流式細(xì)胞儀及其臨床應(yīng)用課件

流式細(xì)胞儀及其臨床應(yīng)用流式細(xì)胞儀及其臨床應(yīng)用一、流式細(xì)胞儀的概念二、流式細(xì)胞儀的原理與結(jié)構(gòu)三、流式細(xì)胞儀的性能指標(biāo)與質(zhì)量控制四、流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用一、流式細(xì)胞儀的概念二、流式細(xì)胞儀的原理與結(jié)構(gòu)三、流式細(xì)胞儀一、流式細(xì)胞儀的概念一、流式細(xì)胞儀的概念2-4colorcytometer10-20colorcytometersorter–high-endres1953，Parker和Horst描述一種全血細(xì)胞計(jì)數(shù)器裝置，成為流式細(xì)胞儀的雛形

1967，發(fā)展了一種液流束、照明光軸、檢測系統(tǒng)三者垂直的流式細(xì)胞儀1969，VanDillaFulwyler發(fā)明第一臺熒光檢測細(xì)胞計(jì)1975，Kohler和Milstein提出單克隆抗體技術(shù)流式細(xì)胞的發(fā)展史2-4colorcytometer10-20colo流式細(xì)胞術(shù)的概念流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,簡稱FCM）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且能夠同時檢測快速直線流動狀態(tài)中的單個細(xì)胞/生物學(xué)顆粒的多項(xiàng)物理及生物學(xué)特性，加以分析定量的技術(shù)，同時可以對特定群體加以分選。流式細(xì)胞儀（FlowCytometer）集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。流式細(xì)胞術(shù)的概念流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)檢測速度快，分析樣本量大：在極短時間內(nèi)可分析大量細(xì)胞，可以每秒鐘成千上萬個細(xì)胞的速率進(jìn)行測量，測量細(xì)胞總數(shù)可達(dá)至數(shù)百萬個可同時分析單個細(xì)胞的多種特征：使用不同熒光素標(biāo)記的單克隆抗體或熒光染料對細(xì)胞進(jìn)行多色熒光染色，通過流式細(xì)胞分析，可獲得單細(xì)胞的多種信息，使細(xì)胞亞群的識別、計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確可檢測的樣本種類多樣：各種細(xì)胞（如外周血，骨髓，細(xì)針穿刺，灌洗液，實(shí)體組織，懸浮或貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞），微生物，人工合成微球等血清、血漿、培養(yǎng)上清、細(xì)胞裂解液流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)檢測速度快，分析樣本量大：流式細(xì)胞儀的檢測范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞顆粒度細(xì)胞表面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量……

細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)/外的細(xì)胞因子激素結(jié)合位點(diǎn)、細(xì)胞受體蛋白磷酸化pH值鈣離子濃度細(xì)胞膜電位、線粒體膜電位……流式細(xì)胞儀的檢測范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞功能基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床新藥研究生物材料疾病機(jī)理等細(xì)胞表型分析按照細(xì)胞的蛋白表達(dá)（或轉(zhuǎn)染）定量按照細(xì)胞的DNA量的變化來分類和定量按照細(xì)胞功能改變（如分泌細(xì)胞因子，受體表達(dá)等）來對細(xì)胞進(jìn)行分類和定量按照細(xì)胞生物大分子的暴露來分類細(xì)胞和定量按照特定細(xì)胞的標(biāo)記對該細(xì)胞進(jìn)行上述指標(biāo)的深度研究細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞存活率檢測細(xì)胞凋亡發(fā)生率檢測細(xì)胞免疫功能改變檢測細(xì)胞周期檢測納米藥物和材料研究和應(yīng)用納米材料基礎(chǔ)研究，如半導(dǎo)體種類、組成比例、直徑大小與光譜激發(fā)納米材料的應(yīng)用，如吸收和發(fā)射性能、半衰期、標(biāo)記效率、色譜交叉和補(bǔ)償、標(biāo)記檢測等納米材料對細(xì)胞的毒性性能檢測，如凋亡、激活能力等納米材料導(dǎo)入細(xì)胞的途徑和效率研究流式細(xì)胞儀的用途基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床新藥研究生物材料疾病機(jī)理等細(xì)胞表型分析細(xì)胞生物二、流式細(xì)胞儀的原理與結(jié)構(gòu)二、流式細(xì)胞儀的原理與結(jié)構(gòu)分析型流式細(xì)胞儀分析型流式細(xì)胞儀一級標(biāo)題（微軟雅黑加粗20號字）二級標(biāo)題（微軟雅黑18號字）三級標(biāo)題（微軟雅黑16號字）四級標(biāo)題（微軟雅黑12號字）標(biāo)題（微軟雅黑加粗28號字）分選型流式細(xì)胞儀一級標(biāo)題（微軟雅黑加粗20號字）標(biāo)題（微軟雅黑加粗2流式細(xì)胞儀原理a.流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)；c.激光光源及光束成形系統(tǒng)；d.光學(xué)系統(tǒng)與信號檢測；e.存貯、顯示、分析系統(tǒng)；分選流式細(xì)胞儀原理a.流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)；c.激光光源及光束成

流式細(xì)胞儀的基本組成流式細(xì)胞儀的基本組成一、流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng)流動室側(cè)向及熒光信號前向散射光信號鞘液激光由于鞘液的作用，待測細(xì)胞被限制在液流的軸線上——流體動力學(xué)聚焦一、流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng)流動室側(cè)向及熒光信號前向散射光信號鞘一、流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng)一、流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng)一、流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng)一、流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng)液流中心由單列勻速運(yùn)動顆粒組成的液柱為了保證液流是穩(wěn)液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被檢測細(xì)胞被限制在液流的軸線上。液流中心由單列勻速運(yùn)動顆粒組成的液柱為了保證液流是穩(wěn)液，一般

