微生物學(xué)課程第一章(沈萍)緒論與基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)

一、什么是微生物定義：微生物是所有形體微小、單細(xì)胞或結(jié)構(gòu)較為簡單的多細(xì)胞生物、甚至沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物的通稱。種類：微生物類群十分龐雜，包括：無細(xì)胞結(jié)構(gòu)的病毒、類病毒、擬病毒等，屬于原核生物的細(xì)菌、放線菌、立克次氏體、衣原體等，屬于真核生物的酵母菌和霉菌，單細(xì)胞藻類、原生動(dòng)物等。第一頁，共八十五頁。二，微生物和人類的關(guān)系有益的方面。1，在食品生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛。如：面包，奶酪，酸奶，各種酒類，檸檬酸等食品添加劑，各種氨基酸，各種維生素，醬醋腐乳泡菜等副食品……2，在醫(yī)藥方面應(yīng)用廣泛。如：青霉素等抗生素的生產(chǎn)，疫苗，胰島素等藥品的生產(chǎn)。3，工業(yè)方面的應(yīng)用。如：洗衣粉，皮革，丙酮等化工原料生產(chǎn)。4，能源方面的應(yīng)用。如：沼氣，生物乙醇，氫氣。5，環(huán)保方面的應(yīng)用。污水處理，重金屬吸收，有毒化學(xué)品的降解。此外，微生物還能應(yīng)用于采礦，農(nóng)牧，冶金等許多行業(yè)。第二頁，共八十五頁。對(duì)人有害方面：致病微生物：1347年，鼠疫耶森氏菌引起的瘟疫使整個(gè)歐洲死亡約1/3的人口大約2500萬人。整個(gè)人類歷史，據(jù)統(tǒng)計(jì)約2億人死于鼠疫。其他如SARS、肺結(jié)核、瘧疾、霍亂、AIDS、flu

…生化武器

第三頁，共八十五頁。三、微生物學(xué)及其分科微生物學(xué)——是在分子、細(xì)胞或群體水平上研究微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長繁殖、生理代謝、遺傳異、生態(tài)分布和分類進(jìn)化等生命活動(dòng)的基本規(guī)律，并將其應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵、醫(yī)學(xué)衛(wèi)生和生物工程等領(lǐng)域的科學(xué)。微生物學(xué)分科：◆按基本問題分：普通微生物學(xué)、微生物分類學(xué)、微生物生理學(xué)、微生物生態(tài)學(xué)、微生物遺傳學(xué)等。◆按研究對(duì)象分：細(xì)菌學(xué)、真菌學(xué)、病毒學(xué)、噬菌體學(xué)等。◆按應(yīng)用領(lǐng)域分：工業(yè)～、農(nóng)業(yè)～、醫(yī)學(xué)～、食品～、石油～、土壤～、海洋～、環(huán)境～、發(fā)酵微生物學(xué)等等第四頁，共八十五頁。四，微生物的發(fā)現(xiàn)及微生物學(xué)的發(fā)展

史前時(shí)期——人類對(duì)微生物的認(rèn)識(shí)與利用微生物學(xué)初創(chuàng)時(shí)期——微生物形態(tài)認(rèn)識(shí)時(shí)期微生物學(xué)奠基時(shí)期——微生物生理學(xué)發(fā)展時(shí)期微生物學(xué)發(fā)展時(shí)期——微生物生物化學(xué)發(fā)展時(shí)期微生物學(xué)成熟時(shí)期——微生物分子生物學(xué)發(fā)展時(shí)期第五頁，共八十五頁。1.史前期史前期是指人類還未見到微生物個(gè)體尤其是細(xì)菌細(xì)胞前的一段漫長的歷史時(shí)期，大約在距今8000年－－1676年間。開創(chuàng)者：各國勞動(dòng)人民，其中尤以我國的制曲、釀酒技術(shù)蓍稱。特點(diǎn)：未見細(xì)菌等微生物個(gè)體；憑實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)利用微生物的有益活動(dòng)（釀酒、制醬、釀醋、漚肥、輪作、治病）。第六頁，共八十五頁。微生物學(xué)的初創(chuàng)期（1676－1861）

