熒光定量PCR課件

熒光定量ＰＣＲ技術(shù)及其應(yīng)用主講人：夏孝益長沙貝泰生物科技有限公司熒光定量PCR及其發(fā)展熒光定量PCR技術(shù)原理及特點熒光定量PCR的方法介紹熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用---熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用舉例存在的問題及應(yīng)用前景主要內(nèi)容先看看下面這幾個名詞FluorogenicQuantitativePCRRT-PCR(REAL-TIMEPCR)Real-timeFluorogenicQuantitativePCRQ-PCR(QuantitativePCR)什么是熒光定量PCR?在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實現(xiàn)實時監(jiān)測整個PCR進程，對起始模板進行定量分析的方法。在實時熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖(如下圖)。一般而言，熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。1995年P(guān)E（Perkin-Elmer）公司的Livak及其同事把這一技術(shù)加以改進并把這種技術(shù)稱為TaqMan技術(shù)（Livak，1995a）。最早用TaqMan技術(shù)進行核酸定量研究（Heid，1996；Gibson，1996）。1997年Wittwer(Wittwer，1997)等人用LightCycler儀器和他們發(fā)明的雜交探針對核酸進行了快速定量。從那以后熒光定量PCR技術(shù)開始被廣泛應(yīng)用，熒光產(chǎn)生的方法也層出不窮，如分子信標法（Tyagi1998）、蝎狀引物法（Whitcombe，1999；Saha，2001）、復(fù)合探針法（王升啟，2000）等。在這幅圖里面，我們能得到什么樣的結(jié)論？相同模板所進行的96次擴增Ct值：擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閥值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)數(shù)。此時擴增是呈對數(shù)期增長。閥值：熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。

理想的PCR擴增結(jié)果：Y=X*2n其中Y代表擴增產(chǎn)物量，X代表PCR反應(yīng)體系中的原始模板數(shù)，n為擴增次數(shù)；理論上PCR擴增效率為100％，PCR產(chǎn)物隨著循環(huán)的進行成指數(shù)增長，但實際上：DNA的每一次復(fù)制都不完全，即每一次擴增中，模板不是呈2的倍增長，實際應(yīng)為：Y=X(1+E)n，其中E代表擴增效率，E＝參與復(fù)制的模板/總模板，通常E<或＝1，E在整個PCR擴增過程中不是固定不變的。通常X在1－105拷貝，循環(huán)次數(shù)n<或＝30時，E相對穩(wěn)定，原始模板以相對固定的指數(shù)形式增加，適合定量分析，這也就是所謂的指數(shù)期；隨著循環(huán)次數(shù)n的增加，E值逐漸減少，Y呈非固定的指數(shù)形式增加，最后進入平臺期。絕對定量指的是用已知的標準曲線來推算未知的樣本的量

CT值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值（如下圖所示）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。絕對定量熒光定量PCR技術(shù)的特點與普通PCR模式相比，F(xiàn)Q-PCR具備幾個方面的優(yōu)勢:

a.特異性

FQ-PCR具有引物和探針的雙重特異性，故與傳統(tǒng)的PCR相比，特異性大為提高。

b.敏感性

FQ-PCR的敏感度通?？蓹z查出百萬分之一的感染細胞，或10個病毒DNA分子，且線性范圍很寬。進行定量檢測時，其定量線性范圍(5~6logs)比普通PCR(2~3logs)要寬得多。

熒光定量PCR方法介紹

(熒光化學(xué)原理)實時熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩種，探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加，非探針類則是利用熒光染料或者特殊設(shè)計的引物來指示擴增的增加。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行。非特異性熒光標記特異性熒光標記1.SYBRGreen2.TaqMan探針3.MolecularBeacon一：SYBRGreenI二：Taqman水解探針三：分子信標PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化：SYBRGreen使用濃度：太高抑制了Taq酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測Primer：引物的特異性高，否則擴增有雜帶，定量不準MgCl2的濃度：可以降低到1.5mM，以減少非特異性產(chǎn)物反應(yīng)Buffer體系的優(yōu)化反應(yīng)溫度和時間參數(shù)：由酶和引物決定其他與常規(guī)PCR相同SYBERGREEN法的優(yōu)缺點方法二：TaqManProbes工作原理探針與目標序列配對時，發(fā)生FRET光能量轉(zhuǎn)移Taq游離的探針熒光基團

