藥監(jiān)系統(tǒng)官方培訓 核酸擴增檢測用試劑(盒)行標宣貫 北檢所 20200927

《核酸擴增檢測用試劑(盒)》YY/T

1182-2020PCR儀器光學結(jié)構(gòu)簡圖光源燈濾光鏡反射鏡CCD相機雙色鏡夫累爾透鏡多元鏡96孔透鏡組濾鏡輪96孔板定量PCR-光學檢測單元ABIEppendorf

Stratagene

Roche

CorbettBio-Rad燈+CCD

7300LC480IQ57500MyIQMx3005Mx4000鹵鎢燈+PMTLED+PMTRealplex2Realplex4LC2.0Rotorgene30

Opticon200/6000LED+PDTStepOne/PlusMiniOpticonChromo4CFX96熒光PCR原理

–

TaqManTM技術(shù)QR5’3’RTaqQRR5’5’3’3’1.

StrandDisplacement2.

CleavageTaqQ5’RTaq3.

PolymerizationComplete5’5’3’lRTaq4.

Detection5’5’3’熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量PCR常用的三個概念擴增曲線、閾值、CT值（1）、擴增曲線及擴增曲線的兩種形式左圖反映的是隨著PC反應(yīng)的進行相應(yīng)的熒光信號的變化，比較直觀，但是指數(shù)期很短；右圖反映的是熒光信號的變化量的對數(shù)與PC反應(yīng)循環(huán)數(shù)的關(guān)系，從右圖可知，指數(shù)期很明顯，在確定閾值線時具有簡單明了的特點，所以很多軟件都采用右圖的形式，這兩種實時擴增曲線可以根據(jù)實驗的需要相互轉(zhuǎn)換。熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量PCR常用的三個概念（2）、閾值線熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量PCR常用的三個概念（3）、CT值PCR過程中，各樣品擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時，所經(jīng)過的擴增循環(huán)數(shù)。熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量PCR的數(shù)學原理對于普通的PCR反應(yīng)來說=X

（

＋

）上式中，

為

輪PC循環(huán)后，目的基因PC產(chǎn)物的量；

為PC循環(huán)數(shù)；

為目的基因的初始模板量，

為PC的反應(yīng)效率，0≤E≤

。熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量PCR的數(shù)學原理由于PCR反應(yīng)體系中熒光物質(zhì)的熒光強度與PCR產(chǎn)物的量成正比，所以用熒光強度來代替PCR產(chǎn)物的量，我們可以得到：Rn=RB+X0(1+

E

n

Rs總熒光信號強度

本底信號

分子數(shù)量×單位信號強度：第

個循環(huán)時的總信號：本底：單位信號強度：起始DN數(shù)目：

PC效率熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量PCR的數(shù)學原理當循環(huán)數(shù)n等于CT值時，所有樣品熒光信號強度變化量的對數(shù)全部一致，都達到了閾值。RT=RB+X0(1+E)CTRslg(RT

-RB)=lgX0

+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgX0

+lg(RT

-RB)–lgRs此時，PCR反應(yīng)處于指數(shù)期階段，所有樣品的反應(yīng)效率E穩(wěn)定且近似相等；

lg(RT

-RB)、Rs也都相同，只有CT值和-lgX0為變量，且這兩個變量之間成一次性方程。也就是說，

所有樣品的lgX0與到達閾值時的循環(huán)數(shù)n（Ct值）呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計算出樣品中所含的模板量熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量PCR線性關(guān)系成立的條件分析CTlg(1+E)=-lgX0

+lg(RT

-RB)–lgRs（1）、PCR效率相等，在PCR擴增的指數(shù)期，E穩(wěn)定且為常數(shù)；（2）、RT

–RB

要相等；也就是說到達閾值時樣品的熒光強度與樣品的熒光本底之差要相等；（3）、樣品的單位信號強度Rs要相等，用熒光染料做熒光基團時，Rs

就是每條PCR產(chǎn)物結(jié)合熒光染料后所發(fā)出的熒光強度，此熒光強度和PCR產(chǎn)物的長短有關(guān)，PCR產(chǎn)物越長，結(jié)合的熒光染料越多，

Rs

值越大；用探針做熒光基團時，Rs

就等于PCR反應(yīng)時，Taq酶水解掉探針，探針的發(fā)光基團所發(fā)出的熒光強度，和PCR產(chǎn)物的長度沒有直接關(guān)系。6.熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量PCR線性關(guān)系成立的條件分析LogX0與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，根據(jù)未知樣品Ct值，就可以在標準曲線上計算出未知樣品初始模板量。標準曲線制作擴增曲線標準曲線105104103102101100105

104

103

102

101

100?