列文虎克(AntonyvanLeeuwenhoek）第七頁，共八十五頁。奠基期時(shí)間：1861－－1897開創(chuàng)者：Pasteur和Koch特點(diǎn)：①建立了一系列研究微生物所必要的獨(dú)特方法；②借助于良好的研究方法，開創(chuàng)了尋找病原微生物的“黃金時(shí)期”；③把微生物的研究從形態(tài)描述推進(jìn)到生理學(xué)研究的新水平；④微生物學(xué)以獨(dú)立的學(xué)科形式開始形成。第八頁，共八十五頁。貢獻(xiàn)：A徹底否定了“自生說”學(xué)說B免疫學(xué)——預(yù)防接種C證實(shí)發(fā)酵是由微生物引起的D其他貢獻(xiàn)：巴斯德消毒法等。巴斯德(LouisPasteur)第九頁，共八十五頁。貢獻(xiàn)：A

徹底否定了“自生說”學(xué)說“曲頸瓶”實(shí)驗(yàn)第十頁，共八十五頁。B免疫學(xué)—預(yù)防接種

第十一頁，共八十五頁。RobertKoch（柯赫）是微生物學(xué)的奠基人，德國人，細(xì)菌學(xué)家。A微生物學(xué)基本操作技術(shù)方面的貢獻(xiàn)B對(duì)病原細(xì)菌的研究作出了突出的貢獻(xiàn)：第十二頁，共八十五頁。a）細(xì)菌純培養(yǎng)方法的建立土豆切面→營養(yǎng)明膠→營養(yǎng)瓊脂（平皿）A微生物學(xué)基本操作技術(shù)方面的貢獻(xiàn)b）設(shè)計(jì)了各種培養(yǎng)基，實(shí)現(xiàn)了在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)各種微生物的培養(yǎng)c）蒸汽滅菌d）染色觀察和顯微攝影第十三頁，共八十五頁。B對(duì)病原細(xì)菌的研究作出了突出的貢獻(xiàn)：a）具體證實(shí)了炭疽桿菌是炭疽病的病原菌；b）發(fā)現(xiàn)了肺結(jié)核病的病原菌；（1905年獲諾貝爾獎(jiǎng)）c）證明某種微生物是否為某種疾病病原體的基本原則——著名的柯赫原則第十四頁，共八十五頁。第十五頁，共八十五頁。1在每一病例中都出現(xiàn)這種微生物；

2要從寄主分離出這樣的微生物并在培養(yǎng)基中培養(yǎng)出來；

3用這種微生物的純培養(yǎng)接種健康而敏感的寄主，同樣的疾病會(huì)重復(fù)發(fā)生；

4從試驗(yàn)發(fā)病的寄主中能再度分離培養(yǎng)出這種微生物來。柯赫法則第十六頁，共八十五頁。時(shí)間：1897－－1953開創(chuàng)者：Buchner特點(diǎn)：①進(jìn)入微生物生化水平的研究；②應(yīng)用微生物的分支學(xué)科更為擴(kuò)大，出現(xiàn)了抗生素等學(xué)科；③開始尋找各種有益微生物代謝產(chǎn)物；④普通微生物學(xué)開始形成；⑤各相關(guān)學(xué)科和技術(shù)方法相互滲透，相互促進(jìn)，加速了微生物學(xué)的發(fā)展。發(fā)展期

