群

1、

什么是大腸菌群？

指一群需氧及兼性厭氧，在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的革蘭氏染色陰性無芽胞桿菌(gǎnjūn)。2、大腸菌群的組成:大腸埃希氏菌發(fā)屬、檸檬酸桿菌屬、產(chǎn)氣克雷伯氏菌屬和陰溝腸桿菌。第二十六頁，共七十八頁。屬代表種致病性埃希氏菌屬（Escherichia）大腸埃希氏菌(E.coli)腸道外感染，急性腹瀉志賀氏菌屬（Shigella）痢疾志賀氏菌(Sh.dysenteriae)細(xì)菌性痢疾愛德華氏菌屬（Edwardsiella）遲純愛德華氏菌(E.tarda)蛇類等血動物的正常腸道寄居菌，偶見于健康人或腹瀉者糞便內(nèi)沙門氏菌屬（Salmonella）傷寒沙門氏菌(S.typhi)腸熱癥、急性腸炎、敗血癥枸櫞酸桿菌屬(Citrobacter)弗勞地氏枸櫞酸桿菌(C.freundii)條件致病菌，引起繼發(fā)性感染克雷伯氏菌屬(Klebsiella)肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)肺炎，泌尿系、創(chuàng)傷感染敗血癥等陰溝腸桿菌(Enterobacter)產(chǎn)氣桿菌(E.aerogenes)很少引起原發(fā)性感染哈夫尼亞菌屬(Hafnia)蜂窩啥夫尼亞菌(H.alvei)對人無致病性沙雷氏菌屬(Serrati)粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescens)條件致病菌，引起泌尿系，呼吸道及創(chuàng)傷感染變形桿菌屬(Proteus)普通變形桿菌(P.vulgaris)食物中毒，泌尿系、呼吸道感染等耶爾森氏菌屬(Yersinia)鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis)鼠疫歐文氏菌屬(Erwinia)草原居民歐文氏菌(E.herbicola)植物寄生菌，曾從人體腸道及化膿扁桃體中分離到第二十七頁，共七十八頁。1、糞便污染的指標(biāo)菌：大腸菌群或大腸桿菌2、以大腸菌群作為糞便指標(biāo)菌原因在糞便中數(shù)量最大；在外環(huán)境(huánjìng)中存活的時間與致病菌大體相同；檢測方法簡便容易。二、大腸菌群的測定(cèdìng)意義第二十八頁，共七十八頁。3、大腸菌群的測定意義（1）、判斷食品中否受到糞便污染。（2）、有利于控制腸道傳染病的發(fā)生(fāshēng)和流行。（3）、有利于控制食品在生產(chǎn)加工、運(yùn)輸、保存等過程中的衛(wèi)生狀況。第二十九頁，共七十八頁。三、大腸菌群的生物學(xué)特性(tèxìng)1.形態(tài)與染色(rǎnsè)：革蘭氏染色(rǎnsè)陰性，無芽胞桿菌。2.發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣3.培養(yǎng)特性：在ＥＭＢ瓊脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，常有金屬光澤；在麥康凱瓊脂上的典型菌落:呈桃紅色或中心桃紅、圓形，扁平，光滑濕潤。第三十頁，共七十八頁。EMB平板照片(zhàopiàn)及原理第三十一頁，共七十八頁。麥康凱瓊脂(qióngzhī)平板Ageofcultureis24h第三十二頁，共七十八頁。大腸桿菌、大腸菌群選擇性顯色培養(yǎng)基--COLIID用于在37℃下對食品中大腸菌群和大腸桿菌進(jìn)行檢測、計(jì)數(shù)及大腸桿菌的鑒定本培養(yǎng)基含有兩種顯色物質(zhì)，可以直接識別大腸菌群（coliforms）和鑒定大腸桿菌（Escherichiacoli）,而不需附加任何試劑。

菌落顏色玫瑰紅藍(lán)色透明.

β-葡萄糖苷酶+

-

-

.

β-半乳糖苷酶+

+

-

.

大腸桿菌其它大腸菌群其它革蘭氏陰性菌.