淬滅劑

延伸時，Taq酶水解探針，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離而發(fā)出熒光，形成熒光信號Taq發(fā)出熒光光另一波長的熒光TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴增相關(guān)。它設(shè)計為與目標序列上游引物和下游引物之間的序列配對。熒光基團連接在探針的5’末端，而淬滅劑則在3’末端。當完整的探針與目標序列配對時，熒光基團發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進行延伸反應(yīng)時，聚合酶的5’外切酶活性將探針進行酶切，使得熒光基團與淬滅劑分離。TaqMan探針適合于各種耐熱的聚合酶，如DyNAzymeTMIIDNA聚合酶（MJResearch公司有售）。隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。因此熒光強度與擴增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。

TaqMan探針圖示TaqMan探針工作原理圖示TaqManPCR反應(yīng)的建立和優(yōu)化引物探針的設(shè)計：探針Tm為68-70度，<30bp，5’不能有G，G可能會淬滅熒光素引物盡量靠近探針，擴增片斷<400bp，引物Tm為59-60度2.反應(yīng)參數(shù)的確定：一般為：95度，3min94度，15s60度，60s40cycles(Taq酶5’---3’外切酶活性在60度最高也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度)3.優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最?。茫糁?，最大信號／背景比值引物濃度：50-900nM探針濃度：50-250nM4.其他與常規(guī)ＰＣＲ同TaqMan方法的優(yōu)缺點方法三：分子信標分子信標是一種在靶DNA不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標記寡核苷酸探針。在此發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，位于分子一端的熒光基團與分子另一端的淬滅基團緊緊靠近。在此結(jié)構(gòu)中，熒光基團被激發(fā)后不是產(chǎn)生光子，而是將能量傳遞給淬滅劑，這一過程稱為熒光諧振能量傳遞（FRET）。由于“黑色“淬滅劑的存在，由熒光基團產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。如果第二個熒光基團是淬滅劑，其釋放能量的波長與熒光基團的性質(zhì)有關(guān)。分子信標的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為15-30個核苷酸長，并與目標序列互補；莖一般5-7個核苷酸長，并相互配對形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接于另一端。分子信標必須非常仔細的設(shè)計，以致于在復(fù)性溫度下，模板不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，模板存在時則與模板配對。與模板配對后，分子信標的構(gòu)象改變使得熒光基團與淬滅劑分開。當熒光基團被激發(fā)時，它發(fā)出自身波長的光子熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用(1)

病原體檢測：目前，采用熒光定量PCR檢測技術(shù)可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結(jié)核分枝桿菌、EB病毒和巨細胞病毒等病原體進行定量測定。與傳統(tǒng)的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優(yōu)點。

Morris等用FQ-PCR對黑猩猩丙型肝炎動物模型和臨床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（HCV）進行了研究，測定顯示，可測得的樣品濃度相當于每毫升13個基因組，另外，他們還對48例臨床丙型肝炎病人血清樣品進行了測試，32例樣品兩種方法檢測均為陽性，10例均為陰性，另外6例用兩種方法測定的結(jié)果不一致，該六例樣品讓第三個實驗室采用巢式PCR方法重新測定，結(jié)果與FQ-PCR結(jié)果一致。

(2)基因表達研究：細胞因子是一種對免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)蛋白，這些低分子蛋白由淋巴細胞、單核細胞和內(nèi)皮細胞所分泌，其量的改變常常與一些疾病，如炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)等有密切的關(guān)系。由于所得到組織樣本常常因為太小而不能滿足在蛋白質(zhì)水平的檢測，另外，通常用的蛋白質(zhì)檢測方法的靈敏度也難以完成對極微量的蛋白產(chǎn)物的檢測，所以應(yīng)用熒光定量PCR檢測細胞因子mRNA表達水平就顯得很有意義。實驗研究表明：定量結(jié)腸直腸癌淋巴結(jié)的癌抗原mRNA的表達量，可以作為診斷癌癥微轉(zhuǎn)移的重要依據(jù)。為了探測骨髓基質(zhì)血小板生成因子（TPO）在巨核細胞生成過程中的作用以及血小板生成因子在特發(fā)性血小板減少性紫瘢（ITP），再生障礙性貧血（AA）和特發(fā)性血小板多癥（ET）等疾病過程中的病理生理意義，日本Hirayama等用TaqMan技術(shù)測定了正常人和ITP，AA，ET病人的骨髓基質(zhì)細胞TPOmRNA水平，又用ELISA法測定了骨髓和末梢血的TPO濃度，結(jié)果顯示ITP和AA病人TPOmRNA水平明顯升高，而ET病人的TPOmRNA水平則正常，經(jīng)類固醇治療后ITP病人TPOmRNA水平下降，骨髓TPO的濃度與其mRNA水平有相關(guān)性，在正常人和ITP病人，TPOmRNA水平與巨核細胞計數(shù)也有相關(guān)性，這個實驗對闡明TPO的作用提供了依據(jù)。(3)腫瘤基因檢測：盡管腫瘤發(fā)病的機理尚未清楚，但相關(guān)基因發(fā)生突變是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現(xiàn)。實時熒光定量PCR不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以準確檢測癌基因的表達量。目前用此方法進行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細胞性白血病WT1基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達檢測。隨著與腫瘤相關(guān)的新基因的不斷發(fā)現(xiàn)，熒光定量PCR技術(shù)將會在腫瘤的研究中發(fā)揮更大的作用。1998年法國Bieche等用FQ-PCR測定了108例乳腺癌標本，他們選擇擴增較高的myc，ccnd1和erbB2基因進行擴增，在108例標本中，發(fā)現(xiàn)10%的myc基因，23%的ccnd1基因和15%的erbB2基因都有不同程度拷貝數(shù)增加，拷貝數(shù)增加最大值分別是4.6，18.6，15.1。同時他們又將這些數(shù)據(jù)與Southern印跡的結(jié)果進行比較，顯示了較好的相關(guān)性。(4)藥物療效考核：對乙型肝炎毒