第十七頁，共八十五頁。時(shí)間：1953－－至今開創(chuàng)者：Watson和Crick特點(diǎn)：①微生物學(xué)從一門在生命科學(xué)中較為孤立的以應(yīng)用為主的學(xué)科，成為一門十分熱門的前沿基礎(chǔ)學(xué)科；②在基礎(chǔ)學(xué)理論的研究方面，逐步進(jìn)入到分子水平的研究，微生物迅速成為分子生物學(xué)研究中的最主要的對(duì)象；③在應(yīng)用研究方面，向著更自覺、更有效和可人為控制的方向發(fā)展。成熟期第十八頁，共八十五頁。六，21世紀(jì)微生物學(xué)的發(fā)展趨勢(shì)1，微生物基因組學(xué)研究將全面開展。2，與環(huán)境密切相關(guān)的微生物學(xué)研究將長足發(fā)展。3，多學(xué)科交差趨勢(shì)增強(qiáng)。4，微生物的應(yīng)用將更加廣泛。第十九頁，共八十五頁。五，微生物的特點(diǎn)及其應(yīng)用1、體積小，面積大2、吸收多，轉(zhuǎn)化快3、生長旺，繁殖快4、分布廣，種類多5、適應(yīng)性強(qiáng)，易變異第二十頁，共八十五頁。病毒——﹤0.2m桿狀細(xì)菌——0.5×2.0m支原體立克次氏體衣原體｝0.2～0.5m放線菌——菌絲直徑霉菌——菌絲直徑2～10m酵母——1—5×5—30m1.體積小、面積大第二十一頁，共八十五頁。1.體積小、面積大比面=面積/體積乳酸桿菌120,000豌豆6.0雞蛋1.5體重200磅的人0.3第二十二頁，共八十五頁。2吸收多，轉(zhuǎn)化快＃3克地鼠每天消耗與體重等重的糧食；＃1克閃綠蜂鳥每天消耗兩倍于體重的糧食；＃大腸桿菌每小時(shí)消耗2000倍于體重的糖。；※發(fā)酵乳糖的細(xì)菌在1小時(shí)內(nèi)就可以分解相當(dāng)于其自身重量1,000~10,000倍的乳糖，產(chǎn)生乳酸；※1公斤酵母菌體，在一天內(nèi)可發(fā)酵幾千公斤的糖，生成酒精；第二十三頁，共八十五頁。3生長旺，繁殖快★例如：Escherichiacoli(大腸桿菌)在最適的生長條件下，每12.5~20分鐘細(xì)胞就能分裂一次?！镌谝后w培養(yǎng)基中，細(xì)菌細(xì)胞的濃度一般為108~109個(gè)/ml?！锢梦⑸锏倪@一特性就可以:實(shí)現(xiàn)發(fā)酵工業(yè)的短周期、高效率生產(chǎn)。例如生產(chǎn)鮮酵母時(shí)，幾乎12小時(shí)就可以收獲一次，每年可以收獲數(shù)百次?！锕劝彼岫虠U菌：搖瓶種子→50噸發(fā)酵罐：52小時(shí)內(nèi)細(xì)胞數(shù)目可增加３２億倍。第二十四頁，共八十五頁。表1－3若干微生物的代時(shí)及每日增殖率微生物名稱代時(shí)每日分裂次數(shù)溫度每日增殖率

乳酸菌38分38252.7×1011

大腸桿菌18分80371.2×1024

根瘤菌110分13258.2×103

枯草桿菌31分46307.0×1013

光合細(xì)菌144分10301.0×103

釀酒酵母120分12304.1×103

小球藻7小時(shí)3.42510.6

念珠藻*23小時(shí)1.04252.1

硅藻17小時(shí)1.4202.64

草履蟲10.4小時(shí)2.3264.92

*為念珠藍(lán)菌屬(Nostoc)的舊稱，與細(xì)菌同屬原核生物。第二十五頁，共八十五頁。1→1×2（3×48）=2144=848=2.2×1043個(gè)E.coli=2.2×1031克（1克=1012個(gè)E.coli）=2.2×1025噸（地球=5.5×1021噸）=4000個(gè)地球的重量！問題：E.coli在條件適宜的情況下可以達(dá)到20分鐘一代。那么請(qǐng)大家估計(jì)一下，一個(gè)E.coli經(jīng)過48小時(shí)后產(chǎn)生的E.coli的重量會(huì)有多重？

第二十六頁，共八十五頁。4.種類多、分布廣分布廣：如:萬米深海、85公里高空、地層下128米和427米沉積巖中都發(fā)現(xiàn)有微生物存在。類型低限傾向種數(shù)高限病毒與立克次氏體1,2171,2171,217支原體424242細(xì)菌與放線菌>1,0001,5001,500藍(lán)細(xì)菌1,2271,5001,500藻類15,05123,10023,100真菌37,17547,30068,939原生動(dòng)物24,06824,06830,000總數(shù)79,78098,727127,298微生物的種數(shù)，據(jù)1972年：更重要的是在于微生物的生理代謝類型多、代謝產(chǎn)物種類多。第二十七頁，共八十五頁。答案：A：十幾億～幾十億個(gè)B：流感患者一聲咳嗽，可散播約有10萬個(gè)病菌；一個(gè)噴嚏約含有100萬個(gè)病菌。C：4萬個(gè)左右日常生活中的微生物數(shù)字

