課題的教學(xué)課件

歡迎各位專(zhuān)家光臨歡迎各位專(zhuān)家光臨1《一氧化氮合酶與婦科腫瘤關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究》課題鑒定

驗(yàn)收資料匯編二00五年十二月《一氧化氮合酶與婦科腫瘤關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究》課題鑒定

驗(yàn)收資料匯2目錄一、《一氧化氮合酶與婦科腫瘤關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究》課題摘要二、《一氧化氮合酶與婦科腫瘤關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究》課題工作報(bào)告三、《一氧化氮合酶與婦科腫瘤關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究》課題技術(shù)報(bào)告四、文獻(xiàn)綜述五、主要完成單位及完成人員六、科技查新報(bào)告七、已發(fā)表的論文八、附圖目錄一、《一氧化氮合酶與婦科腫瘤關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究》課3

課題摘要

一目的：檢測(cè)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）在絨毛膜癌、子宮肌瘤、子宮頸癌及卵巢癌組織中的表達(dá)情況，探討一氧化氮合酶在婦科腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。

課題摘要

一目的：4二方法選取臨床病理資料172例分為四組：其中子宮頸癌51例；絨毛膜癌24例；卵巢癌55例；子宮肌瘤42例，各組均采集其相對(duì)應(yīng)的正常組織標(biāo)本共計(jì)130例作為對(duì)照（子宮頸組織50例；絨毛組織22例；卵巢組織50例；子宮平滑肌組織8例），應(yīng)用免疫組化的方法，觀察eNOS、iNOS在四種婦科腫瘤組織中的表達(dá)。二方法選取臨床病理資料172例分為四組：其中子宮頸癌515

三、結(jié)果

1、eNOS、iNOS蛋白在四種婦科腫瘤組織中均有不同程度的表達(dá)，均顯著高于其正常對(duì)照組織。2、eNOS、iNOS蛋白在子宮頸癌組織中的表達(dá)與宮頸癌的病理分級(jí)有關(guān)（P<0.05）,隨著宮頸癌分級(jí)的升高而呈上升趨勢(shì)。3、在子宮肌瘤中eNOS、iNOS蛋白相比，eNOS的表達(dá)顯著高于iNOS（P<0.05）。

三、結(jié)果

1、eNOS、iNOS蛋白在四種婦科腫瘤組織6四結(jié)論1、一氧化氮合酶蛋白的表達(dá)與四種婦科腫瘤組織有關(guān)，它們可能在四種婦科腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。2、NOS可望成為早期診斷子宮頸癌的檢測(cè)指標(biāo)之一，也可望利用NOS抑制劑來(lái)治療宮頸癌。把測(cè)定NOS作為判斷宮頸癌細(xì)胞分化程度的一個(gè)參考指標(biāo)。四結(jié)論1、一氧化氮合酶蛋白的表達(dá)與四種婦科腫瘤組織有關(guān)，7課題工作報(bào)告一氧化氮合酶與婦科腫瘤關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究課題工作報(bào)告一氧化氮合酶與婦科腫瘤關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究8一、課題研究的目的意義

腫瘤是危害人類(lèi)生命健康極大的特殊疾病，目前全世界每年死于癌癥的近1千萬(wàn)人，60％以上的患者在初次確診惡性腫瘤的時(shí)候就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移，因此，提出尋找腫瘤形成的原因成了世界所關(guān)心的課題。在女性生殖系統(tǒng)疾患中，婦科腫瘤的發(fā)生率占有一定的比例，嚴(yán)重威脅著廣大婦女的健康，其中子宮頸癌、絨毛膜癌、卵巢癌、子宮肌瘤是比較常見(jiàn)的婦科腫瘤。一、課題研究的目的意義腫瘤是危害人類(lèi)生命健康極大的特殊疾9

這些腫瘤由于確切病因不明，發(fā)病機(jī)理不清，因而，臨床治療效果還不十分理想。因此，探討腫瘤發(fā)生、發(fā)展的致瘤因素已具有十分重要的意義。近十多年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，使NO成為腫瘤病因?qū)W研究的熱點(diǎn)。一氧化氮合酶（nitricoxidesynthase,NOS）是催化一氧化氮（nitricoxide，NO）生物合成的酶，也是內(nèi)源性NO合成的關(guān)鍵酶。這些腫瘤由于確切病因不明，發(fā)病機(jī)理不清，因而，臨床治療效10已知NOS按調(diào)節(jié)方式分為結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶（cNOS）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）兩種類(lèi)型，其中cNOS又包括神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）兩種。cNOS為細(xì)胞本身所固有，在生理?xiàng)l件下受鈣離子—鈣調(diào)蛋白系統(tǒng)調(diào)節(jié)，合成少量NO，主要參與機(jī)體正常生理功能的維持，發(fā)揮調(diào)節(jié)血管口徑、通透性、傳遞細(xì)胞信息等生物學(xué)作用。已知NOS按調(diào)節(jié)方式分為結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶（cNOS）和誘導(dǎo)11iNOS則主要存在于誘導(dǎo)活化的巨噬細(xì)胞，非依賴(lài)于鈣離子—鈣調(diào)蛋白系統(tǒng)，在生理?xiàng)l件下iNOS不表達(dá)活性，在乏氧、炎癥（如細(xì)菌脂多糖LPS）、細(xì)胞因子（TNF、IL1、INF-a等）作用下iNOS誘導(dǎo)生成NO，NO產(chǎn)量大，具有重要的殺菌、抗病毒以及殺腫瘤細(xì)胞活性，參與了抗腫瘤免疫過(guò)程。iNOS則主要存在于誘導(dǎo)活化的巨噬細(xì)胞，非依賴(lài)于鈣離子—鈣調(diào)12NO可能促瘤生長(zhǎng)作用的原因有三點(diǎn)：1.低氧上調(diào)iNOS表達(dá)，NO在內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)有絲分裂，在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)和促進(jìn)腫瘤新生血管的形成。因此，NO促瘤生長(zhǎng)作用原因之一可能與血管形成因子有關(guān)。2.NO是強(qiáng)有力的血管舒張劑，NO促瘤生長(zhǎng)作用原因之二可能是NO及其產(chǎn)物引起腫瘤組織血流或血管通透性增加，血流的加快和血管通透性提高增加了腫瘤的養(yǎng)分和加快了代謝廢物的清除，從而加快了癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)。NO可能促瘤生長(zhǎng)作用的原因有三點(diǎn)：1.低氧上調(diào)iNOS表達(dá)，133.NO還可以通過(guò)抑制免疫系統(tǒng)和促進(jìn)局部組織的誘變性促進(jìn)局部腫瘤的生長(zhǎng)。因此，NO在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。本課題從蛋白水平上探討了NOS在四種婦科腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮的作用，為將來(lái)利用NOS抑制劑防治婦科腫瘤提供理論基礎(chǔ)，應(yīng)用基因療法徹底根治婦科腫瘤指明了方向。3.NO還可以通過(guò)抑制免疫系統(tǒng)和促進(jìn)局部組織的誘變性促進(jìn)局部14二、課題的內(nèi)容