β-半乳糖苷酶（+）大腸菌群存在β-半乳糖苷酶（+）大腸菌群存在

β-葡萄糖苷酶（+）大腸桿菌存在β-葡萄糖苷酶（-）無大腸菌群存在

第三十三頁，共七十八頁。大腸桿菌(dàchánɡɡǎnjūn)平板菌落照片

腸桿菌(gǎnjūn)掃描電鏡照片.第三十四頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)

一、乳糖發(fā)酵法（一）原理由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，即：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。因此大腸菌群的檢測一般都是按照它的定義進(jìn)行的。

（二）設(shè)備和材料恒溫恒濕培養(yǎng)箱（36℃±1℃）、冰箱（0～4℃）、顯微鏡、天平、高壓滅菌鍋。恒溫水浴（44.5℃±0.5℃）。均質(zhì)器或乳缽(rǔbō)、酒精燈、試管架、平皿（直徑為90mm）、試管、吸管、廣口瓶或三角燒瓶（500mL）、玻璃珠（直徑約5mm）、載玻片、蓋玻片等。第三十五頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(jiǎncè)技術(shù)（三）培養(yǎng)基和試劑1．乳糖(rǔtánɡ)膽鹽發(fā)酵管成分：蛋白胨20g、膽鹽（豬或?；蜓颍?g、乳糖10g、0.04%溴甲酚紫水溶液25mL、蒸餾水1000mL。制法：將蛋白胨、膽鹽、乳糖溶于水中，校正pH7.4，加入指示劑溴甲酚紫，分裝于試管，并倒放入一個小試管（杜拉姆發(fā)酵管），在121℃高壓滅菌15min，備用。

2．伊紅美藍(lán)瓊脂平板（EMB）成分：乳糖10g、蛋白胨10g、磷酸氫二鉀2g、瓊脂17g、2%伊紅Y溶液20mL、0.65%美藍(lán)溶液10mL、蒸餾水1000mL。制法：先將瓊脂加到900mL蒸餾水中，加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀、蛋白胨，混勻，使之溶解。再以蒸餾水補(bǔ)足至1000mL。校正pH值為7.2～7.4，分裝于燒瓶內(nèi)，121℃、15min高壓滅菌備用。臨用時加入乳糖并加熱融化瓊脂。冷至60℃左右以無菌手續(xù)加入滅菌的指示劑伊紅Y溶液和美藍(lán)溶液，搖勻。傾注平皿，備用。第三十六頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(jiǎncè)技術(shù)3．乳糖發(fā)酵管成分：蛋白胨20g、乳糖10g、0.04%溴甲酚紫水溶液25mL、蒸餾水1000mL。制法：將蛋白胨、乳糖溶于水中，校正pH7.4，加入指示劑溴甲酚紫，分裝(fēnzhuānɡ)于試管，并倒放入一個小試管（杜拉姆發(fā)酵管），在121℃高壓滅菌15min，備用。

4．EC肉湯成分：胰蛋白胨20g、膽鹽（3號或混合膽鹽）1.5g、乳糖5g、磷酸氫二鉀4g、磷酸二氫鉀1.5g、氯化鈉5g、蒸餾水1000mL。制法：將上述成分混合溶解后，分裝在有發(fā)酵倒管的試管中，在121℃高壓滅菌15min，最終pH為6.9±0.2，備用。第三十七頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)5．磷酸鹽緩沖稀釋液成分：磷酸二氫鉀34g、1mol/L氫氧化鈉溶液175mL、蒸餾水825mL。制法：先將磷酸鹽溶解于500mL蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉溶液校正pH7.2后，再用蒸餾水稀釋(xīshì)至1000mL，制成儲存液。取磷酸鹽緩沖儲存液1.25mL，用蒸餾水稀釋至1000mL。分裝每瓶100mL或每管10mL，在121℃高壓滅菌15min，備用。

6.生理鹽水。第三十八頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(jiǎncè)技術(shù)7.革蘭氏染色液（1）結(jié)晶紫染色液成分：結(jié)晶紫1g、95%乙醇20mL、1%草酸銨水溶液80mL。制法：將結(jié)晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合(hùnhé)。（2）革蘭氏碘液成分：碘1g、碘化鉀2g、蒸餾水300mL。制法：將碘與碘化鉀進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。（3）沙黃復(fù)染液成分：沙黃0.25g、95%乙醇10mL、蒸餾水90mL。制法：將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。第三十九頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)8．蛋白胨水（作靛基質(zhì)試驗(yàn)(shìyàn)用）成分：蛋白胨（或胰蛋白胨）20g、氯化鈉5g、蒸餾水1000mL。制法：將上述成分加熱熔化，調(diào)pH值為7.0～7.2，分裝小試管，高壓滅菌121℃、15min。