A、1克肥沃的土壤中微生物的數(shù)目？

B、一個(gè)流感病人一聲咳嗽，一個(gè)噴嚏會(huì)有多少個(gè)病菌？

C、手皮膚平均每平方厘米大致會(huì)多少個(gè)微生物？第二十八頁，共八十五頁。5.易變異、適應(yīng)強(qiáng)★任何有其它生物生存的環(huán)境中，都能找到微生物。而在其它生物不可能生存的極端環(huán)境中也有微生物存在?！锿蛔冾l率一般為10-5～10-10，但因繁殖快，數(shù)量多，與外界環(huán)境直接接觸，因而在短時(shí)間內(nèi)可出現(xiàn)大量變異的后代?！锴嗝顾禺a(chǎn)量變異、耐藥性變異舉例例如，青霉素生產(chǎn)菌Penicilliumchrysogenum(產(chǎn)黃青霉)的產(chǎn)量1943年為每毫升發(fā)酵液中含20單位青霉素，40多年來，經(jīng)過世界各國微生物遺傳育種工作者的不懈努力使該菌產(chǎn)量變異逐漸積累，加上發(fā)酵條件的改進(jìn)，目前世界上先進(jìn)國家的發(fā)酵水平每毫升已超過5萬單位，甚至接近10萬單位。微生物的數(shù)量性狀變異和育種使產(chǎn)量提高的幅度之大，是動(dòng)植物育種工作中絕對(duì)不可能達(dá)到的。正因?yàn)槿绱?，幾乎所有微生物發(fā)酵工廠都十分重視菌種選育工作。第二十九頁，共八十五頁。第一章：微生物的分離和純培養(yǎng)第三十頁，共八十五頁。微生物培養(yǎng)的常用器具Testtube(試管)Culturedish/Petridish(培養(yǎng)皿）第三十一頁，共八十五頁。ShakeFlask

（三角瓶)第三十二頁，共八十五頁。FermentorLabscalefermentor第三十三頁，共八十五頁。FermentorIndustrialScalefermentor第三十四頁，共八十五頁。接種操作第三十五頁，共八十五頁。無菌箱或無菌室內(nèi)操作第三十六頁，共八十五頁。用固體培養(yǎng)基獲得純培養(yǎng)第三十七頁，共八十五頁。常見固體培養(yǎng)基第三十八頁，共八十五頁。涂布平板法第三十九頁，共八十五頁。稀釋倒板法第四十頁，共八十五頁。平板劃線法第四十一頁，共八十五頁。第四十二頁，共八十五頁。用液體培養(yǎng)基獲得純培養(yǎng)對(duì)于不能在固體培養(yǎng)基上生長的微生物，有一部分可以用液體培養(yǎng)基稀釋法獲得純培養(yǎng)。第四十三頁，共八十五頁。單細(xì)胞（孢子）分離稀釋法有個(gè)重要的缺點(diǎn)，它只能分離樣品中占優(yōu)勢(shì)的菌種。采用顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為單細(xì)胞分離法。第四十四頁，共八十五頁。選擇培養(yǎng)1，采用選擇性平板。2，富集培養(yǎng)。第四十五頁，共八十五頁。菌種的保藏1、菌種保藏的原理

