詳細介紹抗體的分離純化課件

2016.12.05抗體的制備、純化及其應用1

12/12/2016抗體的分離和純化212/12/2016抗體的分離純化無論是將抗體用于研究還是用于檢測或臨床治療，均需對抗體進行分離與純化。分離：將抗體從其存在的體液或培養(yǎng)液中分離出來并加以初步純化。純化：提高分離出來的抗體的純度，并將其中的雜質控制在所需的低水平。對治療性抗體尤為重要。3

12/9/2016在樣品純化前要做的主要工作有：?除去某些雜質，如脂蛋白或者苯酚紅等。?除去大量的雜志，如粗品中的含量大的雜蛋白等。?更換緩沖液并除鹽，把樣品換到合適的緩沖液中（PH和鹽濃度），并除去沒有用處的小分子。5

12/9/2016純化前除去特定的雜質脂蛋白脂蛋白和其它含脂物質能夠阻塞色譜層析柱，最好能在純化前除去，腹水通常含有高濃度的脂蛋白。方法一：在二價離子存在的情況下，硫酸右旋葡糖酐能夠沉淀脂蛋白，沉淀可以通過離心除去。步驟如下：1．每毫升樣品中加入0.04ml10%的硫酸右旋葡糖酐和1ml1M的CaCl2；2．混合15分鐘；3．10,000g離心10分鐘；4．丟棄沉淀；5．使用脫鹽柱將樣品換到適合純化的緩沖液中；注意：離心通常能夠避免過濾時造成的蛋白非特異性吸附，血清蛋白樣品可以通過玻璃絨毛過濾以除去酯類。6

12/9/2016步驟如下:1.加入固體PVP到樣品溶液中,至最終濃度為3%(w/v);2.在4度攪拌4小時;

3.17,000g離心;

4.丟棄沉淀;5.使用脫鹽柱將樣品換到適合純化的緩沖液中;方法二:PVP(聚乙烯吡咯烷酮)能產生一個pH值依賴的沉淀效應,PVP在pH=7.0時能夠沉淀b-脂蛋白和球蛋白,但是脂蛋白不能夠在低于pH4.0時沉淀。7

12/9/2016苯酚紅是一種在實驗室細胞培養(yǎng)中的pH指示劑,雖然并不直接的影響純化,但是苯酚紅可能結合到某些純化介質上,應該盡可能早的被除去。苯酚紅能夠在pH>7時結合在陽離子柱上。苯酚紅注意：使用脫鹽柱除去苯酚紅,并且把樣品轉移到合適的緩沖液中以做進一步純化。8

12/9/2016過濾能除去顆粒物質。醋酸纖維素膜和PVDF(聚偏氟乙烯)膜能夠有效的減少對蛋白的非特異性吸附。在色譜層析前，依照色譜層析的膠粒大小選擇合適的濾膜孔徑，這些列在下表中。濾膜通常的孔徑大小色譜層析柱中柱材的顆粒大小1um90um或者更大0.45um30或者40um0.22um3，10，15um，或者需要更加干凈的樣品時采用選擇濾孔大小注意：用一個預跑來檢測目標蛋白的收率，因為有時候樣品可能被濾膜表面非特異性吸附。過濾器可能會飽和——就是濾膜有一個特定的載量，因此在建立一個純化步驟時，需要考慮這些。10（二）離心時間依據(jù)離心方法的不同，離心時間的概念也有差別。常速離心、高速離心和差速離心的離心時間，是指顆粒從離心管中樣品液的液面完全沉降到管底的時間，即沉降時間；密度梯度離心的離心時間，是指形成界限分明的區(qū)帶時間，即區(qū)帶形成時間；等密度梯度離心所需的離心時間，是指顆粒完全到達等密度點的平衡時間，即平衡時間。離心時間過長或過短，都會影響顆粒在離心管內的預期位置，降低分離效果。