9．靛基質(zhì)試劑柯凡克試劑：將5g對二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后緩慢加入濃鹽酸25mL。試驗(yàn)方法：接種細(xì)菌于蛋白胨水中，于44℃培養(yǎng)24h。沿管壁加柯凡克試劑0.3～0.5mL，輕搖試管。陽性者于試劑層顯深玫瑰紅色。第四十頁，共七十八頁。（四）大腸菌群檢驗(yàn)(jiǎnyàn)程序圖7-3大腸菌群乳糖發(fā)酵法檢驗(yàn)(jiǎnyàn)程序第四十一頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)（五）操作步驟1．檢樣稀釋（1）以無菌操作將檢樣25mL（或g）放于含有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)(shìdàng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質(zhì)器，以8000～10000r/min的速度處理1min，做成1:10的均勻稀釋液。（2）用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL，注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻，做成1:100的稀釋液。（3）另取1mL滅菌吸管，按上條操作依次做10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管。（4）根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì)，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種3管。第四十二頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(jiǎncè)技術(shù)2．乳糖發(fā)酵試驗(yàn)將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1mL及1mL以下(yǐxià)者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種3管，置36±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h，觀察是否產(chǎn)氣。如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。

3．分離培養(yǎng)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板（EMB）上，置36℃±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18～24h，然后取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。第四十三頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(jiǎncè)技術(shù)4．證實(shí)試驗(yàn)(shìyàn)在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1～2個進(jìn)行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置36℃±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h±2h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌，即可報(bào)告為大腸菌群陽性。

5．結(jié)果報(bào)告（1）記錄詳細(xì)記錄試驗(yàn)現(xiàn)象。（2）報(bào)告根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽性的管數(shù)，查表7-2“大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表”，報(bào)告每100mL（g）大腸菌群的MPN值。第四十四頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(jiǎncè)技術(shù)第四十五頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)第四十六頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(jiǎncè)技術(shù)（六）糞大腸菌群（faecalcoliferm）的檢驗(yàn)糞大腸菌群：指一群能在44℃，24h內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣和利用色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì)，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，屬大腸埃希氏菌Ⅰ型。糞大腸菌群的唯一來源是糞便，所以它是糞便污染的確切指標(biāo)。在被檢樣品(yàngpǐn)中，如果有糞大腸菌群存在，在大腸菌群檢驗(yàn)中也被計(jì)入，大腸菌群數(shù)實(shí)際上就是總大腸菌群數(shù)。一般，大腸菌群和糞大腸菌群數(shù)均高，多考慮為近期污染；如果大腸菌群數(shù)高，而糞大腸菌群數(shù)低，則應(yīng)著重考慮糞便的遠(yuǎn)期污染。第四十七頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)1.檢樣稀釋（1）以無菌操作將檢樣25mL（或g）放于含有(hányǒu)225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質(zhì)器，以8000～10000r/min的速度處理1min，做成1:10的均勻稀釋液。（2）用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL，注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻，做成1:100的稀釋液。（3）另取1mL滅菌吸管，按上條操作依次做10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管。（4）根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì)，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種3管。第四十八頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)

2.44℃乳糖發(fā)酵試驗(yàn)取10mL1:10稀釋的檢樣，以無菌操作接種于10mL雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)（1mL及1mL以下者，用單料管），置44℃±0.5℃水浴內(nèi)，培養(yǎng)24h±2h，經(jīng)培養(yǎng)后，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為陰性。如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。

3.證實(shí)試驗(yàn)將所有產(chǎn)氣發(fā)酵管分別劃線轉(zhuǎn)種到伊紅美藍(lán)瓊脂平板（EMB）上，置36℃±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18～24h，同時取該培養(yǎng)液1～2滴接種到蛋白胨水中，置44℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h。經(jīng)培養(yǎng)后取出平板，觀察有無典型菌落生長。大腸菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常具有(jùyǒu)金屬光澤。（也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紫色，中心較深的菌落。亦常為大腸菌群，均應(yīng)注意挑選）。挑取上述可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。在蛋白胨水培養(yǎng)液中，加入靛基質(zhì)試劑約0.5mL，觀察靛基質(zhì)反應(yīng)。陽性者液面呈玫瑰紅色；陰性反應(yīng)液面呈試劑本色。第四十九頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)4．結(jié)果評定凡平板上有典型菌落，革蘭氏陰性短桿菌，靛基質(zhì)試驗(yàn)陽性者，則證實(shí)為糞大腸菌群陽性，則可報(bào)告被檢樣品中檢出糞大腸菌群。