本實(shí)驗(yàn)共分4組：（1）絨毛膜癌及對(duì)照組織46例；（2）子宮肌瘤及其對(duì)照組織50例；（3）子宮頸癌及其對(duì)照組織101例；（4）卵巢癌及其對(duì)照組織105例每一蠟塊連續(xù)切片3張，一張做HE染色，其余兩張分別用于eNOS、iNOS染色。免疫組織化學(xué)染色，采用常規(guī)的SP法。每次染色設(shè)置陽(yáng)性、陰性對(duì)照。仔細(xì)觀察每張切片中eNOS、iNOS蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)及分布情況，仔細(xì)觀察每張切片的病理特點(diǎn)，并且作好記錄。最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。二、課題的內(nèi)容本實(shí)驗(yàn)共分4組：（1）絨毛膜癌及對(duì)照組織4615三、技術(shù)路線及實(shí)施過(guò)程(一)標(biāo)本來(lái)源及篩選全部婦科腫瘤及對(duì)照組標(biāo)本均來(lái)源于甘肅省定西地區(qū)醫(yī)院1993年3月—2019年10月，經(jīng)手術(shù)切除并備有完整臨床資料的病理科存檔蠟塊，共計(jì)302塊。從中篩選出實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本172例，其正常對(duì)照組織總共130例。所有婦科惡性腫瘤患者術(shù)前未接受放療、化療或其它特殊治療，子宮肌瘤患者術(shù)前三個(gè)月未服用過(guò)激素。三、技術(shù)路線及實(shí)施過(guò)程(一)標(biāo)本來(lái)源及篩選16（二）臨床病理資料24例絨毛膜癌全部為妊娠性絨癌，臨床分期為Ⅰ期者9例，Ⅱ期者6例，Ⅲ期者6例，Ⅳ期者3例；42例子宮肌瘤中，病理組織類(lèi)型為肌壁間子宮肌瘤者28例，漿膜下者7例，粘膜下者7例；51例子宮頸癌中，病理分級(jí)為Ⅰ級(jí)者10例，Ⅱ級(jí)者16例，Ⅲ級(jí)者25例；臨床分期為Ⅰ期者18例，Ⅱ期者12例，Ⅲ期者9例，Ⅳ期者12例。55例卵巢惡性腫瘤中，組織類(lèi)型為漿液性乳頭狀囊腺癌者16例，粘液性乳頭狀囊腺癌者19例，卵巢轉(zhuǎn)移癌者14例，卵巢顆粒細(xì)胞癌者6例。（二）臨床病理資料24例絨毛膜癌全部為妊娠性絨癌，臨床分期為17（三）藥品與試劑1、兔抗人NOS2多克隆抗體：BosterBiotechnologyComLTD2、兔抗人NOS3多克隆抗體：BosterBiotechnologyComLTD3、DAB顯色試劑盒：福州邁新生物有限公司4、SP試劑盒：福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司（三）藥品與試劑1、兔抗人NOS2多克隆抗體：Boster18（四）主要儀器和設(shè)備1、光學(xué)顯微鏡及顯微照相系統(tǒng)：日本Olympus公司2、切片機(jī)：德國(guó)產(chǎn)AQ8203、臺(tái)式恒溫震蕩器（TH2-82A）：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠4、臺(tái)式高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠5、恒溫孵箱、濕盒、微波爐等（四）主要儀器和設(shè)備1、光學(xué)顯微鏡及顯微照相系統(tǒng)：日本Oly19（五）實(shí)驗(yàn)方法本實(shí)驗(yàn)共分4組：（1）絨毛膜癌及對(duì)照組織46例；（2）子宮肌瘤及其對(duì)照組織50例（3）子宮頸癌及其對(duì)照組織101例；（4）卵巢癌及其對(duì)照組織105例；每一蠟塊連續(xù)切片3張，一張做HE染色，其余兩張分別用于eNOS、iNOS染色，采用免疫化學(xué)染色法，即常規(guī)的SP法，仔細(xì)觀察每張切片的病理特點(diǎn)，并且作好記錄。每次染色設(shè)置陽(yáng)性、陰性對(duì)照。（五）實(shí)驗(yàn)方法本實(shí)驗(yàn)共分4組：（1）絨毛膜癌及對(duì)照組織46例20（六）結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)eNOS、iNOS蛋白染色的陽(yáng)性信號(hào)均為細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)均勻一致或細(xì)顆粒狀的棕黃色染色。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比及顯色強(qiáng)度分為4個(gè)等級(jí)：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)極少，無(wú)色者為陰性（一）；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<25%，呈淡黃色者為弱陽(yáng)性（+）；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為25%～50%，呈黃色者為中等陽(yáng)性（++）；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%，呈棕黃色者為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。（六）結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)eNOS、iNOS蛋白染色的陽(yáng)性信號(hào)均為細(xì)21（七）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：將結(jié)果進(jìn)行2×2或R×C聯(lián)表的x2檢驗(yàn)或者四格表確切概率法，P<0.05為差異有顯著性，統(tǒng)計(jì)應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件在微機(jī)上完成。（七）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：將結(jié)果進(jìn)行2×2或R×C聯(lián)表的x2檢驗(yàn)或者22

四、課題的進(jìn)度本課題共分五個(gè)階段：

（一）第一階段（2019.9～2019.10）：進(jìn)行文獻(xiàn)檢索、設(shè)計(jì)、制定研究課題，并閱讀國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，其中英文17篇，中文73篇，共計(jì)90篇。在此期間，撰寫(xiě)文獻(xiàn)綜述1篇，科研論文1篇。（二）第二階段（2019.11～2019.12）：收集、篩選、確定了子宮頸癌、絨毛膜癌、卵巢癌、子宮肌瘤手術(shù)后標(biāo)本172例及其對(duì)照組織130例，將這些標(biāo)本進(jìn)行登記制表。訂購(gòu)試劑，撰寫(xiě)技術(shù)項(xiàng)目申請(qǐng)報(bào)告，做預(yù)備實(shí)驗(yàn)及部分正式實(shí)驗(yàn)。。