二、光路系統(tǒng)與信號檢測PMT1PMT2PMT5PMT4DichroicFiltersBandpassFiltersLaserFlowcellPMT3ScatterSensorSample二、光路系統(tǒng)與信號檢測PMT1PMT2PMT5PMT1、激光光源與光束成形系統(tǒng)大多采用氬離子氣體激光器：激光（Laser）是一種相干光源，提供單波長、高強(qiáng)度及穩(wěn)定性高的光照，是細(xì)胞微弱熒光快速分析的理想光源，由于細(xì)胞快速流動，每個細(xì)胞經(jīng)過光照區(qū)的時間僅為1微秒左右，每個細(xì)胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號強(qiáng)弱，與被照射的時間和激發(fā)光的強(qiáng)度有關(guān)，因此細(xì)胞必須達(dá)到足夠的光照強(qiáng)度。1、激光光源與光束成形系統(tǒng)大多采用氬離子氣體激光器：激光光束在達(dá)到流動室前，先經(jīng)過透鏡，將其聚焦，形成幾何尺寸約為22×66μm即短軸稍大于細(xì)胞直徑的光斑。這種橢圓形光斑激光能量分布屬正態(tài)分布，為保證樣品中細(xì)胞受到的光照強(qiáng)度一致。激光光束與細(xì)胞液流呈90°角方向照射，細(xì)胞產(chǎn)生散射光和熒光。1、激光光源與光束成形系統(tǒng)激光光束在達(dá)到流動室前，先經(jīng)過透鏡，將其聚焦，形成幾何尺寸約1、激光光源與光束成形系統(tǒng)1、激光光源與光束成形系統(tǒng)光斑直徑d可由下式確定：d=4λf/πD。λ為激光波長；f為透鏡焦距；D為激光束直徑。激光光源垂直透鏡（約束激光的寬度）橫向透鏡（約束激光的高度）形成小的橢圓形激光束流動室1、激光光源與光束成形系統(tǒng)光斑直徑d可由下式確定：d=4λf/πD。λ為激光波長；f為當(dāng)細(xì)胞顆粒通過聚集的激光束時，激光向各個方向散射。與激光束方向同軸的稱前向角散射光信號（FSC）;與激光束垂直的稱為側(cè)向角散射光信號（SSC）。2、FCM散射光測量原理當(dāng)細(xì)胞顆粒通過聚集的激光束時，激光向各個方向散射。與前向散射光信號前向角散射光（FSC）細(xì)胞相對大小及其表面積側(cè)向角散射光（SSC）細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對復(fù)雜性前向散射光信號前向角散射光（FSC）細(xì)胞相對大小及其表面積側(cè)向散射光信號前向角散射光（FSC）細(xì)胞相對大小及其表面積側(cè)向角散射光（SSC）細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對復(fù)雜性側(cè)向散射光信號前向角散射光（FSC）細(xì)胞相對大小及其表面積外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖使用不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量ATOM熒光激發(fā)過程示意圖3、FCM熒光測量原理使用不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析ATOM熒光激發(fā)FITC熒光素的激發(fā)和發(fā)射光譜熒光素的使用：選擇正確的激光器；確定正確的濾光片；確定所需熒光探測器（PMT）使用不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量Ex

488nmEm520nm異硫氰酸熒光素（FITC）FITC520nmFITC熒光素的激發(fā)和發(fā)射光譜熒光素的使用：Ex488nm流式常用熒光染料violetbluegreenyelloworangeredinfra-FITC520PE575ECD615PC5665LASER488PI620400-450l450-500l500-570l570-590l<390l590-620l620-750l>750lPC7770488nm激光激發(fā)的熒光流式常用熒光染料violetblue熒光的識別——光學(xué)濾片組帶通濾片BANDPASS(BP)二向色性濾片DICHROICFILTER630/20BandPassFilter620-640nmLight550LongPassDichroicFilterReflectedlightTransmittedLightLightSource>550nmLight<550nmLight熒光的識別——光學(xué)濾片組帶通濾片BANDPASS(BPLongpass(LP)Shortpass(SP)Bandpass(BP)460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50熒光的識別——光學(xué)濾片組Longpass(LP)Shortpass流式細(xì)胞儀光路示意圖Air-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1

(FITC)575BPFL2(PE)620BPFL3

(ECD)675BP

FL4

(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL流式細(xì)胞儀光路示意圖Air-cooledArgonIon流式細(xì)胞儀的電路進(jìn)行信號檢測和分析熒光信號由光電接收器（PMT）接收，轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，可分析電壓脈沖的高度、面積和寬度電脈沖信號經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號數(shù)字信號傳送到計(jì)算機(jī)，進(jìn)行儲存、作圖、統(tǒng)計(jì)分析三、信號轉(zhuǎn)換與顯示分析流式細(xì)胞儀的電路進(jìn)行信號檢測和分析三、信號轉(zhuǎn)換與顯示分析1、電脈沖信號的產(chǎn)生及光電管和檢測系統(tǒng)1、電脈沖信號的產(chǎn)生及光電管和檢測系統(tǒng)2、光電管和檢測系統(tǒng)：放大器基本原則

--信號強(qiáng)弱差<10倍or需線性關(guān)系:使用線性放大器(如散射光,DNA分析)

--信號強(qiáng)弱差>10倍or需分析弱熒光:使用對數(shù)放大器(如熒光)2、光電管和檢測系統(tǒng)：放大器基本原則3、數(shù)據(jù)存儲FCS2.0格式常以列表模式（LISTMODE)：將每個細(xì)胞的每個檢測參量依次排列順序存儲3、數(shù)據(jù)存儲FCS2.0格式4、數(shù)據(jù)顯示直方圖（Histogram）二維點(diǎn)圖（DotPlot）等高線圖（ContourPlot）密度圖（Density）三維圖（3DPlot）等4、數(shù)據(jù)顯示直方圖（Histogram）單參數(shù)直方圖分析熒光峰的高低即在縱軸對應(yīng)的高度反映了？

熒光峰的高低即在縱軸對應(yīng)的高度反映了具有此種熒光強(qiáng)度的細(xì)胞在樣本中所占比例的相對多少，而非絕對數(shù)目單參數(shù)直方圖分析熒光峰的高低即在縱軸對應(yīng)的高度反映了？熒等高圖和密度圖等高圖和密度圖雙參數(shù)散點(diǎn)圖分析雙參數(shù)散點(diǎn)圖分析5、結(jié)果解讀百分比

——

目標(biāo)細(xì)胞占選定細(xì)胞群或所有細(xì)胞的比例絕對濃度——

目標(biāo)細(xì)胞在樣本中的濃度（cells/ul)熒光強(qiáng)度——

單個目標(biāo)細(xì)胞上表達(dá)某一個蛋白的多少變異系數(shù)——

所有目標(biāo)細(xì)胞表達(dá)某一個蛋白的離散程度5、結(jié)果解讀百分比——目標(biāo)細(xì)胞占選定細(xì)胞群或所有細(xì)胞視頻演示視頻演示四、熒光信號問題之1－參數(shù)應(yīng)用四、熒光信號問題之1－參數(shù)應(yīng)用四、熒光信號問題之2－光譜重疊FITCPE受激光照射后FITC和PE分子發(fā)射光譜相互重疊四、熒光信號問題之2－光譜重疊FITCPE受激光照射后FIT熒光補(bǔ)償（compensation）熒光補(bǔ)償是指在流式細(xì)胞多色分析中，糾正熒光素發(fā)射光譜重疊的過程，即從一個被檢測的熒光信號中去除任何其他的干擾熒光信號出現(xiàn)的時機(jī)：多色分析；存在光譜重疊時不可避免時，但可以校正如何校正：單染試驗(yàn)四、熒光信號問題之2－光譜重疊（spectraloverlap）熒光補(bǔ)償（compensation）四、熒光信號問題之2－光blankmixture8色單抗標(biāo)記檢測管5/7/3/8/56/4/19/2/45blankmixture8色單抗標(biāo)記檢測管5/7/3/8/5熒光補(bǔ)償FL1單染補(bǔ)償管熒光信號問題之－光譜重疊熒光補(bǔ)償FL1單染補(bǔ)償管熒光信號問題之－光譜重疊FL2單染補(bǔ)償管熒光補(bǔ)償四、熒光信號問題之－光譜重疊FL2單染補(bǔ)償管熒光補(bǔ)償四、熒光信號問題之－光譜重疊四、熒光信號問題之3－抗原抗體結(jié)合非特異性因素四、熒光信號問題之3－抗原抗體結(jié)合非特異性因素同型對照（IsotypeControl）：與實(shí)驗(yàn)染色的單克隆抗體特異性無關(guān)的免疫球蛋白亞型（即Fc段相同，F(xiàn)(ab’)2段不同）與染色的單克隆抗體①相同種屬來源②相同免疫球蛋白及亞型③相同熒光素標(biāo)記④相同劑量和濃度⑤但由未免疫動物血清純化而來用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面的Fc受體而產(chǎn)生的背景染色四、熒光信號問題之3－對照設(shè)置同型對照（IsotypeControl）：四、熒光信號問五、細(xì)胞分選器