首先要挑選典型菌種的優(yōu)良純種,最好采用它們的休眠體(如分生孢子、芽孢等);其次,創(chuàng)造一個(gè)最有利休眠的環(huán)境條件,如干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)以及添加保護(hù)劑等。第四十六頁，共八十五頁。2、菌種保藏方法1）斜面菌種低溫保藏法---利用低溫對(duì)微生物生命活動(dòng)有抑制作用的原理進(jìn)行保藏。把斜面菌種、固體穿刺培養(yǎng)物或菌懸液等,直接放入4～5℃冰箱中。保藏時(shí)間一般不超過3個(gè)月,到時(shí)必須進(jìn)行移接傳代,再放回冰箱。第四十七頁，共八十五頁。2）砂土管保藏法---將干燥砂粒與細(xì)土混合后滅菌制成砂土管,然后接種保藏。若把砂土管放在低溫或抽氣后密封,效果更佳。此法適用于產(chǎn)孢子及芽孢菌種的保藏。保藏期1～10年3）石蠟油封藏法---向培養(yǎng)好的菌種斜面上,加入滅菌石蠟油,高出斜面1cm,然后蠟封管口,放入冰箱。該法既可防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā),又能使菌種與空氣隔絕。保藏期1～2年第四十八頁，共八十五頁。4）真空冷凍干燥法---是目前較理想的一種方法。在低于-15℃下,快速將細(xì)胞凍結(jié),并保持細(xì)胞完整,然后在真空中使水分升華致干。在此環(huán)境中,微生物的生長和代謝都暫時(shí)停止,不易發(fā)生變異,故可長時(shí)間保存,一般為5～10年,最多可達(dá)15年之久。此法兼?zhèn)淞说蜏?、干燥及缺氧幾方面條件,使微生物可以保存較長時(shí)間,但手續(xù)較麻煩,需要一定的設(shè)備。第四十九頁，共八十五頁。3、菌種保藏中心我國由于1979年7月成立了中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)(CCCCM),----普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC)--中科院微生物所,北京(AS),真菌、細(xì)菌;中科院武漢病毒研究所,武漢(AS-IV),病毒。----農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)---中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所,北京(ISF)。----工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)---輕工業(yè)部第五十頁，共八十五頁。美國的“美國典型菌種收藏所”(ATCC)，保藏方式主要采用冷凍干燥和液氮超低溫凍結(jié)法。第五十一頁，共八十五頁。顯微鏡和顯微技術(shù)決定顯微觀察效果的因素：放大倍數(shù)，分辨率和反差。分辨率是辨別兩點(diǎn)間最小距離的能力。反差是樣品區(qū)別于背景的程度。第五十二頁，共八十五頁。普通光學(xué)顯微鏡由于肉眼的正常分辨率為0.25mm左右，因此光學(xué)顯微鏡的有效放大倍數(shù)只能達(dá)到1000-1500倍。第五十三頁，共八十五頁。暗視野顯微鏡第五十四頁，共八十五頁。第五十五頁，共八十五頁。相差顯微鏡光穿過標(biāo)本時(shí)，由于標(biāo)本各部分的折射率和厚度不同，加快和滯后的光波產(chǎn)生相位差。利用特殊光學(xué)裝置——環(huán)狀光闌和相差板，可以將產(chǎn)生的相位差轉(zhuǎn)換為人眼可以觀察的振幅差。第五十六頁，共八十五頁。第五十七頁，共八十五頁。熒光顯微鏡第五十八頁，共八十五頁。透射電子顯微鏡第五十九頁，共八十五頁。第六十頁，共八十五頁。第六十一頁，共八十五頁。第六十二頁，共八十五頁。掃描電子顯微鏡第六十三頁，共八十五頁。第六十四頁，共八十五頁。第六十五頁，共八十五頁。顯微觀察樣品的制備光學(xué)顯微鏡樣品的制備活體觀察。

壓滴法，懸滴法，菌絲埋片法。染色觀察。第六十六頁，共八十五頁。懸滴法第六十七頁，共八十五頁。2,電子顯微鏡樣品制備生物樣品電鏡觀察前，必須進(jìn)行固定和干燥，否則鏡筒中的高真空會(huì)導(dǎo)致其嚴(yán)重脫水，結(jié)構(gòu)變形。此外，由于構(gòu)成生物樣品的元素對(duì)電子的散射和吸收能力較弱，樣品一般需用重金屬鹽染色和噴鍍，以提高其反差。第六十八頁，共八十五頁。顯微鏡下的生物代表性細(xì)菌第六十九頁，共八十五頁。單球菌：細(xì)胞分裂沿一個(gè)平面進(jìn)行，新個(gè)體分散而單