DBEncRNA：細菌必需非編碼RNA數(shù)據(jù)庫

DBEncRNA:細菌必需非編碼RNA數(shù)據(jù)庫【摘要】細菌非編碼RNA(non-codingRNA,ncRNA)是近年來在細菌基因組內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的一類基因表達調(diào)控因子，與必需基因概念類似，有一部分ncRNA是生物體生存所必不可少的，稱之為"必需非編碼RNA”。因此，細菌的必需ncRNA可以作為藥物開發(fā)的潛在靶標，以降低致病菌的耐藥性。同時，必需ncRNA也成為最小基因組研究的重要對象之一。目前已經(jīng)通過濕實驗系統(tǒng)地確定了10余種細菌的必需ncRNA，然而還沒有一個專門的必需ncRNA數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)致對必需ncRNA的研究遠遠跟不上科學(xué)研究和藥物設(shè)計的需要。因此，該研究構(gòu)建了一個專門的細菌必需ncRNA數(shù)據(jù)庫DBEncRNA，以幫助研究人員開發(fā)高效的必需ncRNA計算機識別方法，用于進一步研究抗菌藥物靶標發(fā)現(xiàn)和最小基因組。DBEncRNA數(shù)據(jù)庫可以通過關(guān)鍵詞抗菌藥物靶標；數(shù)據(jù)庫；必需非編碼RNA;最小基因組；致病菌DBEncRNA:DatabaseofBacterialEssentialncRNAAbstractBacterialnon-codingRNA(ncRNA)isaclassofgeneexpressionregulatorsinbacteriainrecentyears.Similartotheconceptofessentialgenes,apartofncRNAisindispensableforthesurvivaloforganisms,whichiscalledessentialncRNA.Therefore,thebacterialessentialncRNAscouldbeusedaspotentialtargetsfordrugdevelopmentinordertoreducedrugresistanceinpathogenicbacteria.TheessentialncRNAhasbecomeoneoftheimportantobjectsofminimalgenomeresearch.Atpresent,theessentialncRNAsofmorethanadozenbacteriahavebeensystematicallyidentifiedbyexperimentalmethod.However,thereisnospecializedessentialncRNAsdatabase.Andhence,theresearchonessentialncRNAsisfarbehindtheneedsofscientificresearchanddrugdesign.Inconsequence,inthisstudy,aspecialdatabaseofbacterialessentialncRNA(DBEncRNA)isproposedandconstructedtohelpresearchersdeveloptheefficientrecognitionmethodsforessentialncRNAinsilico,forfurtherstudiesincludingantimicrobialtargetdiscoveryandminimalgenomeresearch.TheDBEncRNAdatabasecanKeywordsantimicrobialdrugtargets;database;essentialnon-codingRNA;minimalgenomic;pathogenicbacterium細菌非編碼RNA(non-codingRNA,ncRNA)是近年來在細菌基因組內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的一類基因表達調(diào)控因子，分子大小為40?500個核苷酸，在RNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、染色體復(fù)制、RNA加工與修飾、mRNA翻譯與穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)降解與轉(zhuǎn)運和細菌感染等生物過程中扮演著重要角色［1］o隨著被發(fā)現(xiàn)的細菌ncRNA數(shù)目迅速增加，及其在生物體內(nèi)的重要作用，細菌ncRNA已成為微生物的研究熱點之一［2］。由于ncRNA在生物體內(nèi)扮演重要角色，新ncRNA的識別具有重要的科學(xué)意義和極大的商業(yè)價值。在生物體所包含的ncRNA中，與必需基因概念類似，有一部分ncRNA是生物體生存所必不可少的，稱之為“必需非編碼RNA”(必需ncRNA，essentialncRNA)囪。