當(dāng)某類細(xì)胞的特性與要分選的細(xì)胞相同時，流式細(xì)胞儀就會在這類細(xì)胞形成液滴時給含有這類細(xì)胞的液滴充以特定的電荷，帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板間的靜電場時，依所帶電荷的符號分別向左偏轉(zhuǎn)或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)。五、細(xì)胞分選器當(dāng)某類細(xì)胞的特性與要分選的細(xì)胞相同時五、細(xì)胞分選器水滴的形成壓電晶體帶動流動室振動，液流形成水滴。噴嘴的振動頻率即每秒鐘產(chǎn)生水滴的數(shù)目。當(dāng)噴嘴直徑為50μm時，信號頻率為40kHz，則每秒鐘產(chǎn)生4萬個水滴。若每秒鐘流出的細(xì)胞是1000個，則平均每40個水滴中只有一個水滴是有細(xì)胞的，其他皆為空白。水滴的充電為了分選細(xì)胞，需要細(xì)胞在經(jīng)過測量區(qū)時判斷出哪個細(xì)胞滿足了分選的條件，并產(chǎn)生一個邏輯信號，此信號驅(qū)動充電脈沖發(fā)生器，使之產(chǎn)生充電脈沖。五、細(xì)胞分選器水滴的形成五、細(xì)胞分選器水滴的偏轉(zhuǎn)當(dāng)水滴從流束上將要斷開時給整個流束充電，則水滴從流束上斷開后便帶有同極性的多余表面電荷。下落的水滴通過一對平行板電極形成的靜電場時，帶正電荷的水滴向帶負(fù)電的電極板偏轉(zhuǎn)，這樣就可用容器收集水滴。五、細(xì)胞分選器水滴的偏轉(zhuǎn)三、流式細(xì)胞儀的性能指標(biāo)與質(zhì)量控制三、流式細(xì)胞儀的性能指標(biāo)與質(zhì)量控制一、流式細(xì)胞儀的性能指標(biāo)靈敏度是衡量儀器檢測微弱信號的重要指標(biāo)。一般以能檢測到單個微球上最少標(biāo)有FITC或PE熒光分子數(shù)目來表示，現(xiàn)在的FCM均可達(dá)到檢測小于100個熒光分子的指標(biāo)。前向角散射光檢測靈敏度是指能夠檢測到的最小顆粒大小，一般目前商品化的FCM可以測量到0.2μ～0.5μ左右。儀器分辨率分辨率是衡量儀器測量精度的指標(biāo)，通常用變異系數(shù)值表示：(δ是分布的標(biāo)準(zhǔn)誤差，是分布的平均值)一、流式細(xì)胞儀的性能指標(biāo)靈敏度(δ是分布的標(biāo)準(zhǔn)誤差，是分布的一、流式細(xì)胞儀的性能指標(biāo)分析速度以每秒分析的細(xì)胞數(shù)來表示。當(dāng)細(xì)胞流過的速度超過FCM儀器響應(yīng)速度時，細(xì)胞產(chǎn)生的熒光信號就會丟失，這段時間稱為儀器的死時間。

死時間越短，儀器處理數(shù)據(jù)越快，一般可達(dá)到3000～6000個/秒左右。大型機(jī)已達(dá)到每秒幾萬個細(xì)胞。分選指標(biāo)分選速度指每秒可提取所要細(xì)胞的個數(shù)。分選純度指要分選的目的細(xì)胞占分選出細(xì)胞的百分比。分選收獲率指被分出的細(xì)胞與原來溶液中該細(xì)胞的百分比。一、流式細(xì)胞儀的性能指標(biāo)分析速度二、流式細(xì)胞儀的質(zhì)量控制光路與流路的校正確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，使儀器檢測時的變異減少到最小，從而控制儀器的CV值流路校正物中所使用的標(biāo)準(zhǔn)熒光微球，其物理性質(zhì)、生物學(xué)化學(xué)特性均經(jīng)過標(biāo)定PMT校正光電倍增管隨時間的增加，其放大功率會有所改變，對樣品檢測的靈敏度會產(chǎn)生影響。為保證樣品檢測時儀器處于最佳工作狀態(tài)，采用質(zhì)控品進(jìn)行PMT校準(zhǔn)，必要時進(jìn)行電壓補(bǔ)償。二、流式細(xì)胞儀的質(zhì)量控制光路與流路的校正二、流式細(xì)胞儀的質(zhì)量控制絕對計(jì)數(shù)校正為保證儀器在計(jì)數(shù)時的準(zhǔn)確性，儀器應(yīng)采用絕對計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品建立絕對計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)品是經(jīng)標(biāo)定的，如以計(jì)算1000個細(xì)胞為1ml，作為設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)。在樣本測定時，以此為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行絕對計(jì)數(shù)，從而獲得絕對計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)值。流路校正物中所使用的標(biāo)準(zhǔn)熒光微球，其物理性質(zhì)、生物學(xué)化學(xué)特性均經(jīng)過標(biāo)定。二、流式細(xì)胞儀的質(zhì)量控制絕對計(jì)數(shù)校正四、流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用四、流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)臨床應(yīng)用免疫感染HIV，TBNK絕對計(jì)數(shù)細(xì)胞移植的免疫狀態(tài)監(jiān)測干細(xì)胞計(jì)數(shù)HLA-B27檢查血液淋巴細(xì)胞亞群分析白血病的免疫分型網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)

陣發(fā)性血紅蛋白尿(PNH)血小板功能及相關(guān)疾病腫瘤腫瘤的細(xì)胞周期和倍體分析腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的研究流式細(xì)胞術(shù)臨床應(yīng)用免疫感染血液腫瘤CD抗原及其相關(guān)細(xì)胞群細(xì)胞群CD抗原

T細(xì)胞CD2CD3CD4CD5CD7CD8CD28CD38B細(xì)胞CD10CD19CD20-CD24CD37CD72-CD75髓系細(xì)胞CD13CD14CD15-CD17CD33CD34CD35NK細(xì)胞CD16CD56CD57CD94血小板CD31CD41CD42aCD42bCD61CD62pCD63激活抗原CD26CD30CD69CD95-CD97粘附分子CD11a-cCD18CD29CD44CD49a-f內(nèi)皮細(xì)胞CD105CD106CD109細(xì)胞因子受體CD25CD115CD117CD122CD126FCM臨床檢測的免疫學(xué)基礎(chǔ)CD抗原及其相關(guān)細(xì)胞群細(xì)胞群先天免疫獲得性免疫ImmuneRegulation免疫細(xì)胞功能概述