12/9/201612

12/9/2016第二節(jié)沉淀分離

如果樣品中含有大量的低分子污染物,使用脫鹽柱作為第一步色譜層析制備樣品。增加鹽濃度能夠增強蛋白間的疏水相互作用,疏水性的不同導致了一個選擇性沉淀。使用沉淀法去除大量的雜質低分子污染物一、鹽析法在物質的水溶液中添加一定濃度的中性鹽，使物質的溶解度減小而沉淀析出，這一過程稱為“鹽析”。優(yōu)點：①成本低，不需要昂貴的設備；②操作簡便，安全；③對許多生物活性物質具有穩(wěn)定作用；④對pH、溫度要求不嚴格。缺點：分離效果有限14

12/9/2016沉淀劑使用的典型條件樣品類型備注硫酸銨下文有叔大于1mg/ml蛋白,特別使免疫球蛋白用于穩(wěn)定的蛋白,不會變性,上清可以直接上到HIC（疏水層析柱）,減少了脂蛋白含量右旋硫糖苷加入0.04mlof10%右旋硫糖苷和1mlof1MCaCl2/ml混勻15min并10000×g離心可用于高脂蛋白的樣品,例如腹水沉淀脂蛋白乙烯聚合物加入3%(w/v)后攪拌4小時,并17000×g離心可用于高脂蛋白的樣品,例如腹水可以選擇右旋硫糖苷PEG(Mr>4000)最多到20%血漿蛋白沒有變性,上清可以直接過離子交換或親和柱,完全除去比較困難丙酮(冷的)在0攝氏度最多到80%,在最高轉速離心后收集小球可能會不可逆的使蛋白變性,適合于小肽的制備或者制備電泳樣品聚乙烯亞胺0.1%(w/v)沉淀聚集的核酸蛋白硫化精蛋白1%(w/v)沉淀聚集的核酸蛋白硫酸鏈霉素1%(w/v)沉淀核酸辛酸1:15(w/w)抗體含量應該大于1mg/ml沉淀血清或者腹水中的大量蛋白,僅把免疫球蛋白留在溶液中常用的沉淀劑15

12/12/2016蛋白質在水溶液中的溶解度是由蛋白質親水基團、與水形成水化膜的程度、以及所帶有電荷的情況決定的。當中性鹽加入蛋白質溶液中，鹽離子對水分子的親和力大于蛋白質，于是減弱甚至消除蛋白質分子周圍的水化膜。同時，鹽離子所帶的電荷中和部分蛋白質分子表面電荷，更加導致其溶解度降低，使蛋白質分子之間聚集而沉淀。

（一）鹽析的基本原理16

12/12/2016常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等硫酸銨最為常用，其優(yōu)點是：溶解度大；溫度系數(shù)小；密度小，有利于析出蛋白的離心分離；蛋白沉淀物在2mol/L~3mol/L硫酸銨溶液中穩(wěn)定，低溫下可保存一年；價廉易得；分離效果比其它鹽好。但硫酸銨緩沖能力比較弱，pH難控制；銨離子干擾蛋白質的測定，所以有時也用其它中性鹽進行鹽析。高濃度鹽析法是粗純樣品的常用方法。

（二）鹽類和濃度的選擇硫酸銨沉淀通常作為蛋白濃縮純化的第一步。這個方法通常可以有效的除去大量白蛋白、鐵傳遞蛋白和其它大量可溶雜質。17飽和硫酸銨溶液:100ml蒸餾水中加入100g硫酸銨,攪拌溶解;1MTrisHclpH8.0;

作為第一步純化的緩沖液所需溶液:1.過濾(0.45um),或者10,000g4度離心;2.在10份樣品中加入1份TrisHcl

pH8.0,以保持pH值;3.溫和攪拌,逐滴加入硫酸銨溶液到50%飽和度,攪拌一小時;4.10,000g離心20分鐘5.去除上清,用等體積的硫酸銨重懸洗滌沉淀兩次(例如,不能夠重懸蛋白或者進一步沉淀蛋白的溶液),再次離心;6.用少量下步中所用緩沖液重懸沉淀;