雖然必需ncRNA不能像必需基因一樣編碼蛋白，但其在生物學(xué)上的研究地位與必需基因同等重要，具有重要的理論研究和實際應(yīng)用價值。如大部分抗生素以基本的細胞過程為靶標，而細菌的ncRNA在細菌生命活動中發(fā)揮著極為廣泛的作用，包括結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)到催化作用，影響各種加工過程，如細菌毒性、發(fā)育控制、mRNA穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)降解等［4］，因此細菌的必需ncRNA可以作為藥物開發(fā)的潛在靶標，以降低致病菌的耐藥性。同時，對必需ncRNA的理論研究有助于理解和確定最小基因組的構(gòu)成和功能作用，如文獻［5-6］認為一個完整的最小基因組除了編碼蛋白，還需包括調(diào)控和結(jié)構(gòu)原件，如5'-UTRs和ncRNA。文獻［7］報道了一個包含必需ncRNA的最小細胞。文獻［8］在構(gòu)建細菌最小基因集算法中也提出一個最小基因組，除了最小基因集，還應(yīng)包含最小非編碼RNA集。文獻［9-10］確定了一個新的miRNA為ncRNA，最早提出“必需ncRNA(essentialnon-codingRNA)”的概念。文獻［6］使用428735個Tn5轉(zhuǎn)座子插入測定新月柄桿菌(Caulobactercrescetus)的基因組時，除了確定480個必需基因外，還確定了29個必需tRNA和8個必需小ncRNA。在肺結(jié)核分支桿菌(Mycobacterumtuberculosis)中，文獻［11］使用36788個轉(zhuǎn)座子插入方法在確定必需基因的同時發(fā)現(xiàn)了25個必需基因組片段，包括10個tRNA和參與tRNA過程的RNaseP的RNA催化單元。文獻［12］用類似的方法在鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellaentericaserovars)中發(fā)現(xiàn)了15個必需ncRNA。值得注意的是，RNaseP再次被確定為必需ncRNA，因此它可能是一個在細菌中普遍存在的必需ncRNA。文獻［13］測試了一些ncRNA對毒性效應(yīng)具有niche-specific的作用的假說，因為越來越多的證據(jù)表明ncRNA參與致病菌致病過程，該文獻首次用RNA-seq技術(shù)確定了一種肺炎病原體肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)的全套ncRNA，包含89個ncRNA。文獻［14］重新確認了酵母的180個必需ncRNA。正是由于細菌ncRNA在細菌生長、侵染宿主和致病機理過程中發(fā)揮著極為廣泛的調(diào)控作用，對細菌ncRNA，特別是必需ncRNA的干擾會使其失去調(diào)控作用，從而影響到細菌的生長、侵染宿主的能力。在細菌耐藥性問題日益突出的今天，亟待積極研發(fā)新型抗菌靶點和藥物?；诩毦匦鑞cRNA為靶點的新型藥物開發(fā)，有助于降低細菌耐藥性問題，所以亟需發(fā)展細菌必需ncRNA的高效識別、鑒定方法。ncRNA在合成生物學(xué)研究領(lǐng)域也具有不可或缺的地位。在現(xiàn)階段，定義一個能夠維持生物體存活的最小基因組是生物學(xué)的主要挑戰(zhàn)之一。目前大部分關(guān)于最小基因組的研究主要基于傳統(tǒng)的蛋白編碼基因，而忽略了ncRNA，這種基于不完整的注釋，導(dǎo)致最小基因組的準確性受到了限制［15］。針對這一問題，文獻［7］以注釋較為完整、本身具有較小基因組的細菌——肺炎支原體(含有694個ORF、311個ncRNA、43個編碼RNA)作為研究對象，首次獲得了一個既包含編碼基因，又包含ncRNA的最小細胞?？偟膩碚f，研究基因組中的必需基因組元件，如必需ncRNA等，在生物學(xué)研究中具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值，包括從合成生物學(xué)到抗病原菌的藥物靶標確定。因此，必需ncRNA應(yīng)該如必需基因概念一樣，成為最小基因組研究的重要對象之一。為達到這一目標，亟需確定細菌的必需ncRNA，這就需要發(fā)展快速確定必需ncRNA的計算機識別算法，因此收集細菌的必需ncRNA作為算法開發(fā)數(shù)據(jù)集顯得及其重要和必要。目前，還沒有專門的必需ncRNA數(shù)據(jù)庫。天津大學(xué)生物信息中心構(gòu)建的必需基因數(shù)據(jù)中雖然收集了目前測序的必需ncRNA，但是該數(shù)據(jù)庫僅收集了必需ncRNA的序列信息［16-19］，這對于開發(fā)高效的必需ncRNA計算機識別方法是不足的?；诖?，本研究構(gòu)建了專門的細菌必需ncRNA數(shù)據(jù)庫DBEncRNA(databaseofbacterialessentialncRNA)，更便于進一步研究抗菌靶標發(fā)現(xiàn)和最小基因組。