免疫系統(tǒng)可抵御外部病原體的入侵、清除體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞在器官移植、過敏反應(yīng)、自身免疫性疾病時過度活化則會損傷機(jī)體功能先天免疫獲得性免疫Immune免疫細(xì)胞功能概述免疫系統(tǒng)可細(xì)胞免疫功能的評價CD3+：總T細(xì)胞數(shù)量——免疫大軍的數(shù)量CD4+：輔助調(diào)節(jié)性T細(xì)胞——指揮部CD8+：殺傷性T細(xì)胞——戰(zhàn)士CD4/CD8：比例均衡Th1/Th2：活化/抑制，反饋機(jī)制——參謀Treg：負(fù)反饋——權(quán)力制約CD69：早期活化——戰(zhàn)斗準(zhǔn)備HLA-DR：持續(xù)活化——投入戰(zhàn)斗NK：免疫監(jiān)視——警察單核巨噬細(xì)胞、DC——情報(bào)員細(xì)胞免疫功能的評價CD3+：總T細(xì)胞數(shù)量——免疫大軍的數(shù)量免疫細(xì)胞分類——淋巴細(xì)胞亞群InnateImmuneResponse(noantigenspecificity,nomemory)AdaptiveImmuneResponse(specificitytoantigensafterpresentation,memorycompartment)NKTBT8CD3-CD56+CD3+CD8+T4TregTH1FoxP3+CD25++CD127+/-TH17PCIFNIL-2TNFIL-4IL-6IL-10IL17CD38++CD138+memBCD27+IgM+(-)CD3+CD4+CD3+CD19+TH2免疫細(xì)胞分類——淋巴細(xì)胞亞群InnateImmuneRe淋巴細(xì)胞的功能淋巴細(xì)胞的功能淋巴細(xì)胞的功能淋巴細(xì)胞的功能流式檢測在感染性疾病中的意義感染性疾病的鑒別診斷病毒性感染：CD4+T細(xì)胞減少，CD4/CD8比值倒置胞內(nèi)菌、寄生蟲感染：NK細(xì)胞、單核細(xì)胞增多細(xì)菌性感染：無上述變化病情進(jìn)展判斷細(xì)菌性感染：嚴(yán)重細(xì)菌性感染CD64炎癥指數(shù)>5，正常人

1~2，一般感染2~5

病毒性感染：病情往往與CD4+T細(xì)胞減少、CD4/CD8比值倒置程度正相關(guān)，HIV尤為明顯

流式檢測在感染性疾病中的意義感染性疾病的鑒別診斷淋巴細(xì)胞亞群檢測淋巴細(xì)胞亞群檢測HIV感染患者CD4陽性T細(xì)胞的絕對計(jì)數(shù)HIV入侵人體的目標(biāo)細(xì)胞是CD4T細(xì)胞，感染后期能嚴(yán)重破壞T細(xì)胞，引起CD4細(xì)胞的減少CD4細(xì)胞的計(jì)數(shù)是診斷、療效觀察和預(yù)后的最重要指標(biāo)CD4細(xì)胞絕對數(shù)量如果低于300細(xì)胞/ul，需要服藥治療HIV感染患者CD4陽性T細(xì)胞的絕對計(jì)數(shù)HIV入侵人體的目標(biāo)流式檢測在腫瘤性疾病中的意義病情提示與評價腫瘤早期：CD4+T細(xì)胞減少，NK細(xì)胞比例相對明顯升高腫瘤晚期：CD4+T、NK淋巴細(xì)胞均減少病情進(jìn)展：抑制性T細(xì)胞（CD8+CD28-T細(xì)胞）、調(diào)節(jié)性T

細(xì)胞（CD4+CD25+T細(xì)胞）比例與病情進(jìn)展正相關(guān)腫瘤及癌前病變：細(xì)胞周期及DNA異倍體檢測，增殖期細(xì)胞>20%提示腫瘤生長迅速，出現(xiàn)非整數(shù)倍體細(xì)胞提示預(yù)后不良流式檢測在腫瘤性疾病中的意義病情提示與評價病情進(jìn)展評價病情進(jìn)展評價療效評價手術(shù)和化療后，CD4+T細(xì)胞、CD4/CD8下降，于數(shù)天后開始恢復(fù)，恢復(fù)程度較好提示治療有效，反之則提示治療對機(jī)體損傷大于治療作用，宜調(diào)整治療方案細(xì)胞治療目前已有將患者的免疫細(xì)胞（T、NK、DC細(xì)胞）分離培養(yǎng)并回輸腫瘤過繼免疫治療方法治療方案評價療效評價治療方案評價調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分析－CD4+CD25+FOXP3+腫瘤細(xì)胞能誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制免疫功能在外周血、骨髓中腫瘤病人的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞含量多于正常人群調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分析－CD4+CD25+FOXP3+腫瘤細(xì)胞能誘DNA倍體檢測G0/G1SG2/MG0：靜止期G1：DNA合成前期S：DNA合成期G2：DNA合成后期M：有絲分裂期增殖期細(xì)胞（G2/M+S期）>20%提示腫瘤生長迅速，出現(xiàn)非整數(shù)倍體細(xì)胞提示預(yù)后不良DNA倍體檢測G0/G1SG2/MG0：靜止期增殖期細(xì)胞（G流式細(xì)胞儀的應(yīng)用—血液白血病和淋巴瘤免疫分型殘留白血病造血干細(xì)胞計(jì)數(shù)PNH診斷網(wǎng)織紅細(xì)胞分析血小板分析流式細(xì)胞儀的應(yīng)用—血液白血病和淋巴瘤免疫分型正常成人骨髓標(biāo)本正常粒細(xì)胞：約占40-60%，表達(dá)CD11b、CD13、CD33、CD15、CD16、CD10、CD64,不表達(dá)CD34、HLA-DR、CD14、CD117有核紅細(xì)胞：<50%,表達(dá)GPA單核細(xì)胞：約占2-8%，表達(dá)CD11b、CD64、CD14、HLA-DR，不表達(dá)CD34、CD117成熟淋巴細(xì)胞：約占20-40%T細(xì)胞：表達(dá)CD3、CD4、CD8、CD2、CD5、CD7,不表達(dá)CD10、CD34、TDT等

B細(xì)胞：表達(dá)CD19、CD20、CD22，不表達(dá)CD10、CD34、TDT等NK細(xì)胞：CD3-(CD16+CD56)+正常幼稚B細(xì)胞：<5.0%,表達(dá)CD10、CD19、CD22、弱表達(dá)CD20，少量CD10stCD34+TDT+幼稚髓系細(xì)胞：〈5.0％正常成人骨髓標(biāo)本正常粒細(xì)胞：約占40-60%，表達(dá)CD11b免疫分型常用的抗體AMLCD34、CD117、CD33、CD13、HLA-DR、CD11b、CD15、CD64、CD14、CD65s、MPO懷疑M6加做CD71、GPA懷疑M7加做CD61、CD41B-ALLCD34、CD10、CD19、CD20、CD22、c/mIg、TDT、cCD22/CD79aT-ALLCD34、CD10、CD3、CD4、CD8、CD2、CD5、CD7、HLA-DR、CD1a、TDT、cCD3NK細(xì)胞CD16、CD56、CD57漿細(xì)胞：CD38、CD138、cκ、cλ、CD19、CD56免疫分型常用的抗體AML示例：B-ALL