四、課題的進(jìn)度本課題共分五個(gè)階段：

（一）第一階段（2023（三）第三階段（2019.1～2019.2）：繼續(xù)做正式實(shí)驗(yàn)。對(duì)所選四種婦科腫瘤組織及其對(duì)照組織進(jìn)行HE染色、eNOS、iNOS蛋白的免疫組化染色，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行仔細(xì)觀察，并對(duì)每一例標(biāo)本的染色結(jié)果做好詳細(xì)的記錄，制定統(tǒng)計(jì)圖表，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。（四）第四階段（2019.3～2019.4）：撰寫(xiě)項(xiàng)目技術(shù)資料初稿。（五）第五階段（2019.5～2019.9）：對(duì)初稿進(jìn)行兩次修改，審核定稿，打印技術(shù)項(xiàng)目申請(qǐng)報(bào)告。（三）第三階段（2019.1～2019.2）：繼續(xù)做正式實(shí)驗(yàn)24五、應(yīng)用前景及社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益分析本課題采用細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)—免疫組織化學(xué)（免疫組化）方法，從蛋白水平上探討與這四種婦科腫瘤致瘤因素相關(guān)的指標(biāo)—一氧化氮合酶，通過(guò)對(duì)一氧化氮合酶的兩種同工酶eNOS、iNOS進(jìn)行檢測(cè)，掌握它們?cè)谒姆N婦科腫瘤組織中的表達(dá)特點(diǎn)，進(jìn)一步為臨床防治這四種婦科腫瘤提供理論依據(jù)，也為將來(lái)應(yīng)用基因療法治療這四種婦科腫瘤指明方向，有潛在的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益，可望在不久的將來(lái)利用一氧化氮合酶的抑制劑治療這四種婦科腫瘤，為臨床新藥的開(kāi)辟提供方向，為婦科腫瘤患者的疾苦作出貢獻(xiàn)。五、應(yīng)用前景及社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益分析本課題采用細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)—25六、課題經(jīng)費(fèi)預(yù)算與用途（一）購(gòu)買(mǎi)試劑：免疫組化試劑10000元，一般試劑4000元。（二）復(fù)印及打印費(fèi)：2000元。（三）切片勞務(wù)費(fèi)：4000元。（五）技術(shù)項(xiàng)目評(píng)審費(fèi)：2000元。（六）其它：5000元。上述各項(xiàng)費(fèi)用共計(jì)27000元。六、課題經(jīng)費(fèi)預(yù)算與用途（一）購(gòu)買(mǎi)試劑：免疫組化試劑1000026七、課題承擔(dān)單位簡(jiǎn)況定西市人民醫(yī)院始建于一九五0年，經(jīng)過(guò)五十年的發(fā)展，已成為醫(yī)療、教學(xué)、科研、預(yù)防、急救為一體的綜合性醫(yī)院。近年來(lái)，醫(yī)院相繼引進(jìn)了美國(guó)GE—9800全身CT，德國(guó)西門(mén)子彩超等現(xiàn)代化醫(yī)療設(shè)備，擁有高中級(jí)專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員160多人，參與了一項(xiàng)國(guó)家“八五”攻關(guān)課題，部分項(xiàng)目已達(dá)到全省領(lǐng)先水平。七、課題承擔(dān)單位簡(jiǎn)況定西市人民醫(yī)院始建于一九五0年，經(jīng)過(guò)五十27課題組成員簡(jiǎn)況本課題技術(shù)指導(dǎo)王麗京教授，蘭州大學(xué)生命科學(xué)院博士，蘭州醫(yī)學(xué)院碩士研究生導(dǎo)師。項(xiàng)目負(fù)責(zé)人陳芳蘭同志系王麗京教授的碩士研究生，1989年從蘭州醫(yī)學(xué)院畢業(yè)，分配到定西市醫(yī)院工作，2019年取得碩士學(xué)位，已具備承擔(dān)科研項(xiàng)目的實(shí)力，于2019年12月晉升為婦產(chǎn)科副主任醫(yī)師。其余主要完成人員名單依次如下：郭碧蓮，1994畢業(yè)于蘭州醫(yī)學(xué)院，本科學(xué)歷，2019年10月晉升為婦產(chǎn)科主治醫(yī)師。李淑梅、孫風(fēng)副主任醫(yī)師，本科學(xué)歷。還有師金梅、孟萍等4名同志參與，都具有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)和扎實(shí)的理論基礎(chǔ)，以上同志均為婦產(chǎn)科的業(yè)務(wù)骨干。課題組成員簡(jiǎn)況本課題技術(shù)指導(dǎo)王麗京教授，蘭州大學(xué)生命科學(xué)院博28《一氧化氮合酶與婦科腫瘤

關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究》

課題技術(shù)報(bào)告《一氧化氮合酶與婦科腫瘤

關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究》

課題技術(shù)報(bào)告29

一氧化氮合酶是催化內(nèi)源性一氧化氮生物合成的關(guān)鍵酶。由于一氧化氮對(duì)腫瘤的影響具有致瘤及抗腫瘤的雙向作用，故人們對(duì)一氧化氮合酶、一氧化氮的研究方興未艾。近年來(lái)，有關(guān)NOS在體內(nèi)外腫瘤組織中表達(dá)的研究報(bào)道很多。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一些動(dòng)物腫瘤模型及人腫瘤系均有NOS表達(dá)，而且在人肝癌、腦腫瘤、肺鱗狀細(xì)胞癌、食管癌、、膀胱癌、乳腺及前列腺等的腫瘤中發(fā)現(xiàn)NOS活性增高。有關(guān)系統(tǒng)地研究NOS在四種婦科腫瘤組織中表達(dá)的研究報(bào)道卻未見(jiàn)到1、國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

一氧化氮合酶是催化內(nèi)源性一氧化氮生物合成的關(guān)鍵酶。由于301、

有人用分光光度計(jì)檢測(cè)了42例卵巢腫瘤中NOS活性，顯示卵巢惡性腫瘤的發(fā)生與NOS的活性有關(guān)，且NOS隨分化程度的降低而呈升高趨勢(shì)2、Sanyal等采用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)了絨癌細(xì)胞株（JEG—3）及正常位置胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞中NOS的表達(dá)，結(jié)果顯示eNOS、iNOS完全缺如，只有nNOS存在。其原因可能是Sanyal等研究的是體外培養(yǎng)的絨癌細(xì)胞株的緣故。國(guó)內(nèi)目前尚未發(fā)現(xiàn)一篇有關(guān)NOS與絨癌相關(guān)的研究報(bào)道；有關(guān)NOS與子宮肌瘤的研究報(bào)道亦未見(jiàn)到。1、