5．結(jié)果報(bào)告根據(jù)證實(shí)為糞大腸菌群陽性管數(shù)，查表7-2“大腸菌群最可能(kěnéng)數(shù)MPN檢索表”，報(bào)告每100mL（g）糞大腸菌群的最可能數(shù)。第五十頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(jiǎncè)技術(shù)（七）說明1．MPN檢索表MPN為最大可能數(shù)（MostProbableNumber）的簡稱。這種方法，對樣品進(jìn)行連續(xù)系列進(jìn)行稀釋，加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。MPN檢索表只給了三個稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。

2．初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn)國家標(biāo)準(zhǔn)的三步法，是利用了乳糖發(fā)酵管進(jìn)行了兩次發(fā)酵試驗(yàn)，為了證實(shí)培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。初發(fā)酵陽性管，不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌，經(jīng)過證實(shí)試驗(yàn)后，有時可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗(yàn)步驟的符合率，初發(fā)酵與證實(shí)試驗(yàn)相差較大。因此，在實(shí)際檢測工作(gōngzuò)中，證實(shí)試驗(yàn)是必需的。第五十一頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(jiǎncè)技術(shù)3．乳糖發(fā)酵試驗(yàn)乳糖發(fā)酵試驗(yàn)使用乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，細(xì)菌分解糖類是依靠細(xì)菌細(xì)胞所產(chǎn)生的各種酶類的作用，細(xì)菌產(chǎn)生的分解糖的酶隨細(xì)菌種類不同而異，可以此鑒別細(xì)菌。大腸桿菌能分解乳糖而產(chǎn)生酸，使培養(yǎng)基的pH降低（指示劑變色）。這一現(xiàn)象可作為(zuòwéi)觀察結(jié)果的指標(biāo)。大腸桿菌細(xì)胞在酸性環(huán)境中，由于甲酸脫氫酶的作用，可使甲酸分解成C02和H2，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量氣體而進(jìn)入倒管中，以觀察產(chǎn)氣。第五十二頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)產(chǎn)氣量與倒管：在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)中，經(jīng)?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內(nèi)有極微量的氣泡，（有時比小米粒還?。袝r可以遇到在初發(fā)酵時產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。類似這樣的情況能否算產(chǎn)氣陰性？一般來說產(chǎn)氣量與大腸菌群檢出率呈正相關(guān)，但產(chǎn)氣量小不一定大腸菌群都是陰性，因此應(yīng)慎重處理。實(shí)驗(yàn)表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部(quánbù)充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。第五十三頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(jiǎncè)技術(shù)4．挑選菌落國家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定伊紅美藍(lán)平板為分離培養(yǎng)基，需要對初發(fā)酵陽性培養(yǎng)物接種于伊紅美藍(lán)平板分離，對典型和可疑菌落進(jìn)行觀察和證實(shí)試驗(yàn)。在該平板上，大腸菌群細(xì)菌發(fā)酵乳糖(rǔtánɡ)產(chǎn)酸，使伊紅美藍(lán)結(jié)合成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，有時還可產(chǎn)生金屬光澤。而不發(fā)酵乳糖(rǔtánɡ)的細(xì)菌如沙門氏菌、志賀氏菌等則為無色菌落。由于大腸菌群是一群細(xì)菌的總稱，在平板大腸菌群菌落的色澤、形態(tài)等方面較大腸菌更為復(fù)雜和多樣，而且與大腸菌群的檢出率密切相關(guān)。大腸菌群或糞大腸菌群菌落呈黑紫色有光澤或無光澤時，檢出率最高；紅色、粉紅色菌落檢出率較低。第五十四頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)另外，挑取菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率有密切關(guān)系，只挑取一個菌落，由于機(jī)率問題，尤其當(dāng)菌落不典型時，很難避免假陰性的出現(xiàn)。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如無典型菌落則應(yīng)多挑幾個，以免出現(xiàn)假陰性。