初篩CD19+CD7-CD33-CD10+/-CD117-示例：B-ALL

初篩CD19+CD7-CD33-CD10+干細(xì)胞計(jì)數(shù)CD34在骨髓和外周血的未成熟造血細(xì)胞和所有具有造血潛能的集落形成細(xì)胞上表達(dá)。包括單能和多能祖細(xì)胞。

干細(xì)胞計(jì)數(shù)，對于有劑量要求的干細(xì)胞移植方案十分重要，此重要性也體現(xiàn)在動員，及白細(xì)胞分離過程中，如通過計(jì)數(shù)細(xì)胞水平判斷動員是否成功，何時為最佳提取時間，以及提取的干細(xì)胞數(shù)量是否足夠等。研究表明輸入病人體內(nèi)的CD34細(xì)胞相對計(jì)量決定于每公斤體重輸入的CD34總數(shù)，此閾值為2-5×106細(xì)胞/kg。干細(xì)胞計(jì)數(shù)CD34在骨髓和外周血的未成熟造血細(xì)胞和陣發(fā)性血紅蛋白尿PNH陣發(fā)性血紅蛋白尿是由于紅細(xì)胞膜的獲得性缺陷，對激活補(bǔ)體異常敏感的一種慢性血管內(nèi)溶血,由于pig-a基因突變而導(dǎo)致GPI錨連蛋白缺失或部分缺失，使得一些原本通過GPI錨定在細(xì)胞膜上的蛋白（如CD55、CD59）無法發(fā)揮正常功能?；颊唧w內(nèi)紅細(xì)胞呈不均一性利用流式細(xì)胞術(shù)和CD55和CD59單克隆抗體，對PNH患者紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和血小板進(jìn)行分析，證實(shí)存在膜蛋白表達(dá)缺陷的血細(xì)胞，并計(jì)算缺陷細(xì)胞在全血中所占比例流式細(xì)胞術(shù)已經(jīng)取代了傳統(tǒng)的Ham實(shí)驗(yàn)，成為PNH診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。陣發(fā)性血紅蛋白尿PNH陣發(fā)性血紅蛋白尿是由于紅細(xì)胞膜的獲得性PNH檢測A正常人B–D病人PNH檢測A正常人本章小結(jié)流式細(xì)胞術(shù)和流式細(xì)胞儀的基本概念。流式細(xì)胞儀的基本原理、流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)、主要性能指標(biāo)、質(zhì)量控制以及流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用。本章小結(jié)流式細(xì)胞術(shù)和流式細(xì)胞儀的基本概念。做最優(yōu)秀的第三方檢測機(jī)構(gòu)TOBETHEBESTINDEPENDENTLABORATORIES（此處內(nèi)容可根據(jù)需要更換）謝謝!做最優(yōu)秀的第三方檢測機(jī)構(gòu)（此處內(nèi)容可根單細(xì)胞液柱已標(biāo)記的單細(xì)胞懸液和鞘液硅化管流動室噴嘴熒光檢測系統(tǒng)和散射光感受系統(tǒng)收集光信號熒光染料被激發(fā)發(fā)光光電倍增管脈沖信號計(jì)算機(jī)系統(tǒng)分析結(jié)果放大垂直相交形成穩(wěn)態(tài)水平激光與之單細(xì)胞液柱已標(biāo)記的單細(xì)胞懸液和鞘液硅化管流動室噴嘴熒光檢測系流式細(xì)胞儀及其臨床應(yīng)用流式細(xì)胞儀及其臨床應(yīng)用一、流式細(xì)胞儀的概念二、流式細(xì)胞儀的原理與結(jié)構(gòu)三、流式細(xì)胞儀的性能指標(biāo)與質(zhì)量控制四、流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用一、流式細(xì)胞儀的概念二、流式細(xì)胞儀的原理與結(jié)構(gòu)三、流式細(xì)胞儀一、流式細(xì)胞儀的概念一、流式細(xì)胞儀的概念2-4colorcytometer10-20colorcytometersorter–high-endres1953，Parker和Horst描述一種全血細(xì)胞計(jì)數(shù)器裝置，成為流式細(xì)胞儀的雛形

1967，發(fā)展了一種液流束、照明光軸、檢測系統(tǒng)三者垂直的流式細(xì)胞儀1969，VanDillaFulwyler發(fā)明第一臺熒光檢測細(xì)胞計(jì)1975，Kohler和Milstein提出單克隆抗體技術(shù)流式細(xì)胞的發(fā)展史2-4colorcytometer10-20colo流式細(xì)胞術(shù)的概念流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,簡稱FCM）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且能夠同時檢測快速直線流動狀態(tài)中的單個細(xì)胞/生物學(xué)顆粒的多項(xiàng)物理及生物學(xué)特性，加以分析定量的技術(shù)，同時可以對特定群體加以分選。流式細(xì)胞儀（FlowCytometer）集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。流式細(xì)胞術(shù)的概念流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)檢測速度快，分析樣本量大：在極短時間內(nèi)可分析大量細(xì)胞，可以每秒鐘成千上萬個細(xì)胞的速率進(jìn)行測量，測量細(xì)胞總數(shù)可達(dá)至數(shù)百萬個可同時分析單個細(xì)胞的多種特征：使用不同熒光素標(biāo)記的單克隆抗體或熒光染料對細(xì)胞進(jìn)行多色熒光染色，通過流式細(xì)胞分析，可獲得單細(xì)胞的多種信息，使細(xì)胞亞群的識別、計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確可檢測的樣本種類多樣：各種細(xì)胞（如外周血，骨髓，細(xì)針穿刺，灌洗液，實(shí)體組織，懸浮或貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞），微生物，人工合成微球等血清、血漿、培養(yǎng)上清、細(xì)胞裂解液流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)檢測速度快，分析樣本量大：流式細(xì)胞儀的檢測范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞顆粒度細(xì)胞表面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量……

細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)/外的細(xì)胞因子激素結(jié)合位點(diǎn)、細(xì)胞受體蛋白磷酸化pH值鈣離子濃度細(xì)胞膜電位、線粒體膜電位……流式細(xì)胞儀的檢測范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞功能基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床新藥研究生物材料疾病機(jī)理等細(xì)胞表型分析按照細(xì)胞的蛋白表達(dá)（或轉(zhuǎn)染）定量按照細(xì)胞的DNA量的變化來分類和定量按照細(xì)胞功能改變（如分泌細(xì)胞因子，受體表達(dá)等）來對細(xì)胞進(jìn)行分類和定量按照細(xì)胞生物大分子的暴露來分類細(xì)胞和定量按照特定細(xì)胞的標(biāo)記對該細(xì)胞進(jìn)行上述指標(biāo)的深度研究細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞存活率檢測細(xì)胞凋亡發(fā)生率檢測細(xì)胞免疫功能改變檢測細(xì)胞周期檢測納米藥物和材料研究和應(yīng)用納米材料基礎(chǔ)研究，如半導(dǎo)體種類、組成比例、直徑大小與光譜激發(fā)納米材料的應(yīng)用，如吸收和發(fā)射性能、半衰期、標(biāo)記效率、色譜交叉和補(bǔ)償、標(biāo)記檢測等納米材料對細(xì)胞的毒性性能檢測，如凋亡、激活能力等納米材料導(dǎo)入細(xì)胞的途徑和效率研究流式細(xì)胞儀的用途基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床新藥研究生物材料疾病機(jī)理等細(xì)胞表型分析細(xì)胞生物二、流式細(xì)胞儀的原理與結(jié)構(gòu)二、流式細(xì)胞儀的原理與結(jié)構(gòu)分析型流式細(xì)胞儀分析型流式細(xì)胞儀一級標(biāo)題（微軟雅黑加粗20號字）二級標(biāo)題（微軟雅黑18號字）三級標(biāo)題（微軟雅黑16號字）四級標(biāo)題（微軟雅黑12號字）標(biāo)題（微軟雅黑加粗28號字）分選型流式細(xì)胞儀一級標(biāo)題（微軟雅黑加粗20號字）標(biāo)題（微軟雅黑加粗2流式細(xì)胞儀原理a.流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)；c.激光光源及光束成形系統(tǒng)；d.光學(xué)系統(tǒng)與信號檢測；e.存貯、顯示、分析系統(tǒng)；分選流式細(xì)胞儀原理a.流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)；c.激光光源及光束成