有人用分光光度計(jì)檢測(cè)了42例卵巢腫瘤中NOS活性，顯示312、關(guān)鍵技術(shù)2.1

HE切片形態(tài)學(xué)觀察：實(shí)驗(yàn)的每一蠟塊連續(xù)切片3張，一張做HE染色，其余兩張分別用于eNOS、iNOS染色。仔細(xì)觀察每張切片的病理特點(diǎn)，并且作好記錄。2.2免疫組織化學(xué)染色：每次染色設(shè)置陽(yáng)性，陰性對(duì)照。采用常規(guī)的SP法，具體方法如下:2、關(guān)鍵技術(shù)2.1HE切片形態(tài)學(xué)觀察：實(shí)驗(yàn)的每一蠟塊連續(xù)切32(1)切片650G烘烤72小時(shí)后浸入新鮮二甲苯15min×2(2)梯度酒精各5min至水(3)0.01mol/LPBS洗5min×3(4)3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶10min(5)PBS洗5min×3(6)加入復(fù)合消化液置370G恒溫箱15分鐘，以充分暴露組織中的抗原。(7)PBS洗5min×3。(1)切片650G烘烤72小時(shí)后浸入新鮮二甲苯15min×233(8)正常山羊血清封閉細(xì)胞中非特異性抗原，減少非特異性著色，室溫下孵育10分鐘，PBS洗一次即可。(9)加入第一抗體兔抗人NOS2、NOS3多克隆抗體，溫盒內(nèi)40G冰箱過(guò)夜(10)40G冰箱取出后，室溫下復(fù)溫1小時(shí)。(11)PBS洗5min×3(12)加生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫下孵育10分鐘。(13)PBS洗5min×3(8)正常山羊血清封閉細(xì)胞中非特異性抗原，減少非特異性著色，34(14)加入鏈霉素抗生物素蛋白—過(guò)氧化酶溶液，室溫下孵育10分鐘。(15)PBS洗5min×3(16)加入新鮮配制的3,3—二氨基苯二胺（DAB）底物溶液，室溫避光顯色30—40分鐘，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，流水沖洗終止反應(yīng)。(17)蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗，鹽酸酒精分化數(shù)秒。(18)自來(lái)水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。(14)加入鏈霉素抗生物素蛋白—過(guò)氧化酶溶液，室溫下孵育10352.3、對(duì)照觀察1、陰性對(duì)照：用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。2、陽(yáng)性對(duì)照片由武漢博士德公司提供的乳腺癌陽(yáng)性片。2.3、對(duì)照觀察1、陰性對(duì)照：用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。363、技術(shù)研究的內(nèi)容3、技術(shù)研究的內(nèi)容373.1一氧化氮合酶在絨毛膜癌及正常絨毛組織中的表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：絨毛膜癌組與對(duì)照組間eNOS蛋白陽(yáng)性表達(dá)率有顯著性差異（Χ2=5.122727，P<0.05）。

鏡下可見(jiàn)eNOS蛋白表達(dá)主要位于細(xì)胞漿，呈棕黃色。如下表1：組別 例數(shù)eNOS表達(dá)陽(yáng)性率-++++++ （%）