5．抑菌劑大腸菌群檢驗(yàn)中常用的抑菌劑有膽鹽、十二烷基硫酸鈉、洗衣粉、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等。抑菌劑的主要作用是抑制其它雜菌，特別是革蘭氏陽性菌的生長。抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌，而有利于大腸菌群細(xì)菌的生長和挑選，但對大腸菌群中的某些菌株有時也產(chǎn)生一些抑制作用。有些抑菌劑用量甚微，稱量時稍有誤差，即可對抑菌作用產(chǎn)生影響，因此抑菌劑的添加應(yīng)嚴(yán)格(yángé)按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。在膽鹽用量上，實(shí)驗(yàn)表明l％、0.5％和0.25％三個劑量間無何差異，所以本方法采用的膽鹽劑量（0.5％）是適宜的，在稱量時稍有誤差，亦不致影響大腸菌群的檢出。第五十五頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)

二、LTSE快速檢驗(yàn)法

（一）原理大腸菌群能分解乳糖，由于具有甲酸解氫酶作用于甲酸，產(chǎn)生氫和二氧化碳?xì)怏w，因此氣體的產(chǎn)生是在產(chǎn)酸的同時進(jìn)一步分解酸而形成的。根據(jù)這個原理，將樣品接種到LTSE培養(yǎng)基肉湯內(nèi)15h。看結(jié)果有無產(chǎn)氣現(xiàn)象，然后加氧化酶試驗(yàn)和涂片革蘭氏染色鏡檢結(jié)果綜合判斷(pànduàn)是否有大腸菌群的存在。

（二）設(shè)備與材料高壓蒸汽滅菌鍋、干熱滅菌箱、恒溫箱培養(yǎng)箱、天平、均質(zhì)器、顯微鏡、冰箱、接種環(huán)、載玻片、試管、童漢氏小管、刻度吸管等。第五十六頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)（三）培養(yǎng)基和試劑1．LTSE培養(yǎng)基肉湯（1號）成分：乳糖(rǔtánɡ)5g胰蛋白胨20gSDS（十二烷基硫酸鈉）0.5g氯化鈉5g磷酸氫二鈉（無水）5.74g磷酸二氫鉀（無水）1g微量元素溶液0.5mL蒸餾水1000mLpH7.0±1第五十七頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(jiǎncè)技術(shù)制法：將上述各固體成分加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH為7.0±1，冷卻后再加微量元素溶液0．5mL，邊加邊搖勻，分裝入有童漢氏小管的試管各5mL。雙料成分均加倍，即將上述LTSE肉湯濃縮2倍配制，分裝入內(nèi)有童漢氏小管的試管各10mL（僅分裝30mL的供醬油(jiàngyóu)及醬類檢驗(yàn)用），置高壓蒸汽滅菌器中以115℃滅菌20～30min，貯存于4℃冰箱或陰涼處備用。

2．氧化酶試劑（1％鹽酸二甲基對苯二胺）配制：稱取鹽酸二甲基對苯二胺0．1g，溶于蒸餾水10mL，于冰箱內(nèi)避光保存。

3．革蘭氏染液見本章本節(jié)一。第五十八頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)

（四）檢驗(yàn)程序大腸菌群LTSE快速檢驗(yàn)法檢驗(yàn)程序見圖7-4。

（五）操作步驟

1．檢樣稀釋(xīshì)

（1）以無菌操作將檢樣25mL（或25g）放于含有225mL滅菌生理鹽水的無菌瓶內(nèi)，經(jīng)研磨或充分振搖溶解成為1∶10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質(zhì)器，以8000～10000r/min的速度處理1min做成1∶10的均勻稀釋液。（2）用lmL滅菌吸管吸取1∶10稀釋液lmL，注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻，做成1∶100的稀釋液。（3）另取lmL滅菌吸管，按上項(xiàng)操作依次10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支lmL滅菌吸管。（4）根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì)，選擇3個稀釋度，每個稀釋度接種3管。第五十九頁，共七十八頁。

圖7-4大腸菌群LTSE快速(kuàisù)檢驗(yàn)法檢驗(yàn)程序第六十頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(jiǎncè)技術(shù)2．預(yù)測試驗(yàn)將待檢樣品接種于LTSE發(fā)酵管內(nèi)，接種在10mL或10mL以上者，用雙料LTSE發(fā)酵管，lmL及l(fā)mL以下者，用單料LTSE發(fā)酵管。預(yù)測試驗(yàn)采用9管法，每一稀釋(xīshì)度接種3管，置37℃±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)15h±1h，觀察結(jié)果，如有混濁并產(chǎn)氣者，即表示為陽性管。對陽性管繼續(xù)做證實(shí)試驗(yàn)。