流式細(xì)胞儀的基本組成流式細(xì)胞儀的基本組成一、流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng)流動室側(cè)向及熒光信號前向散射光信號鞘液激光由于鞘液的作用，待測細(xì)胞被限制在液流的軸線上——流體動力學(xué)聚焦一、流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng)流動室側(cè)向及熒光信號前向散射光信號鞘一、流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng)一、流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng)一、流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng)一、流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng)液流中心由單列勻速運(yùn)動顆粒組成的液柱為了保證液流是穩(wěn)液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被檢測細(xì)胞被限制在液流的軸線上。液流中心由單列勻速運(yùn)動顆粒組成的液柱為了保證液流是穩(wěn)液，一般

二、光路系統(tǒng)與信號檢測PMT1PMT2PMT5PMT4DichroicFiltersBandpassFiltersLaserFlowcellPMT3ScatterSensorSample二、光路系統(tǒng)與信號檢測PMT1PMT2PMT5PMT1、激光光源與光束成形系統(tǒng)大多采用氬離子氣體激光器：激光（Laser）是一種相干光源，提供單波長、高強(qiáng)度及穩(wěn)定性高的光照，是細(xì)胞微弱熒光快速分析的理想光源，由于細(xì)胞快速流動，每個細(xì)胞經(jīng)過光照區(qū)的時間僅為1微秒左右，每個細(xì)胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號強(qiáng)弱，與被照射的時間和激發(fā)光的強(qiáng)度有關(guān)，因此細(xì)胞必須達(dá)到足夠的光照強(qiáng)度。1、激光光源與光束成形系統(tǒng)大多采用氬離子氣體激光器：激光光束在達(dá)到流動室前，先經(jīng)過透鏡，將其聚焦，形成幾何尺寸約為22×66μm即短軸稍大于細(xì)胞直徑的光斑。這種橢圓形光斑激光能量分布屬正態(tài)分布，為保證樣品中細(xì)胞受到的光照強(qiáng)度一致。激光光束與細(xì)胞液流呈90°角方向照射，細(xì)胞產(chǎn)生散射光和熒光。1、激光光源與光束成形系統(tǒng)激光光束在達(dá)到流動室前，先經(jīng)過透鏡，將其聚焦，形成幾何尺寸約1、激光光源與光束成形系統(tǒng)1、激光光源與光束成形系統(tǒng)光斑直徑d可由下式確定：d=4λf/πD。λ為激光波長；f為透鏡焦距；D為激光束直徑。激光光源垂直透鏡（約束激光的寬度）橫向透鏡（約束激光的高度）形成小的橢圓形激光束流動室1、激光光源與光束成形系統(tǒng)光斑直徑d可由下式確定：d=4λf/πD。λ為激光波長；f為當(dāng)細(xì)胞顆粒通過聚集的激光束時，激光向各個方向散射。與激光束方向同軸的稱前向角散射光信號（FSC）;與激光束垂直的稱為側(cè)向角散射光信號（SSC）。2、FCM散射光測量原理當(dāng)細(xì)胞顆粒通過聚集的激光束時，激光向各個方向散射。與前向散射光信號前向角散射光（FSC）細(xì)胞相對大小及其表面積側(cè)向角散射光（SSC）細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對復(fù)雜性前向散射光信號前向角散射光（FSC）細(xì)胞相對大小及其表面積側(cè)向散射光信號前向角散射光（FSC）細(xì)胞相對大小及其表面積側(cè)向角散射光（SSC）細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對復(fù)雜性側(cè)向散射光信號前向角散射光（FSC）細(xì)胞相對大小及其表面積外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖使用不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量ATOM熒光激發(fā)過程示意圖3、FCM熒光測量原理使用不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析ATOM熒光激發(fā)FITC熒光素的激發(fā)和發(fā)射光譜熒光素的使用：選擇正確的激光器；確定正確的濾光片；確定所需熒光探測器（PMT）使用不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量Ex

488nmEm520nm異硫氰酸熒光素（FITC）FITC520nmFITC熒光素的激發(fā)和發(fā)射光譜熒光素的使用：Ex488nm流式常用熒光染料violetbluegreenyelloworangeredinfra-FITC520PE575ECD615PC5665LASER488PI620400-450l450-500l500-570l570-590l<390l590-620l620-750l>750lPC7770488nm激光激發(fā)的熒光流式常用熒光染料violetblue熒光的識別——光學(xué)濾片組帶通濾片BANDPASS(BP)二向色性濾片DICHROICFILTER630/20BandPassFilter620-640nmLight550LongPassDichroicFilterReflectedlightTransmittedLightLightSource>550nmLight<550nmLight熒光的識別——光學(xué)濾片組帶通濾片BANDPASS(BPLongpass(LP)Shortpass(SP)Bandpass(BP)460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50熒光的識別——光學(xué)濾片組Longpass(LP)Shortpass流式細(xì)胞儀光路示意圖Air-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1

(FITC)575BPFL2(PE)620BPFL3

(ECD)675BP

FL4

(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL流式細(xì)胞儀光路示意圖Air-cooledArgonIon流式細(xì)胞儀的電路進(jìn)行信號檢測和分析熒光信號由光電接收器（PMT）接收，轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枺煞治鲭妷好}沖的高度、面積和寬度電脈沖信號經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號數(shù)字信號傳送到計(jì)算機(jī)，進(jìn)行儲存、作圖、統(tǒng)計(jì)分析三、信號轉(zhuǎn)換與顯示分析流式細(xì)胞儀的電路進(jìn)行信號檢測和分析三、信號轉(zhuǎn)換與顯示分析1、電脈沖信號的產(chǎn)生及光電管和檢測系統(tǒng)1、電脈沖信號的產(chǎn)生及光電管和檢測系統(tǒng)2、光電管和檢測系統(tǒng)：放大器基本原則

--信號強(qiáng)弱差<10倍or需線性關(guān)系:使用線性放大器(如散射光,DNA分析)