對(duì)照組221840018.18絨毛膜癌 241247150.00

3.1一氧化氮合酶在絨毛膜癌及正常絨毛組織中的表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)分38iNOS蛋白表達(dá)也位于細(xì)胞漿，只是染色強(qiáng)度較弱而已。陽(yáng)性情況見(jiàn)表2。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：絨毛膜癌組與對(duì)照組間iNOS蛋白陽(yáng)性表達(dá)率有顯著性差異（Χ2=5.517919，P<0.05）。表2組別例數(shù)iNOS表達(dá)陽(yáng)性率-++++++（%） 對(duì)照組22211004.55絨毛膜癌241590037.50 iNOS蛋白表達(dá)也位于細(xì)胞漿，只是染色強(qiáng)度較弱而已。陽(yáng)性情況393.2一氧化氮合酶在子宮肌瘤及正常平滑肌組織中的表達(dá)在子宮肌瘤組織中，eNOS陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞主要分布在肌瘤組織的中央，呈局灶性分布，其染色較強(qiáng)，呈棕黃色細(xì)顆粒狀。iNOS的分布特點(diǎn)基本類(lèi)似于eNOS，只是染色強(qiáng)度較弱。結(jié)果見(jiàn)表3表3組別 例數(shù)eNOS iNOS 陽(yáng)性數(shù) 陽(yáng)性率% 陽(yáng)性數(shù)陽(yáng)性率% 子宮肌瘤組 42 35 83.33 25 59.52 正常對(duì)照組 8 2 25.00 1 12.50 X2值 9.046 4.218 P值 <0.005 <0.05 3.2一氧化氮合酶在子宮肌瘤及正常平滑肌組織中的表達(dá)在子宮肌4035例eNOS陽(yáng)性表達(dá)的子宮肌瘤組織中，iNOS陽(yáng)性表達(dá)者為25例，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩者有顯著的相關(guān)性（P<0.05）見(jiàn)表4。表4eNOS iNOS 合計(jì) 陽(yáng)性 陰性 陽(yáng)性 25 10 35 陰性 1 6 7 35例eNOS陽(yáng)性表達(dá)的子宮肌瘤組織中，iNOS陽(yáng)性表達(dá)者為413.3一氧化氮合酶在宮頸癌及正常宮頸組織中的表達(dá)eNOS蛋白陽(yáng)性的細(xì)胞主要分布于癌巢組織中，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，免疫細(xì)胞無(wú)eNOS蛋白陽(yáng)性表達(dá)。iNOS陽(yáng)性的細(xì)胞分布基本與eNOS蛋白的一致，只是表達(dá)強(qiáng)度較弱而已，eNOS、iNOS在子宮頸癌組織的表達(dá)率明顯高于其正常對(duì)照組織（P均<0.01），見(jiàn)表5表5組別 例數(shù) eNOS表達(dá) iNOS表達(dá) -++++++陽(yáng)性率(%)-++++++陽(yáng)性率（%）宮頸癌組51 68112688.2310278680.39 對(duì)照組50 30155040.004073 020.00 3.3一氧化氮合酶在宮頸癌及正常宮頸組織中的表達(dá)eNOS蛋白42在不同病理分級(jí)中，經(jīng)RXC聯(lián)表的x2檢驗(yàn)，eNOS、iNOS各組間比較P均<0.05，且隨著病理分級(jí)的升高而呈上升趨勢(shì)；eNOS、iNOS在臨床分期的比較中無(wú)顯著性差異P均>0.05。具體結(jié)果見(jiàn)表6。表6類(lèi)型 例數(shù)eNOS表達(dá)強(qiáng)度 iNOS表達(dá)強(qiáng)度 - ++++++ -++++++病理分級(jí) G1~G22663512 9 1043 G32505614 1 1743 臨床分期 Ⅰ期~Ⅱ期304 58136 1554 Ⅲ期~Ⅳ期212 3313 4 1232 在不同病理分級(jí)中，經(jīng)RXC聯(lián)表的x2檢驗(yàn)，eNOS、iNOS433.4一氧化氮合酶在卵巢癌組織及正常卵巢組織中的表達(dá)檢測(cè)顯示：eNOS、iNOS蛋白表達(dá)在卵巢癌組織中均明顯高于正常對(duì)照組織（P均<0.01），兩者相比有極顯著性差異。而eNOS、iNOS在卵巢癌不同組織類(lèi)型的陽(yáng)性表達(dá)率相互比較無(wú)顯著性差異P>0.05。結(jié)果見(jiàn)表7表7類(lèi)別 例數(shù) *eNOS **iNOS 陽(yáng)性率(%) 陽(yáng)性率(%) 對(duì)照組 50 5（10.00）0（0） 卵巢癌組 55 40（72.73） 25(45.46) 組織類(lèi)型 漿液性乳頭狀囊腺癌16 13(81.25) 9(56.25) 粘液性乳頭狀囊腺癌19 11(57.89) 6(31.58) 卵巢轉(zhuǎn)移癌 14 10(71.43)6(42.86) 卵巢顆粒細(xì)胞癌 6 6(100.00) 4(66.67) 3.4一氧化氮合酶在卵巢癌組織及正常卵巢組織中的表達(dá)檢測(cè)顯示44技術(shù)研究結(jié)論技術(shù)研究結(jié)論454.1絨毛膜癌組研究結(jié)論eNOS、iNOS蛋白的高表達(dá)與絨毛膜癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，它們可能在絨毛膜癌的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮一定的作用。eNOS、iNOS在早孕正常絨毛組織中的弱表達(dá)，說(shuō)明由它們催化生成的NO量較少，這些NO可能與早孕正常絨毛組織的生理功能有關(guān)。eNOS、iNOS在絨毛膜癌組織中的高表達(dá)，間接反映了滋養(yǎng)葉細(xì)胞中生成的NO含量較高，這些NO可能通過(guò)某些途徑發(fā)揮了致瘤與促瘤生長(zhǎng)的作用，至于通過(guò)哪條途徑發(fā)揮作用，值得進(jìn)一步探討。4.1絨毛膜癌組研究結(jié)論eNOS、iNOS蛋白的高表達(dá)與絨毛464.2子宮肌瘤組研究結(jié)論結(jié)果說(shuō)明eNOS和iNOS的過(guò)表達(dá)與子宮肌瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，它們可能在子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)制中起一定的作用。本研究還顯示eNOS與iNOS的陽(yáng)性表達(dá)相比，二者有顯著的相關(guān)性P<0.05)，這說(shuō)明eNOS和iNOS在子宮肌瘤組織中的表達(dá)呈同步性，兩者參與肌瘤細(xì)胞的增殖與分化，導(dǎo)致肌瘤的發(fā)生，發(fā)揮協(xié)同作用，且eNOS的作用大于iNOS的作用。在正常子宮平滑肌組織中eNOS和iNOS的弱表達(dá)，說(shuō)明這些較少的NO可能與平滑肌細(xì)胞的正常生理功能有關(guān)。NOS在子宮肌瘤組織中的高表達(dá)間接反映了肌瘤細(xì)胞中生成的NO含量較高，但NO和NOS究竟是通過(guò)哪條途徑促進(jìn)子宮肌瘤的發(fā)生、發(fā)展，還有待于進(jìn)一步探討。4.2子宮肌瘤組研究結(jié)論結(jié)果說(shuō)明eNOS和iNOS的過(guò)表達(dá)與474.3宮頸癌組研究結(jié)論研究說(shuō)明eNOS、iNOS的表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。eNOS、iNOS在宮頸癌組織中的異常表達(dá)，表明了宮頸癌局部組織中由兩種NOS催化誘導(dǎo)合成的NO量較多，這些高水平的NO可能非但不能發(fā)揮抗腫瘤活性，反而促進(jìn)了宮頸癌細(xì)胞的增殖與分化，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，發(fā)揮了致瘤和促瘤生長(zhǎng)作用。利用NOS在宮頸組織中的表達(dá)特點(diǎn)，我們可以將NOS作為將來(lái)早期診斷宮頸癌的檢測(cè)指標(biāo)之一，也可以利用NOS抑制劑來(lái)治療宮頸癌。本研究的結(jié)果還表明eNOS、iNOS的表達(dá)與宮頸癌的臨床分期無(wú)關(guān)（P>0.05），與宮頸癌的病理分級(jí)有關(guān)（P<0.05）,隨著宮頸癌病理分級(jí)的升高而呈上升趨勢(shì)。這說(shuō)明eNOS、iNOS與腫瘤細(xì)胞的分化程度有關(guān)，分化越差的腫瘤細(xì)胞NOS的表達(dá)越強(qiáng)，我們可以把測(cè)定NOS作為判斷宮頸癌細(xì)胞分化程度的一個(gè)參考指標(biāo)。4.3宮頸癌組研究結(jié)論研究說(shuō)明eNOS、iNOS的表達(dá)與宮頸484.4卵巢癌組研究結(jié)論eNOS、iNOS在卵巢惡性腫瘤組織中的表達(dá)均明顯高于正常卵巢(P均<0.01)，eNOS、iNOS的異常表達(dá)，表明了由NOS催化合成的NO異常，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖與分化，從而發(fā)揮了致癌和促癌生長(zhǎng)作用。eNOS在正常卵巢組織的弱表達(dá)，可能與eNOS催化生成的少量NO維持卵巢正常生理功能有關(guān)。本研究還顯示：在卵巢惡性腫瘤的各組織類(lèi)型中，eNOS、iNOS蛋白的表達(dá)沒(méi)有明顯的差別（P均>0.05），這表明eNOS、iNOS僅僅參與了卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，在決定卵巢癌的組織類(lèi)型等方面沒(méi)有發(fā)揮重要作用。卵巢惡性腫瘤組織中NOS表達(dá)增高是NO合成增多的重要原因之一，也是促進(jìn)腫瘤發(fā)生及生長(zhǎng)過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。4.4卵巢癌組研究結(jié)論eNOS、iNOS在卵巢惡性腫瘤組織中49綜上所述,eNOS、iNOS蛋白在四種婦科腫瘤組織中均有不同程度的表達(dá)；它們可能在四種婦科腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用；NOS可望成為早期診斷子宮頸癌的檢測(cè)指標(biāo)之一，也可作為判斷宮頸癌預(yù)后的指標(biāo)。經(jīng)甘肅省醫(yī)學(xué)情報(bào)研究所查新檢索（報(bào)告編號(hào)：6203262019392）：有關(guān)應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)子宮肌瘤、絨毛膜癌組織中內(nèi)皮型一氧化氮合酶及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的研究，國(guó)內(nèi)未有文獻(xiàn)報(bào)道；有關(guān)子宮頸癌的國(guó)內(nèi)雖有相關(guān)報(bào)道，但研究的內(nèi)容和結(jié)果不完全相同；有關(guān)卵巢癌的雖有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，但所用方法與本課題不同。綜上所述,eNOS、iNOS蛋白在四種婦科腫瘤組織中505、項(xiàng)目的創(chuàng)新點(diǎn)5、項(xiàng)目的創(chuàng)新點(diǎn)511、在選題方面本課題采用免疫組化技術(shù)，對(duì)子宮頸癌、絨毛膜癌、卵巢癌及子宮肌瘤四種組織中eNOS、iNOS進(jìn)行綜合檢測(cè)，研究分析，對(duì)單腫瘤單因素的研究方法進(jìn)行了改進(jìn)。1、在選題方面本課題采用免疫組化技術(shù)，對(duì)子宮頸癌、絨毛膜522、在研究層次上本課題從蛋白水平上對(duì)四種婦科腫瘤組織中的一氧化氮合酶的兩種同工酶（eNOS、iNOS）進(jìn)行了檢測(cè)，與傳統(tǒng)研究腫瘤的方法（大體器官學(xué)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)HE）相比，層次上更進(jìn)了一步。2、在研究層次上本課題從蛋白水平上對(duì)四種婦科腫瘤組織中的一氧533、研究結(jié)果顯示四種腫瘤組織中eNOS、iNOS均有不同程度的表達(dá)，表達(dá)趨勢(shì)為子宮頸癌最高，子宮肌瘤、卵巢癌次之，絨毛膜癌最低；子宮頸癌中NOS的表達(dá)與宮頸癌的病理分級(jí)有關(guān)，與臨床分期無(wú)關(guān)，隨著病理分級(jí)的升高，NOS的表達(dá)呈上升趨勢(shì)。換言之，宮頸癌的惡性程度越高（細(xì)胞的分化程度越低），NOS的表達(dá)越強(qiáng)。3、研究結(jié)果顯示四種腫瘤組織中eNOS、iNOS均有不同程度544、研究得出的結(jié)論NOS可望成為早期診斷宮頸癌的檢測(cè)指標(biāo)之一，也可望成為判斷宮頸癌分化程度的一個(gè)參考指標(biāo)，也可望利用NOS抑制劑來(lái)治療宮頸癌。4、研究得出的結(jié)論NOS可望成為早期診斷宮頸癌的檢測(cè)指標(biāo)之555、國(guó)內(nèi)相關(guān)研究方面NOS與子宮肌瘤和絨毛膜癌的相關(guān)性研究國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道，僅為本課題研究?jī)?nèi)容。5、國(guó)內(nèi)相關(guān)研究方面NOS與子宮肌瘤和絨毛膜癌的相關(guān)性研究國(guó)56致謝：本課題是在各級(jí)領(lǐng)導(dǎo)的關(guān)心和支持下完成的。在課題鑒定之際，本組成員謹(jǐn)向所有的領(lǐng)導(dǎo)和同仁們表示衷心地感謝！致謝：本課題是在各級(jí)領(lǐng)導(dǎo)的關(guān)心和支持下完成的。在課題鑒定之際57歡迎各位專(zhuān)家光臨歡迎各位專(zhuān)家光臨58《一氧化氮合酶與婦科腫瘤關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究》課題鑒定