標準品梯度的選擇：5～6個梯度?

標準品稀釋倍數(shù)的選擇：標準品稀釋倍數(shù)通常為10熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論雙鏈核酸的熔解曲線分析對于核酸序列相同的PCR產(chǎn)物，其TM值也相同，而且其TM值在一個很小的溫度范圍內(nèi)，在此溫度區(qū)間，其序列相同的核酸雙鏈全部打開，熒光強度急劇降低，以熒光強度的變化率和溫度來作圖，則可得到如下圖：融解曲線分析對PCR產(chǎn)物特異性進行分析熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論mRNA差異表達的相對定量分析2-△△CT法該方法的前提條件是目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率相同且都為1，在試驗開始前必須分別對目的基因和內(nèi)參基因作標準曲線，看兩者擴增效率的差別，假如兩者擴增效率之間的差異小于0.1，就可以用該方法分析。而且在接下來的實驗中，無需再做標準品。該方法要求嚴格的重復，因為CT值的差異只要有很小的變化，測得的結(jié)果就會有很大的差別。該方法特別適合于樣品量不大，但是檢測的基因種類很多的情況?！逗怂釘U增檢測用試劑(盒)》起草單位起草單位標準項目名稱制/修訂北京市醫(yī)療器械檢驗所中國食品藥品檢定研究院核酸擴增檢測用試劑

修訂(盒)中山大學達安基因股份有限公司湖南圣湘生物科技有限公司上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司《核酸擴增檢測用試劑(盒)》?

YY/T1182-2010?

2010-12-27發(fā)布?

2012-06-01實施?

通用標準?

YY/T1182-2020修訂目的：–

增強其通用性；–

提高技術(shù)指標的合理性；–

增強條理性?！逗怂釘U增檢測用試劑(盒)》修訂修訂后條款號修訂后條款名稱范圍主要修訂內(nèi)容

刪除產(chǎn)品描述內(nèi)容，刪除不適用內(nèi)容“基因分型、基因芯片和病毒基因分型/突變檢測用試劑（盒）”；

增加核酸擴增方法描述，增加不適用內(nèi)容“基因測序產(chǎn)品”；1234

增加文件GB/T29791.2規(guī)范性引用術(shù)語和定義分類刪除

個術(shù)語9刪除原命名內(nèi)容5.1通用要求5.1.1~5.1.25.2.1~5.2.95.3.1~5.3.5565.2定量試劑的要求5.3定性試劑的要求技術(shù)要求試驗方法針對

技術(shù)要求的調(diào)整，進行相應(yīng)調(diào)整578標簽和使用說明略包裝、運輸和貯存略其他：刪除原附錄A《核酸擴增檢測用試劑(盒)》驗證序號

驗證單位

產(chǎn)品名稱方法學1達安人巨細胞病毒核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光法）人乳頭瘤病毒（20個型）基因分型檢測試劑盒（電化學基因傳感器法）234圣湘源奇雅培乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒解脲脲原體核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）（PCR-熒光探針法）（RT-PCR法）白血病相關(guān)融合基因檢測試劑盒BCR-ABL融合基因定量檢測試劑盒丙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒結(jié)核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑盒人免疫缺陷病毒核酸定量檢測試劑盒（熒光RT-PCR法）（實時熒光PCR法）（實時熒光PCR法）5678羅氏亞能艾康安圖PCR-熒光探針法）（α-地中海貧血基因檢測試劑盒MP乙型肝炎病毒核酸(gap-PCR法)肺炎支原體（

）核酸檢測試劑盒PCR（熒光法）(DNA)定量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）9乙型肝炎病毒（HBV天?。┖怂岫繖z測試劑盒（熒光PCR法）5.1通用要求核酸檢測國際標準項目

研制者

發(fā)布年

編號

濃度HBVDNA