3．證實(shí)試驗(yàn)（1）菌液涂片用直徑3～4mm的接種環(huán)挑取菌液2～3環(huán)進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。有革蘭氏陰性無芽孢桿菌，而雜菌無或者很少。（2）氧化酶試驗(yàn)吸取產(chǎn)氣管中的培養(yǎng)物約0.5～lmL，滴加氧化酶試劑2～3滴，搖勻，顯粉紅色或深紅色示為氧化酶陽性，不變色或呈試劑的本色為陰性反應(yīng)。第六十一頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)（六）結(jié)果判斷和報(bào)告如有產(chǎn)氣，氧化酶陰性、革蘭氏陰性的無芽孢桿菌存在，表示大腸菌群陽性，然后查MPN檢查表（見表7-2），計(jì)算MPN值。

（七）正確使用LTSE檢驗(yàn)方法的說明

1．方法的研制與樣品考核結(jié)果（1）LTSE法的敏感性與特異性。大腸菌群4個屬菌株在LTSE培養(yǎng)基上經(jīng)37℃，15h出現(xiàn)結(jié)果，采用多種常見的非大腸菌群的菌株檢測不酵解乳糖產(chǎn)氣，經(jīng)試驗(yàn)證明本法靈敏度高，特異性強(qiáng)，比常規(guī)法節(jié)約經(jīng)費(fèi)(jīngfèi)82．58%以上。第六十二頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)

（2）LTSE培養(yǎng)基的各種成分都是經(jīng)過了很多試驗(yàn)反復(fù)摸索研制成功的，其營養(yǎng)豐富，抑制雜菌效果強(qiáng)，具有加快目的菌生長發(fā)育和促進(jìn)發(fā)酵緩慢的大腸菌群產(chǎn)酸產(chǎn)氣的效果。在證實(shí)試驗(yàn)中增加了氧化酶試驗(yàn)反應(yīng)，具有排除非腸道桿菌對乳糖發(fā)酵產(chǎn)氣的特殊功能。本方法(fāngfǎ)不必加入指示劑，便于做證實(shí)試驗(yàn)。（3）本方法研制成功后，經(jīng)不同的衛(wèi)生監(jiān)測單位實(shí)驗(yàn)考核各類食品樣品共計(jì)703件，結(jié)果與常規(guī)法總符合率為99.3％；而與美國標(biāo)準(zhǔn)（ANSl）A-1快速法比較,其特異性與敏感性為優(yōu)。第六十三頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(jiǎncè)技術(shù)2．革蘭氏染色的涂片檢查說明本方法(fāngfǎ)加有涂片檢查，主要是進(jìn)一步證實(shí)大腸菌群的形態(tài)，因本方法(fāngfǎ)的LTSE培養(yǎng)基SDS加的量大，SDS抑制革蘭氏陽性菌的效果好且不影響大腸菌群的生長，如果檢驗(yàn)人員沒有時間，可以省去涂片和鏡檢這兩步，結(jié)果其可靠性仍在99％以上。

3．操作注意事項(xiàng)及經(jīng)驗(yàn)介紹（1）檢樣要嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，避免技術(shù)操作的差錯。由于大腸菌群是呈分裂繁殖生長，在水中往往具有聚集性及分布不均勻的現(xiàn)象，因此檢樣前固體和液體樣品如同常規(guī)法一樣，要經(jīng)過前處理。第六十四頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(jiǎncè)技術(shù)

（2）培養(yǎng)基滅菌后，童漢氏小管（小倒管）中應(yīng)無氣泡方能使用；做氧化酶試驗(yàn)的小試管要清潔干凈。（3）本方法靈敏度高，37℃15h培養(yǎng)與常規(guī)法符合率基本一致（即99％～100％），超過15h可提高檢出率。（4）初次觀察試管法氧化酶試驗(yàn)難以(nányǐ)辨別真假陽性結(jié)果，可采用氧化酶陽性結(jié)果的非腸桿菌科菌株做陽性對照，如綠膿桿菌、腦膜炎雙球菌、弧菌科菌株等等。第六十五頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)