驗(yàn)收資料匯編二00五年十二月《一氧化氮合酶與婦科腫瘤關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究》課題鑒定

驗(yàn)收資料匯59目錄一、《一氧化氮合酶與婦科腫瘤關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究》課題摘要二、《一氧化氮合酶與婦科腫瘤關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究》課題工作報(bào)告三、《一氧化氮合酶與婦科腫瘤關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究》課題技術(shù)報(bào)告四、文獻(xiàn)綜述五、主要完成單位及完成人員六、科技查新報(bào)告七、已發(fā)表的論文八、附圖目錄一、《一氧化氮合酶與婦科腫瘤關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究》課60

課題摘要

一目的：檢測(cè)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）在絨毛膜癌、子宮肌瘤、子宮頸癌及卵巢癌組織中的表達(dá)情況，探討一氧化氮合酶在婦科腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。

課題摘要

一目的：61二方法選取臨床病理資料172例分為四組：其中子宮頸癌51例；絨毛膜癌24例；卵巢癌55例；子宮肌瘤42例，各組均采集其相對(duì)應(yīng)的正常組織標(biāo)本共計(jì)130例作為對(duì)照（子宮頸組織50例；絨毛組織22例；卵巢組織50例；子宮平滑肌組織8例），應(yīng)用免疫組化的方法，觀察eNOS、iNOS在四種婦科腫瘤組織中的表達(dá)。二方法選取臨床病理資料172例分為四組：其中子宮頸癌5162

三、結(jié)果

1、eNOS、iNOS蛋白在四種婦科腫瘤組織中均有不同程度的表達(dá)，均顯著高于其正常對(duì)照組織。2、eNOS、iNOS蛋白在子宮頸癌組織中的表達(dá)與宮頸癌的病理分級(jí)有關(guān)（P<0.05）,隨著宮頸癌分級(jí)的升高而呈上升趨勢(shì)。3、在子宮肌瘤中eNOS、iNOS蛋白相比，eNOS的表達(dá)顯著高于iNOS（P<0.05）。