7.硫酸銨可以在superdex

G25中得到除去;*通過調整硫酸銨濃度既可以沉淀目的分子,又可以沉淀雜質。??離心后丟棄脂蛋白,樣品可以通過玻璃絨毛以出去脂類。一些抗體可能被直接使用固體硫酸銨所破壞,硫酸銨沉淀應該盡可能的使用液體,在重懸時盡可能避免氣泡的產生。??在硫酸銨沉淀后,使用HIC作為后續(xù)步驟是最方便的。通常,可重復的純化過程,應該避免使用硫酸銨沉淀,而選擇用proteinG或proteinA

Sepharose柱子。通常,鹽沉淀應該在蛋白濃度低于1mg/ml時進行。加入等體積的飽和溶液(甚至35%-40%),能夠減少鐵轉移蛋白和白蛋白的污染。硫酸銨沉淀18

12/12/2016

蛋白質用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的方法有：透析法超濾法葡聚糖凝膠G50層析法。

（四）脫鹽20

12/12/2016第三節(jié)離子交換層析法離子交換層析法（ionexchangechromatography，IEC）是利用離子交換劑上可交換離子與組分中的離子發(fā)生可逆交換時結合力的差別，而進行分離的一種技術。廣泛應用于很多生命物質的分析、制備和純化等。優(yōu)點：①重現(xiàn)性好，簡單易行；②分辨力強，回收率高；③具有多孔性，表面積大、交換容量大；④具有親水性，對大分子的吸附不牢固，層析條件溫和，不致引起物質變性或失活。21

12/12/2016陽離子交換反應：R-A-H++Y+—R-A-Y++H+

陰離子交換反應：R-B+OH-+X-—R-B+X-+OH-

R代表離子交換劑的高分子聚合物基質，A-

和B+分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑中與高分子聚合物共價結合的電荷基團，H+

和OH-分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑的平衡離子，Y+

和X-分別代表溶液中的離子基團。23

12/12/2016離子交換層析對物質的分離通常是在一根充填有離子交換劑的玻璃管（1.5cm×15cm）中進行的。含有預被分離的離子的溶液通過離子交換柱時，各種離子即與離子交換劑上的荷電部位競爭結合。任何離子通過柱時的移動速率取決于與離子交換劑的親和力、電離程度和溶液中各種競爭性離子的性質和濃度。24

12/12/2016兩性離子如蛋白質、酶類和核苷酸等物質與離子交換劑的結合力，主要取決于它們的理化性質和在特定pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。大多數(shù)蛋白在生理pH（pH6～8）下帶負電荷，需用陰離子交換柱純化，極端的pH下蛋白會變性失活，應盡量避免。

洗脫可采用改變溶液的pH或離子強度，也可同時改變pH與離子強度的方法。改變pH可能對蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，一般采用改變離子強度的梯度洗脫。用鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入柱的緩沖液中鹽濃度平穩(wěn)地上升，當離子強度能夠中和蛋白的電荷時，蛋白就被從柱上洗脫下來。26

12/12/2016三、技術要點（一）離子交換劑的選擇和處理兩性離子如蛋白質、酶類和核苷酸等物質與離子交換劑的結合力，主要取決于它們的理化性質和在特定pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。大多數(shù)蛋白在生理pH（pH6～8）下帶負電荷，需用陰離子交換柱純化，極端的pH下蛋白會變性失活，應盡量避免。處理的目的：使交換劑充分溶脹，使其顆粒的孔隙增大，讓具有交換活性的電荷基團充分暴露出來，再用酸堿浸泡，除去雜質并使其帶上需要的反離子。（二）裝柱和加樣選擇平衡緩沖液的離子強度和pH時，首先要保證待分離物質的穩(wěn)定；其次是使離子交換劑與待分離物質有適當?shù)慕Y合，而不與樣品中雜質結合，以達到分離的目的。溶液的離子強度常用不影響蛋白質吸附到交換劑上的最高離子強度液，常用的離子強度為20mmol/L~50mmol/LNaCl。27