三、TTC（氯化三苯四氮唑）顯色快速法（一）培養(yǎng)基1．TTC乳糖培養(yǎng)基（1）2％乳糖發(fā)酵管成分(chéngfèn)：乳糖20g、蛋白胨20g、蒸餾水1000mL、pH7.4。制法：將乳糖、蛋白胨溶解于蒸餾水，調(diào)節(jié)pH為7.4，分裝于含有小倒管的試管中，每管2.5mL，110℃經(jīng)15min高壓滅菌后備用。（2）TTC培養(yǎng)液成分：蛋白胨20g、氯化鈉10g、磷酸鈉（Na2HPO4·12H2O）10g、十二烷基硫酸鈉4g、蒸餾水1000mL、pH7.4。第六十六頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)制法：將以上成分(chéngfèn)加熱溶解，調(diào)pH7.4，分裝于三角瓶，于121℃經(jīng)15min滅菌后，冷至室溫，備用；臨用前加入無菌100g/L的無菌TTC水溶液8mL，輕輕搖勻。（3）分裝以無菌操作，把TTC培養(yǎng)液分裝2％乳糖管中，每管加2.5mL，培養(yǎng)后無污染者可使用。

2．三料TTC乳糖培養(yǎng)基除蒸餾水外，其他成分按TTC乳糖培養(yǎng)基3倍，TTC2倍，制法同上（加入TTC后培養(yǎng)液稍有云霧狀混濁，是正?，F(xiàn)象，不影響培養(yǎng)結(jié)果）。

（二）檢驗(yàn)方法1．接種每份樣品以無菌操作接種1mL、0.1mL及0.01mL各3管于TTC乳糖培養(yǎng)基中，如接種量為10mL，則用三料TTC乳糖培養(yǎng)基。

2．培養(yǎng)接種后，置35～37℃溫箱培養(yǎng)18～24h。第六十七頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(jiǎncè)技術(shù)

（三）結(jié)果判斷觀察TTC乳糖培養(yǎng)液有無產(chǎn)紅色及產(chǎn)氣，結(jié)果判定(pàndìng)如表7-3。表7-3顯色法大腸菌群結(jié)果判斷第六十八頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)（四）結(jié)果報(bào)告根據(jù)陽性管數(shù)，查表7-2“大腸菌群最可能數(shù)MPN檢索(jiǎnsuǒ)表”。四、DC（去氧膽酸鈉）半固體試管快速法（一）培養(yǎng)基1．成分蛋白胨1.5g氯化鈉0.5g乳糖lgK2HPO4·3H200.3g檸檬酸鐵銨0.2g10％去氧膽酸鈉水溶液lmL0.4％BTB1.6mL安氏指示劑2mL瓊脂粉（或瓊脂條0.8g）0.7g蒸餾水lOOmLpH7.2第六十九頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(jiǎncè)技術(shù)2．制法將以上固體成分加熱溶解于水，調(diào)整pH7.2，隨即加入二組指示劑與10％去氧膽酸鈉水溶液，最后煮沸3min備用。

（二）檢驗(yàn)(jiǎnyàn)方法1．樣品處理各類樣品的處理與接種量均按國標(biāo)方法要求進(jìn)行。

2．接種（1）流體樣品吸取原液3個lmL，分別注入3個滅菌試管內(nèi)，再吸取1∶10和1∶100稀釋樣品各3個lmL，分別加入滅菌試管內(nèi)，每管lmL。第七十頁，共七十八頁。食品衛(wèi)生細(xì)菌(xìjūn)的檢測技術(shù)接種lmL樣品的試管，注入已溶化并冷至50℃左右DC半固體培養(yǎng)基3mL。接種10mL樣品的試管加入3倍DC培養(yǎng)基5mL，立即將樣品與培養(yǎng)基充分混合(hùnhé)。（3）培養(yǎng)待凝固后，置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)18～24h，取出觀察結(jié)果。

（三）結(jié)果判定（1）培養(yǎng)基變橘紅色，有氣泡產(chǎn)生或瓊脂崩裂，記錄為“++”。（2）培養(yǎng)基為橘紅色，或有橘紅色菌落無氣泡和瓊脂崩裂現(xiàn)象，記錄為“+”。（3）培養(yǎng)基為綠色，有黃色菌落無氣泡和瓊脂崩裂現(xiàn)象，記錄為“土”。（4）培養(yǎng)基為綠色