三、結(jié)果

1、eNOS、iNOS蛋白在四種婦科腫瘤組織63四結(jié)論1、一氧化氮合酶蛋白的表達(dá)與四種婦科腫瘤組織有關(guān)，它們可能在四種婦科腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。2、NOS可望成為早期診斷子宮頸癌的檢測(cè)指標(biāo)之一，也可望利用NOS抑制劑來(lái)治療宮頸癌。把測(cè)定NOS作為判斷宮頸癌細(xì)胞分化程度的一個(gè)參考指標(biāo)。四結(jié)論1、一氧化氮合酶蛋白的表達(dá)與四種婦科腫瘤組織有關(guān)，64課題工作報(bào)告一氧化氮合酶與婦科腫瘤關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究課題工作報(bào)告一氧化氮合酶與婦科腫瘤關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究65一、課題研究的目的意義

腫瘤是危害人類(lèi)生命健康極大的特殊疾病，目前全世界每年死于癌癥的近1千萬(wàn)人，60％以上的患者在初次確診惡性腫瘤的時(shí)候就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移，因此，提出尋找腫瘤形成的原因成了世界所關(guān)心的課題。在女性生殖系統(tǒng)疾患中，婦科腫瘤的發(fā)生率占有一定的比例，嚴(yán)重威脅著廣大婦女的健康，其中子宮頸癌、絨毛膜癌、卵巢癌、子宮肌瘤是比較常見(jiàn)的婦科腫瘤。一、課題研究的目的意義腫瘤是危害人類(lèi)生命健康極大的特殊疾66

這些腫瘤由于確切病因不明，發(fā)病機(jī)理不清，因而，臨床治療效果還不十分理想。因此，探討腫瘤發(fā)生、發(fā)展的致瘤因素已具有十分重要的意義。近十多年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，使NO成為腫瘤病因?qū)W研究的熱點(diǎn)。一氧化氮合酶（nitricoxidesynthase,NOS）是催化一氧化氮（nitricoxide，NO）生物合成的酶，也是內(nèi)源性NO合成的關(guān)鍵酶。這些腫瘤由于確切病因不明，發(fā)病機(jī)理不清，因而，臨床治療效67已知NOS按調(diào)節(jié)方式分為結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶（cNOS）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）兩種類(lèi)型，其中cNOS又包括神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）兩種。cNOS為細(xì)胞本身所固有，在生理?xiàng)l件下受鈣離子—鈣調(diào)蛋白系統(tǒng)調(diào)節(jié)，合成少量NO，主要參與機(jī)體正常生理功能的維持，發(fā)揮調(diào)節(jié)血管口徑、通透性、傳遞細(xì)胞信息等生物學(xué)作用。已知NOS按調(diào)節(jié)方式分為結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶（cNOS）和誘導(dǎo)68iNOS則主要存在于誘導(dǎo)活化的巨噬細(xì)胞，非依賴(lài)于鈣離子—鈣調(diào)蛋白系統(tǒng)，在生理?xiàng)l件下iNOS不表達(dá)活性，在乏氧、炎癥（如細(xì)菌脂多糖LPS）、細(xì)胞因子（TNF、IL1、INF-a等）作用下iNOS誘導(dǎo)生成NO，NO產(chǎn)量大，具有重要的殺菌、抗病毒以及殺腫瘤細(xì)胞活性，參與了抗腫瘤免疫過(guò)程。iNOS則主要存在于誘導(dǎo)活化的巨噬細(xì)胞，非依賴(lài)于鈣離子—鈣調(diào)69NO可能促瘤生長(zhǎng)作用的原因有三點(diǎn)：1.低氧上調(diào)iNOS表達(dá)，NO在內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)有絲分裂，在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)和促進(jìn)腫瘤新生血管的形成。因此，NO促瘤生長(zhǎng)作用原因之一可能與血管形成因子有關(guān)。2.NO是強(qiáng)有力的血管舒張劑，NO促瘤生長(zhǎng)作用原因之二可能是NO及其產(chǎn)物引起腫瘤組織血流或血管通透性增加，血流的加快和血管通透性提高增加了腫瘤的養(yǎng)分和加快了代謝廢物的清除，從而加快了癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)。NO可能促瘤生長(zhǎng)作用的原因有三點(diǎn)：1.低氧上調(diào)iNOS表達(dá)，703.NO還可以通過(guò)抑制免疫系統(tǒng)和促進(jìn)局部組織的誘變性促進(jìn)局部腫瘤的生長(zhǎng)。因此，NO在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。本課題從蛋白水平上探討了NOS在四種婦科腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮的作用，為將來(lái)利用NOS抑制劑防治婦科腫瘤提供理論基礎(chǔ)，應(yīng)用基因療法徹底根治婦科腫瘤指明了方向。3.NO還可以通過(guò)抑制免疫系統(tǒng)和促進(jìn)局部組織的誘變性促進(jìn)局部71二、課題的內(nèi)容