(HBV)、丙型肝炎病毒

(HCV)

定量分析顯示：病毒量與某些藥物的療效關(guān)系。HCV高水平表達，干擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，干擾素作用敏感；在拉米夫定治療過程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，隨后若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發(fā)生變異。

(5)單核苷酸多態(tài)性(SNP)及突變分析：實時熒光定量PCR一個誘人的應(yīng)用前景是用于檢測基因突變和基因組的不穩(wěn)定性?；蛲蛔兊臋z測基于兩條探針，一條探針橫跨突變位點，另一條為錨定探針，與無突變位點的靶序列雜交，兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團標記。如靶序列中無突變，探針雜交便會降低雜交體的穩(wěn)定性，從而降低其熔解溫度(Tm)。這樣便可對突變和多態(tài)性進行分析。

美國Ibrahim等1997年用FQ-PCR技術(shù)對正常痘病毒多態(tài)性進行了研究。他們采用一對可與正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片斷結(jié)合的引物，并設(shè)計兩個有單核苷酸差異的寡核苷酸探針，用熒光標記后進行實驗，順利地把由此單核苷酸差異的兩個痘病毒株進行鑒定。該技術(shù)也可用于猴痘和病毒DNA疫苗的單核苷酸變異多態(tài)的研究。(6)

產(chǎn)前診斷：到目前為止，人們對遺傳性物質(zhì)改變引起的遺傳性疾病還無法治療，只能通過產(chǎn)前監(jiān)測，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發(fā)生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實時熒光定量PCR檢測其Y性別決定區(qū)基因是一種無創(chuàng)傷性的方法，易為孕婦所接受。(7)用于檢測環(huán)境中的致病微生物環(huán)境中存在著多種多樣的致病微生物,它們與許多傳染性疾病的傳播和流行密切相關(guān)。因此,定期檢測環(huán)境中致病微生物的動態(tài)(種類、數(shù)量、變化趨勢等)具有重要的實際意義。傳統(tǒng)檢測方法是對病原體進行人工培養(yǎng)或細胞培養(yǎng),或是對無法培養(yǎng)的病原體進行顯微鏡檢測,這些方法不僅耗費大量的人力、物力和財力,而且準確度差。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測環(huán)境中的微生物病原體,無需培養(yǎng)而是直接取樣進行分析。Brooks等對雨季時海水中的甲肝病毒,采用該技術(shù)進行了檢測及定量分析。研究證明,該技術(shù)對甲肝病毒的定性及定量測定均有很高的精確度。同時指出了PCR技術(shù)對于環(huán)境微生物定量測定的發(fā)展前景。Rebecca等采用FQ-PCR對容易引起水傳播疾病的賈第蟲和隱孢子蟲進行了定量檢測分析,建立了定量分析方法熒光定量PCR的實際應(yīng)用舉例熒光定量PCR定量檢測樣品中SeMNPV有效含量主要完成人:楊和平,夏孝益實驗路線目標基因選擇和克隆目標基因克隆到pMD18-T及測序抽提質(zhì)粒及質(zhì)粒標準品濃度測定樣品基因組提取及定量PCR目標基因選取目標基因擴增Lane1:D2000Lane2:ORF22137bpLane3:ORF40131bp基因克隆到pMD18-T及測序pMD18-ORF22:CAGAGAATTGTCGCCGTACATCAATTCGCTCAAATCCTTCAGGACGCGATACCTCGGTATACCGATCAGACTGTTCAGCATACTGTGGCTGAACTCGAGTAATATTATCGTCAAAGTCAATAGCGTTGTTTTCGACpMD18-ORF40:GAACGACAACGATTCAACTTGACGTGTGATGAACAAAACGGTTGGTACGAGCGCGTCTTTGAAAAATTTGGCGCATGCTATTACGTAGAAAAACGCAGCACTTCTCTCAAAGTCATGATCGTGTTGC標準樣品和參照樣品的制備標準樣品的制備以提純的pMD18-T-ORF22、pMD18-T-ORF40，按10倍系列稀釋為108-103copies/μL作為標準樣品，進行熒光定量PCR擴增，制作標準曲線。