12/12/2016（三）洗脫和收集洗脫可采用改變溶液的pH或離子強度，也可同時改變pH與離子強度的方法。改變pH可能對蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，一般采用改變離子強度的梯度洗脫。用一定鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入柱的緩沖液中鹽濃度平穩(wěn)地上升，當離子強度能夠中和蛋白的電荷時，蛋白就被從柱上洗脫下來。（四）離子交換劑的再生與保存使其帶上所需的平衡離子。28

12/12/2016第四節(jié)凝膠層析（gelchromatography）

凝膠排阻層析（gelexclusionchromatography）

分子篩層析（molecularsievechromatography）是以各種多孔凝膠為固定相，當混合物隨流動相經(jīng)過凝膠層析柱時，其中各組分按其分子大小不同而被分離的技術。該法設備簡單、操作方便、重復性好、樣品回收率高，不需要有機溶劑、不改變樣品生物學活性，除常用于分離純化蛋白質、核酸、多糖、激素等物質外，還可以用于測定蛋白質的相對分子質量，以及樣品的脫鹽和濃縮等。30

12/12/201631

12/12/2016凝膠是一種不帶電的具有三維空間的多空網(wǎng)狀結構、呈珠狀顆粒的物質，每個顆粒的細微結構及篩孔的直徑均勻一致，像篩子，小的分子可以進入凝膠網(wǎng)孔，而大的分子則排阻于顆粒之外。一、基本原理32

12/12/2016（1）蛋白質混合物上柱;（2）洗脫開始，小分子擴散進入凝膠顆粒內，大分子則被排阻于顆粒之外;（3）小分子被滯留，大分子向下移動，大小分子開始分開;（4）大小分子完全分開;（5）大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在行進中。33

12/12/2016如果兩種以上不同相對分子質量的分子都能進入凝膠顆粒網(wǎng)孔，但由于它們被排阻和擴散的程度不同，在凝膠柱中所經(jīng)過的路程和時間也不同，從而彼此也可以分離開來。凝膠層析中物質的分子量不是唯一的分離依據(jù)，有些物質的分子量相同，但由于分子的形狀不同，再加上各種物質與凝膠之間存在著非特異性的吸附作用，故仍然可分開。34

12/12/2016二、常用凝膠凝膠是一類不溶于水，在水中有較大膨脹度和較好分子篩功能的化合物。常用的有：葡聚糖凝膠（dextran）聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide）瓊脂糖凝膠（agarose）聚丙烯酰胺和瓊脂糖交聯(lián)凝膠另外還有多孔玻璃珠、多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等。35

12/12/2016第五節(jié)親和層析法親和層析是利用某些生物分子之間專一可逆結合特性的一種高度專一的吸附層析類型。配體是發(fā)生親和反應的功能部位，也是載體和被親和分子之間的橋梁。配體本身必須有兩個基團：一個能與載體共價結合，連接后的配體對互補分子的親和力不會改變一個能與被親和分子結合。36

12/12/2016親和層析法有點像在釣魚，魚是我們所要的分子(B)雜夾在一堆蛋白質當中，魚餌是與B具有專一性的分子(A,上圖1)；A與B的專一性很高，只會在樣本中與B結合，而排除其它雜質(上圖2)；若把結合在吸著劑上的B溶離下來，就可以得到均質的B(上圖3)。37

12/12/201638

12/12/2016二、載體和配體的選擇（一）載體理想的載體應具備以下特性：1.高度的親水性，使固相配體易與水溶液中的生物大分子物質接近。2.惰性載體，非特異吸附性極低。3.具有相當量的化學基團可供活化，而且容易和配體結合，不改變載體和配體的基本性質。4.具有較好的理化穩(wěn)定性，不易受到周圍條件（如pH、離子強度、溫度、變性劑和去污劑等）的影響。機械性能好，具有一定的顆粒形式以保持一定的流速。5.具有均勻的多孔網(wǎng)狀結構，能使被親和的大分子自由通過而增加配體的有效濃度。常用的載體有纖維素、瓊脂糖凝膠、交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和多孔玻璃等。39