1材料與方法1.1微生物必需ncRNA數(shù)據(jù)來源目前在12種細菌中，必需ncRNA已經(jīng)被系統(tǒng)地實驗確定。雖然必需ncRNA的數(shù)據(jù)量相較必需基因要少很多，但沒有一個真正的必需ncRNA數(shù)據(jù)庫跟得上科學(xué)研究和藥物設(shè)計的需要。本研究收集測序的細菌基因組中包含了和人類疾病密切相關(guān)的細菌必需ncRNA。目前，DEG數(shù)據(jù)庫收錄了部分細菌的必需ncRNA數(shù)據(jù)［16］，如表1所示。此外，為了使得構(gòu)建DBEncRNA數(shù)據(jù)庫包含的物種和序列更全面，除了上表所列數(shù)據(jù)，本文還通過"essential”、"ncRNA”、“non-codingRNA”、“essentiality”、“microorganism”、“bacteria”

等關(guān)鍵字的組合在Google、Pubmed等數(shù)據(jù)庫上進行檢索，將檢索到的符合要求的序列作為DBEncRNA數(shù)據(jù)庫的來源。表1來源于DEG數(shù)據(jù)庫的細菌必需ncRNA數(shù)據(jù)物種必需序列數(shù)AcinetobacterbaumanniiATCC17978[20]59AcinetobacterbaumanniiATCC17978[20]1Agrobacteriumfabrumstr.C58[21]11Bacillussubtilis[22]2BrevundimonassubvibrioidesATCC15264[21]35Caulobactercrescentus[6]532MycobacteriumtuberculosisH37RvIII[11]35SalmonellaentericaserovarTyphiTy2[12]24SalmonellaentericaserovarTyphiSL1344[12]23SphingomonaswittichiiRW1[23]32SynechococcuselongatusPCC7942[24]34Streptococcuspneumoniae[}1]721.2必需ncRNA二級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來源必需ncRNA是從功能上來定義的，而功能與結(jié)構(gòu)是密切相關(guān)的R25]，因此對RNA分子結(jié)構(gòu)的研究就成為分子生物學(xué)的一個重要領(lǐng)域，其中RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測被作為研究RNA分子結(jié)構(gòu)的主要手段。因此為了方便用戶使用DBEncRNA數(shù)據(jù)庫，本文用RNAfold工具對每一個收集的必需ncRNA進行了二級結(jié)構(gòu)預(yù)測[26]o同時為了方便用戶直觀地觀察ncRNA的二級結(jié)構(gòu)，本文調(diào)用了RNA二級結(jié)構(gòu)可視化工具Forna[27]o1.3序列比對在生物信息學(xué)中，通常認為序列相似則功能相似，為了幫助用戶挖掘其余未經(jīng)實驗確定的必需ncRNA，DBEncRNA數(shù)據(jù)庫引入BLAST序列比對功能，幫助使用者基于DBEncRNA數(shù)據(jù)庫通過同源序列比對發(fā)現(xiàn)其感興趣的ncRNA序列[28]o2結(jié)果與討論DBEncRNA數(shù)據(jù)庫內(nèi)容DBEncRNA數(shù)據(jù)庫的原始必需ncRNA數(shù)據(jù)來源于DEG6.5和關(guān)鍵字爬取，在獲得原始數(shù)據(jù)后進行以下處理：首先，因為DBEncRNA數(shù)據(jù)庫提供了必需ncRNA的二級結(jié)構(gòu)信息，因此剔除沒有核酸序列的ncRNA信息；其次，根據(jù)DBEncRNA數(shù)據(jù)庫的使用功能，篩選保留描述ncRNA的相關(guān)信息，如表2所示。最終獲得了一個含有20株細菌，共包含884條必需ncRNA序列及相關(guān)信息的數(shù)據(jù)庫，如表3所示。表3DBEncRNA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)統(tǒng)計信息物種名基因組編號培養(yǎng)條件必需表3DBEncRNA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)統(tǒng)計信息物種名基因組編號培養(yǎng)條件必需ncRNA數(shù)目/個CaulobactercrescentusNC_011916完全培養(yǎng)基532AcinetobacterbaumanniiATCC17978NC_009085完全培養(yǎng)基60EscherichiacoliO157:H7str.EDL933NZ_CP008957LB糖培養(yǎng)基37SynechococcuselongatusPCC7942NC_007604完全培養(yǎng)基34MycoplasmapneumoniaeM129NC_000912LB糖培養(yǎng)基34SphingomonaswittichiiRW1NC_009511完全培養(yǎng)基32BrevundimonassubvibrioidesATCC15264NC_014375完全培養(yǎng)基31MycobacteriumtuberculosisH37RvIIINC_000962完全培養(yǎng)基29ProvidenciastuartiistrainBE2467NZ_CP017054LB糖培養(yǎng)基25SalmonellaentericaserovarTyphiTy2NC_016810完全培養(yǎng)基24SalmonellaentericaserovarTyphimuriumSL1344NC_016810完全培養(yǎng)基23StreptococcusmutansUA159AE014133血培養(yǎng)基6Agrobacteriumfabrumstr.C58chromosomelinearNC_003063完全培養(yǎng)基6Agrobacteriumfabrumstr.C58chromosomecircularNC_003062完全培養(yǎng)基5MycobacteriumtuberculosisH42RvIIINC_000962完全培養(yǎng)基1MycobacteriumtuberculosisH38RvIIINC_000962完全培養(yǎng)基1MycobacteriumtuberculosisH39RvIIINC_000962完全培養(yǎng)基1MycobacteriumtuberculosisH41RvIIINC_000962完全培養(yǎng)基1MycobacteriumtuberculosisH40RvIIINC000962完全培養(yǎng)基1字段名具體信息AccessionNumberDBEncRNA數(shù)據(jù)庫編號RefSeq基因組在genbank的登錄號CategoryncRNA所屬類Condition培養(yǎng)條件Cross-Ref該序列在其他數(shù)據(jù)庫中登錄號Description功能描述Organism來源物種Reference參考文獻Date發(fā)表日期NucleotideSequence核酸序列

其中新月柄桿菌(Caulobactercrescentus)的必需ncRNA數(shù)目占數(shù)據(jù)庫總數(shù)的近61%,其次是鮑氏不動桿菌(AcinetobacterbaumanniiATCC17978)的必需ncRNA數(shù)目，占近7%。實驗確定必需ncRNA的培養(yǎng)條件總共有5種，其中主要以完全培養(yǎng)基(richmedium)條件為主，占75%，這是在充足生長條件下確定必需基因和必需ncRNA的常用培養(yǎng)條件。根據(jù)ncRNA所屬類別可將ncRNA分為10大類，如圖1所示，屬于啟動子類型的ncRNA將近一半，其次是屬于tRNA類型的ncRNA。ElseThrUtRNAoperon5SribosomalRNABacteria_small_SRPRNasesRNAIntergenic(IG)regionsNon-codingelementtRNAPromoter;regulatoryregion圖1DBEncRNA數(shù)據(jù)庫必需ncRNA類別分布圖ElseThrUtRNAoperon5SribosomalRNABacteria_small_SRPRNasesRNAIntergenic(IG)regionsNon-codingelementtRNAPromoter;regulatoryregionncRNA二級結(jié)構(gòu)為了方便用戶使用DBEncRNA數(shù)據(jù)庫，本文用RNAfold軟件數(shù)據(jù)庫收集的每個必需ncRNA進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，對于每一條必需ncRNA，RNAfold采用兩種方法對其進行預(yù)測，分別是基于最小自由能的預(yù)測方法(minimumfreeenergy)和基于熱力學(xué)的預(yù)測方法(thermodynamicensemble)，對于每一種預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)，均給出該結(jié)構(gòu)下的最小自由能等信息。將預(yù)測出的每種二級結(jié)構(gòu)以及對應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)注釋信息導(dǎo)入到DBEncRNA數(shù)據(jù)庫，同時，引入可視化插件，使用人員可以按需查看其二級結(jié)構(gòu)。DBEncRNA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建DBEncRNA的數(shù)據(jù)主要包括884個ncRNA及其預(yù)測的分子結(jié)構(gòu)和注釋信息，所有數(shù)據(jù)被整理并存儲在關(guān)