--信號強(qiáng)弱差>10倍or需分析弱熒光:使用對數(shù)放大器(如熒光)2、光電管和檢測系統(tǒng)：放大器基本原則3、數(shù)據(jù)存儲FCS2.0格式常以列表模式（LISTMODE)：將每個細(xì)胞的每個檢測參量依次排列順序存儲3、數(shù)據(jù)存儲FCS2.0格式4、數(shù)據(jù)顯示直方圖（Histogram）二維點(diǎn)圖（DotPlot）等高線圖（ContourPlot）密度圖（Density）三維圖（3DPlot）等4、數(shù)據(jù)顯示直方圖（Histogram）單參數(shù)直方圖分析熒光峰的高低即在縱軸對應(yīng)的高度反映了？

熒光峰的高低即在縱軸對應(yīng)的高度反映了具有此種熒光強(qiáng)度的細(xì)胞在樣本中所占比例的相對多少，而非絕對數(shù)目單參數(shù)直方圖分析熒光峰的高低即在縱軸對應(yīng)的高度反映了？熒等高圖和密度圖等高圖和密度圖雙參數(shù)散點(diǎn)圖分析雙參數(shù)散點(diǎn)圖分析5、結(jié)果解讀百分比

——

目標(biāo)細(xì)胞占選定細(xì)胞群或所有細(xì)胞的比例絕對濃度——

目標(biāo)細(xì)胞在樣本中的濃度（cells/ul)熒光強(qiáng)度——

單個目標(biāo)細(xì)胞上表達(dá)某一個蛋白的多少變異系數(shù)——

所有目標(biāo)細(xì)胞表達(dá)某一個蛋白的離散程度5、結(jié)果解讀百分比——目標(biāo)細(xì)胞占選定細(xì)胞群或所有細(xì)胞視頻演示視頻演示四、熒光信號問題之1－參數(shù)應(yīng)用四、熒光信號問題之1－參數(shù)應(yīng)用四、熒光信號問題之2－光譜重疊FITCPE受激光照射后FITC和PE分子發(fā)射光譜相互重疊四、熒光信號問題之2－光譜重疊FITCPE受激光照射后FIT熒光補(bǔ)償（compensation）熒光補(bǔ)償是指在流式細(xì)胞多色分析中，糾正熒光素發(fā)射光譜重疊的過程，即從一個被檢測的熒光信號中去除任何其他的干擾熒光信號出現(xiàn)的時機(jī)：多色分析；存在光譜重疊時不可避免時，但可以校正如何校正：單染試驗(yàn)四、熒光信號問題之2－光譜重疊（spectraloverlap）熒光補(bǔ)償（compensation）四、熒光信號問題之2－光blankmixture8色單抗標(biāo)記檢測管5/7/3/8/56/4/19/2/45blankmixture8色單抗標(biāo)記檢測管5/7/3/8/5熒光補(bǔ)償FL1單染補(bǔ)償管熒光信號問題之－光譜重疊熒光補(bǔ)償FL1單染補(bǔ)償管熒光信號問題之－光譜重疊FL2單染補(bǔ)償管熒光補(bǔ)償四、熒光信號問題之－光譜重疊FL2單染補(bǔ)償管熒光補(bǔ)償四、熒光信號問題之－光譜重疊四、熒光信號問題之3－抗原抗體結(jié)合非特異性因素四、熒光信號問題之3－抗原抗體結(jié)合非特異性因素同型對照（IsotypeControl）：與實(shí)驗(yàn)染色的單克隆抗體特異性無關(guān)的免疫球蛋白亞型（即Fc段相同，F(xiàn)(ab’)2段不同）與染色的單克隆抗體①相同種屬來源②相同免疫球蛋白及亞型③相同熒光素標(biāo)記④相同劑量和濃度⑤但由未免疫動物血清純化而來用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面的Fc受體而產(chǎn)生的背景染色四、熒光信號問題之3－對照設(shè)置同型對照（IsotypeControl）：四、熒光信號問五、細(xì)胞分選器

當(dāng)某類細(xì)胞的特性與要分選的細(xì)胞相同時，流式細(xì)胞儀就會在這類細(xì)胞形成液滴時給含有這類細(xì)胞的液滴充以特定的電荷，帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板間的靜電場時，依所帶電荷的符號分別向左偏轉(zhuǎn)或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)。五、細(xì)胞分選器當(dāng)某類細(xì)胞的特性與要分選的細(xì)胞相同時五、細(xì)胞分選器水滴的形成壓電晶體帶動流動室振動，液流形成水滴。噴嘴的振動頻率即每秒鐘產(chǎn)生水滴的數(shù)目。當(dāng)噴嘴直徑為50μm時，信號頻率為40kHz，則每秒鐘產(chǎn)生4萬個水滴。若每秒鐘流出的細(xì)胞是1000個，則平均每40個水滴中只有一個水滴是有細(xì)胞的，其他皆為空白。水滴的充電為了分選細(xì)胞，需要細(xì)胞在經(jīng)過測量區(qū)時判斷出哪個細(xì)胞滿足了分選的條件，并產(chǎn)生一個邏輯信號，此信號驅(qū)動充電脈沖發(fā)生器，使之產(chǎn)生充電脈沖。五、細(xì)胞分選器水滴的形成五、細(xì)胞分選器水滴的偏轉(zhuǎn)當(dāng)水滴從流束上將要斷開時給整個流束充電，則水滴從流束上斷開后便帶有同極性的多余表面電荷。下落的水滴通過一對平行板電極形成的靜電場時，帶正電荷的水滴向帶負(fù)電的電極板偏轉(zhuǎn)，這樣就可用容器收集水滴。五、細(xì)胞分選器水滴的偏轉(zhuǎn)三、流式細(xì)胞儀的性能指標(biāo)與質(zhì)量控制三、流式細(xì)胞儀的性能指標(biāo)與質(zhì)量控制一、流式細(xì)胞儀的性能指標(biāo)靈敏度是衡量儀器檢測微弱信號的重要指標(biāo)。一般以能檢測到單個微球上最少標(biāo)有FITC或PE熒光分子數(shù)目來表示，現(xiàn)在的FCM均可達(dá)到檢測小于100個熒光分子的指標(biāo)。前向角散射光檢測靈敏度是指能夠檢測到的最小顆粒大小，一般目前商品化的FCM可以測量到0.2μ～0.5μ左右。儀器分辨率分辨率是衡量儀器測量精度的指標(biāo)，通常用變異系數(shù)值表示：(δ是分布的標(biāo)準(zhǔn)誤差，是分布的平均值)一、流式細(xì)胞儀的性能指標(biāo)靈敏度(δ是分布的標(biāo)準(zhǔn)誤差，是分布的一、流式細(xì)胞儀的性能指標(biāo)分析速度以每秒分析的細(xì)胞數(shù)來表示。當(dāng)細(xì)胞流過的速度超過FCM儀器響應(yīng)速度時，細(xì)胞產(chǎn)生的熒光信號就會丟失，這段時間稱為儀器的死時間。