12/12/2016（二）配體優(yōu)良的配體須具備以下特性：1.配體與待分離的物質有適當?shù)挠H和力。2.配體與待分離的物質之間的親和力要有較強的特異性，不與其它組分有非特異性吸附作用。3.配體必須具備與載體共價結合的功能基團，而且這種結合不能嚴重影響配體間的親合力及結合特異性。4.配體應具有較好的穩(wěn)定性，能夠耐受偶聯(lián)以及洗脫時可能的較劇烈的條件，可以多次重復使用。40

12/12/2016親和層析中部分蛋白配體配基純化的物質蛋白A/蛋白G各種免疫球蛋白單克隆抗體各種抗原、蛋白A抗原特異性單克隆抗體、特異性多克隆抗體核苷酸核苷酸結合蛋白、核苷酸酶血凝素糖蛋白蛋白酶抑制劑蛋白酶脂肪酸脂肪酸結合蛋白、清蛋白糖血凝素、糖苷甘酶生物素親和素、生物素結合蛋白肝素凝血因子、酯酶、DNA聚合酶、連接組織蛋白酶鈣調蛋白鈣調蛋白結合酶Triazine染料脫氫酶、激酶、多聚酶、干擾素、限止酶等41

12/12/2016一種可應用的親和純化標簽：6組氨酸標簽組氨酸的咪唑側鏈可親和結合鎳、鋅和鈷等金屬離子在中性和弱堿性條件下帶組氨酸標簽的目的蛋白與鎳柱結合在低pH下用咪唑競爭洗脫42

12/12/2016抗體純化填料選擇要點一、填料種類的選擇1）血清中的抗體含量備注：ProteinA/G通常結合抗體的重鏈，而proteinL通常結合抗體的輕鏈。重鏈和輕鏈都有亞型之分，不同亞型對proteinA/G/L的結合能力不同。其中proteinL結合kappa鏈，不同物種血清總抗體中kappa鏈的比例不同。43

12/12/20162）proteinA/G/L的結合特異性BindingAffinitiesofrecombinantProteinL,ProteinA,andProteinGImmunoglobulinbindingdomains備注：上面這張表來自于pierce的說明書，給出了重要信息，對于不同抗體，ProteinA/G/L的結合能力不同。通常我們推薦首選proteinA填料，這種填料使用最廣泛，有耐堿性的填料可以選擇。只有當proteinA填料結合不好，才選擇proteinG填料。L不到最后要考慮。因為proteinL雖然在上表中看起來可以結合很多種類的抗體，其實它只結合kappa鏈，而kappa鏈本身還有進一步的亞型之分，所以對于單抗來說，不結合proteinL填料的概率是比較大的。44

12/12/2016二、結合條件的優(yōu)化1）proteinA的結合條件備注：親和填料選定以后，需要考慮結合條件，洗脫條件的優(yōu)化。只有經(jīng)過優(yōu)化，才能獲得最高的純度的同時保持抗體的活力,特別需要優(yōu)化的是pH。相對而言proteinA對抗體的結合需要稍高一點的pH,具體選擇見上表。45

12/12/2016由proteinA/G對鼠抗igG1的親和力表，我們可以知道，這兩種填料對小鼠igG1的結合，proteinG要大于proteinA,因此做鼠抗的純化，可以優(yōu)先考慮proteinG親和填料。如果使用proteinA填料，下圖的結合pH依賴性可供參考。2）proteinA結合鼠抗igG1的pH依賴性46

12/12/2016四、抗體結合親和填料的選擇1）首選proteinAproteinA有