SeMNPV多角體病毒參照樣品的制備用顯微鏡目測法將純化的SeMNPV多角體病毒稀釋為105PIBs/mL，取10μL用UNIQ-10柱式病毒DNA抽提試劑盒提取基因組，作為參照樣品進行熒光定量PCR擴增，設(shè)定四個重復(fù)，以確定SeMNPV每個多角體中的核酸平均數(shù)目。熒光定量PCR結(jié)果在熒光定量PCR儀上擴增結(jié)束后，分別以pMD18-T-ORF22、pMD18-T-ORF40起始模板濃度（單位為copies/μL）作為x軸，Ct值為y軸作回歸曲線，即得到SeMNPV檢測的標準曲線(圖2和圖3)，ORF22標準方程為concentration=10(-0.296Ct+9.945)(相關(guān)系數(shù)：R2＝0.9995)，ORF40標準方程為concentration=10(-0.282Ct+9.965)（相關(guān)系數(shù)：R2=0.9997）ORF40標準曲線ORF22標準曲線參照樣品的定量檢測結(jié)果二組（每組四個重復(fù)）純化的SeMNPV多角體病毒參照樣品，經(jīng)FQ-PCR，Ct值分別為20.93±0.11、21.57±0.23，相應(yīng)的變異系數(shù)（CV）分別為0.5%、1.1%（表1）。比對ORF22、ORF40標準曲線，得到參照樣品中SeMNPV多角體核酸濃度平均值分別為5.75×103(copies/μL)、7.72×103(copies/μL)。而由顯微鏡目測法計數(shù)得到參照樣品SeMNPV多角體濃度為105PIBs/mL，因此計算得到每個SeMNPV病毒多角體約包含102個核酸分子。病毒復(fù)合劑樣品的定量檢測結(jié)果

二組（每組三個重復(fù)）SeMNPV多角體病毒Bt復(fù)合劑樣品經(jīng)FQ-PCR，Ct值分別為21.54±0.24、22.09±0.16，相應(yīng)的變異系數(shù)（CV）分別為1.1%、0.8%（表2）。比對ORF22、ORF40標準曲線得病毒復(fù)合劑中的核酸濃度平均值分別為3.87×103、5.47×103(copies/μL)。根據(jù)由參照樣品FQ-PCR確定的每個SeMNPV病毒多角體約包含102個核酸分子，計算得到病毒復(fù)合劑樣品中病毒多角體的數(shù)目為633PIBs/mg、691PIBs/mg。兩個基因檢測到的SeMNPV數(shù)目基本一致。討論熒光定量RT-PCR檢測SeMNPV具有許多優(yōu)點：靈敏度髙，本實驗準確檢測1000PIB/ml病毒；所需時間短，從核酸提取到檢測完成，僅需3小時。特異性強，與其他核型多角體病毒之間無反應(yīng)。為了保證該方法的特異性，本研究根據(jù)Semnpv具有20個保守的ORF⑥，結(jié)合Genbank中的數(shù)據(jù)，用NCBI在線提供的BLAST軟件進行同源比對，發(fā)現(xiàn)SeMNPV基因組ORF22和ORF40和其他的核酸序列相似性最小.選取ORF22片段和ORF40片段作為檢測基因，同時熒光定量PCR是在一套封閉的體系中完成，自動化程度髙，這樣減少了交叉污染的機率可以有效避免假陽性的出現(xiàn)。將ORF22和ORF40分別克隆到pMD18–T上，作為標準品。由于質(zhì)?；蚪M較小，不易斷裂，擴增純化容易。質(zhì)粒作為標準品比病毒基因組作為標準品要容易制備，均一性強。在顯微鏡下計數(shù)純化的SeMNPV，作為對照，測得SeMNPV多角體包含的核酸數(shù)目。此外，本研究選取了ORF22和ORF40兩個基因作為檢測基因，進行平行比較，所得標準方程分別為con=10(-0.282CT+9.965)和con=10(-0.296CT+9.945),標準曲線相關(guān)性分別達到99.95%和99.97%,兩者所得結(jié)果相符，印證了此方法的