死時間越短，儀器處理數(shù)據(jù)越快，一般可達(dá)到3000～6000個/秒左右。大型機(jī)已達(dá)到每秒幾萬個細(xì)胞。分選指標(biāo)分選速度指每秒可提取所要細(xì)胞的個數(shù)。分選純度指要分選的目的細(xì)胞占分選出細(xì)胞的百分比。分選收獲率指被分出的細(xì)胞與原來溶液中該細(xì)胞的百分比。一、流式細(xì)胞儀的性能指標(biāo)分析速度二、流式細(xì)胞儀的質(zhì)量控制光路與流路的校正確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，使儀器檢測時的變異減少到最小，從而控制儀器的CV值流路校正物中所使用的標(biāo)準(zhǔn)熒光微球，其物理性質(zhì)、生物學(xué)化學(xué)特性均經(jīng)過標(biāo)定PMT校正光電倍增管隨時間的增加，其放大功率會有所改變，對樣品檢測的靈敏度會產(chǎn)生影響。為保證樣品檢測時儀器處于最佳工作狀態(tài)，采用質(zhì)控品進(jìn)行PMT校準(zhǔn)，必要時進(jìn)行電壓補(bǔ)償。二、流式細(xì)胞儀的質(zhì)量控制光路與流路的校正二、流式細(xì)胞儀的質(zhì)量控制絕對計(jì)數(shù)校正為保證儀器在計(jì)數(shù)時的準(zhǔn)確性，儀器應(yīng)采用絕對計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品建立絕對計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)品是經(jīng)標(biāo)定的，如以計(jì)算1000個細(xì)胞為1ml，作為設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)。在樣本測定時，以此為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行絕對計(jì)數(shù)，從而獲得絕對計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)值。流路校正物中所使用的標(biāo)準(zhǔn)熒光微球，其物理性質(zhì)、生物學(xué)化學(xué)特性均經(jīng)過標(biāo)定。二、流式細(xì)胞儀的質(zhì)量控制絕對計(jì)數(shù)校正四、流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用四、流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)臨床應(yīng)用免疫感染HIV，TBNK絕對計(jì)數(shù)細(xì)胞移植的免疫狀態(tài)監(jiān)測干細(xì)胞計(jì)數(shù)HLA-B27檢查血液淋巴細(xì)胞亞群分析白血病的免疫分型網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)

陣發(fā)性血紅蛋白尿(PNH)血小板功能及相關(guān)疾病腫瘤腫瘤的細(xì)胞周期和倍體分析腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的研究流式細(xì)胞術(shù)臨床應(yīng)用免疫感染血液腫瘤CD抗原及其相關(guān)細(xì)胞群細(xì)胞群CD抗原

T細(xì)胞CD2CD3CD4CD5CD7CD8CD28CD38B細(xì)胞CD10CD19CD20-CD24CD37CD72-CD75髓系細(xì)胞CD13CD14CD15-CD17CD33CD34CD35NK細(xì)胞CD16CD56CD57CD94血小板CD31CD41CD42aCD42bCD61CD62pCD63激活抗原CD26CD30CD69CD95-CD97粘附分子CD11a-cCD18CD29CD44CD49a-f內(nèi)皮細(xì)胞CD105CD106CD109細(xì)胞因子受體CD25CD115CD117CD122CD126FCM臨床檢測的免疫學(xué)基礎(chǔ)CD抗原及其相關(guān)細(xì)胞群細(xì)胞群先天免疫獲得性免疫ImmuneRegulation免疫細(xì)胞功能概述

免疫系統(tǒng)可抵御外部病原體的入侵、清除體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞在器官移植、過敏反應(yīng)、自身免疫性疾病時過度活化則會損傷機(jī)體功能先天免疫獲得性免疫Immune免疫細(xì)胞功能概述免疫系統(tǒng)可細(xì)胞免疫功能的評價CD3+：總T細(xì)胞數(shù)量——免疫大軍的數(shù)量CD4+：輔助調(diào)節(jié)性T細(xì)胞——指揮部CD8+：殺傷性T細(xì)胞——戰(zhàn)士CD4/CD8：比例均衡Th1/Th2：活化/抑制，反饋機(jī)制——參謀Treg：負(fù)反饋——權(quán)力制約CD69：早期活化——戰(zhàn)斗準(zhǔn)備HLA-DR：持續(xù)活化——投入戰(zhàn)斗NK：免疫監(jiān)視——警察單核巨噬細(xì)胞、DC——情報(bào)員細(xì)胞免疫功能的評價CD3+：總T細(xì)胞數(shù)量——免疫大軍的數(shù)量免疫細(xì)胞分類——淋巴細(xì)胞亞群InnateImmuneResponse(noantigenspecificity,nomemory)AdaptiveImmuneResponse(specificitytoantigensafterpresentation,memorycompartment)NKTBT8CD3-CD56+CD3+CD8+T4TregTH1FoxP3+CD25++CD127+/-TH17PCIFNIL-2TNFIL-4IL-6IL-10IL17CD38++CD138+memBCD27+IgM+(-)CD3+CD4+CD3+CD19+TH2免疫細(xì)胞分類——淋巴細(xì)胞亞群InnateImmuneRe淋巴細(xì)胞的功能淋巴細(xì)胞的功能淋巴細(xì)胞的功能淋巴細(xì)胞的功能流式檢測在感染性疾病中的意義感染性疾病的鑒別診斷病毒性感染：CD4+T細(xì)胞減少，CD4/CD8比值倒置胞內(nèi)菌、寄生蟲感染：NK細(xì)胞、單核細(xì)胞增多細(xì)菌性感染：無上述變化病情進(jìn)展判斷細(xì)菌性感染：嚴(yán)重細(xì)菌性感染CD64炎癥指數(shù)>5，正常人

1~2，一般感染2~5

病毒性感染：病情往往與CD4+T細(xì)胞減少、CD4/CD8比值倒置程度正相關(guān)，HIV尤為明顯

流式檢測在感染性疾病中的意義感染性疾病的鑒別診斷淋巴細(xì)胞亞群檢測淋巴細(xì)胞亞群檢測HIV感染患者CD4陽性T細(xì)胞的絕對計(jì)數(shù)HIV入侵人體的目標(biāo)細(xì)胞是CD4T細(xì)胞，感染后期能嚴(yán)重破壞T細(xì)胞，引起CD4細(xì)胞的減少CD4細(xì)胞的計(jì)數(shù)是診斷、療效觀察和預(yù)后的最重要指標(biāo)CD4細(xì)胞絕對數(shù)量如果低于300細(xì)胞/ul，需要服藥治療HIV感染患者CD4陽性T細(xì)胞的絕對計(jì)數(shù)HIV入侵人體的目標(biāo)流式檢測在腫瘤性疾病中的意義病情提示與評價腫瘤早期：CD4+T細(xì)胞減少，NK細(xì)胞比例相對明顯升高腫瘤晚期：CD4+T、NK淋巴細(xì)胞均減少病情進(jìn)展：抑制性T細(xì)胞（CD8+CD28-T細(xì)胞）、調(diào)節(jié)性T

細(xì)胞（CD4+CD25+T細(xì)胞）比例與病情進(jìn)展正相關(guān)腫瘤及癌前病變：細(xì)胞周期及DNA異倍體檢測，增殖期細(xì)胞>20%提示腫瘤生長迅速，出現(xiàn)非整數(shù)倍體細(xì)胞提示預(yù)后不良流式檢測在腫瘤性疾病中的意