本實(shí)驗(yàn)共分4組：（1）絨毛膜癌及對(duì)照組織46例；（2）子宮肌瘤及其對(duì)照組織50例；（3）子宮頸癌及其對(duì)照組織101例；（4）卵巢癌及其對(duì)照組織105例每一蠟塊連續(xù)切片3張，一張做HE染色，其余兩張分別用于eNOS、iNOS染色。免疫組織化學(xué)染色，采用常規(guī)的SP法。每次染色設(shè)置陽(yáng)性、陰性對(duì)照。仔細(xì)觀察每張切片中eNOS、iNOS蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)及分布情況，仔細(xì)觀察每張切片的病理特點(diǎn)，并且作好記錄。最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。二、課題的內(nèi)容本實(shí)驗(yàn)共分4組：（1）絨毛膜癌及對(duì)照組織4672三、技術(shù)路線及實(shí)施過(guò)程(一)標(biāo)本來(lái)源及篩選全部婦科腫瘤及對(duì)照組標(biāo)本均來(lái)源于甘肅省定西地區(qū)醫(yī)院1993年3月—2019年10月，經(jīng)手術(shù)切除并備有完整臨床資料的病理科存檔蠟塊，共計(jì)302塊。從中篩選出實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本172例，其正常對(duì)照組織總共130例。所有婦科惡性腫瘤患者術(shù)前未接受放療、化療或其它特殊治療，子宮肌瘤患者術(shù)前三個(gè)月未服用過(guò)激素。三、技術(shù)路線及實(shí)施過(guò)程(一)標(biāo)本來(lái)源及篩選73（二）臨床病理資料24例絨毛膜癌全部為妊娠性絨癌，臨床分期為Ⅰ期者9例，Ⅱ期者6例，Ⅲ期者6例，Ⅳ期者3例；42例子宮肌瘤中，病理組織類(lèi)型為肌壁間子宮肌瘤者28例，漿膜下者7例，粘膜下者7例；51例子宮頸癌中，病理分級(jí)為Ⅰ級(jí)者10例，Ⅱ級(jí)者16例，Ⅲ級(jí)者25例；臨床分期為Ⅰ期者18例，Ⅱ期者12例，Ⅲ期者9例，Ⅳ期者12例。55例卵巢惡性腫瘤中，組織類(lèi)型為漿液性乳頭狀囊腺癌者16例，粘液性乳頭狀囊腺癌者19例，卵巢轉(zhuǎn)移癌者14例，卵巢顆粒細(xì)胞癌者6例。（二）臨床病理資料24例絨毛膜癌全部為妊娠性絨癌，臨床分期為74（三）藥品與試劑1、兔抗人NOS2多克隆抗體：BosterBiotechnologyComLTD2、兔抗人NOS3多克隆抗體：BosterBiotechnologyComLTD3、DAB顯色試劑盒：福州邁新生物有限公司4、SP試劑盒：福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司（三）藥品與試劑1、兔抗人NOS2多克隆抗體：Boster75（四）主要儀器和設(shè)備1、光學(xué)顯微鏡及顯微照相系統(tǒng)：日本Olympus公司2、切片機(jī)：德國(guó)產(chǎn)AQ8203、臺(tái)式恒溫震蕩器（TH2-82A）：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠4、臺(tái)式高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠5、恒溫孵箱、濕盒、微波爐等（四）主要儀器和設(shè)備1、光學(xué)顯微鏡及顯微照相系統(tǒng)：日本Oly76（五）實(shí)驗(yàn)方法本實(shí)驗(yàn)共分4組：（1）絨毛膜癌及對(duì)照組織46例；（2）子宮肌瘤及其對(duì)照組織50例（3）子宮頸癌及其對(duì)照組織101例；（4）卵巢癌及其對(duì)照組織105例；每一蠟塊連續(xù)切片3張，一張做HE染色，其余兩張分別用于eNOS、iNOS染色，采用免疫化學(xué)染色法，即常規(guī)的SP法，仔細(xì)觀察每張切片的病理特點(diǎn)，并且作好記錄。每次染色設(shè)置陽(yáng)性、陰性對(duì)照。（五）實(shí)驗(yàn)方法本實(shí)驗(yàn)共分4組：（1）絨毛膜癌及對(duì)照組織46例77（六）結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)eNOS、iNOS蛋白染色的陽(yáng)性信號(hào)均為細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)均勻一致或細(xì)顆粒狀的棕黃色染色。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比及顯色強(qiáng)度分為4個(gè)等級(jí)：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)極少，無(wú)色者為陰性（一）；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<25%，呈淡黃色者為弱陽(yáng)性（+）；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為25%～50%，呈黃色者為中等陽(yáng)性（++）；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%，呈棕黃色者為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。（六）結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)eNOS、iNOS蛋白染色的陽(yáng)性信號(hào)均為細(xì)78（七）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：將結(jié)果進(jìn)行2×2或R×C聯(lián)表的x2檢驗(yàn)或者四格表確切概率法，P<0.05為差異有顯著性，統(tǒng)計(jì)應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件在微機(jī)上完成。（七）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：將結(jié)果進(jìn)行2×2或R×C聯(lián)表的x2檢驗(yàn)或者79

四、課題的進(jìn)度本課題共分五個(gè)階段：

（一）第一階段（2019.9～2019.10）：進(jìn)行文獻(xiàn)檢索、設(shè)計(jì)、制定研究課題，并閱讀國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，其中英文17篇，中文73篇，共計(jì)90篇。在此期間，撰寫(xiě)文獻(xiàn)綜述1篇，科研論文1篇。（二）第二階段（2019.11～2019.12）：收集、篩選、確定了子宮頸癌、絨毛膜癌、卵巢癌、子宮肌瘤手術(shù)后標(biāo)本172例及其對(duì)照組織130例，將這些標(biāo)本進(jìn)行登記制表。訂購(gòu)試劑，撰寫(xiě)技術(shù)項(xiàng)目申請(qǐng)報(bào)告，做預(yù)備實(shí)驗(yàn)及部分正式實(shí)驗(yàn)。。

四、課題的進(jìn)度本課題共分五個(gè)階段：

（一）第一階段（2080（三）第三階段（2019.1～2019.2）：繼續(xù)做正式實(shí)驗(yàn)。對(duì)所選四種婦科腫瘤組織及其對(duì)照組織進(jìn)行HE染色、eNOS、iNOS蛋白的免疫組化染色，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行仔細(xì)觀察，并對(duì)每一例標(biāo)本的染色結(jié)果做好詳細(xì)的記錄，制定統(tǒng)計(jì)圖表，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。（四）第四階段（2019.3～2019.4）：撰寫(xiě)項(xiàng)目技術(shù)資料初稿。（五）第五階段（2019.5～2019.9）：對(duì)初稿進(jìn)行兩次修改，審核定稿，打印技術(shù)項(xiàng)目申請(qǐng)報(bào)告。（三）第三階段（2019.1～2019.2）：繼續(xù)做正式實(shí)驗(yàn)81五、應(yīng)用前景及社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益分析本課題采用細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)—免疫組織化學(xué)（免疫組化）方法，從蛋白水平上探討與這四種婦科腫瘤致瘤因素相關(guān)的指標(biāo)—一氧化氮合酶，通過(guò)對(duì)一氧化氮合酶的兩種同工酶eNOS、iNOS進(jìn)行檢測(cè)，掌握它們?cè)谒姆N婦科腫瘤組織中的表達(dá)特點(diǎn)，進(jìn)一步為臨床防治這四種婦科腫瘤提供理論依據(jù)，也為將來(lái)應(yīng)用基因療法治療這四種婦科腫瘤指明方向，有潛在的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益，可望在不久的將來(lái)利用一氧化氮合酶的抑制劑治療這四種婦科腫瘤，為臨床新藥的開(kāi)辟提供方向，為婦科腫瘤患者的疾苦作出貢獻(xiàn)。五、應(yīng)用前景及社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益分析本課題采用細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)—82六、課題經(jīng)費(fèi)預(yù)算與用途（一）購(gòu)買(mǎi)試劑：免疫組化試劑10000元，一般試劑4000元。（二）復(fù)印及打印費(fèi)：2000元。（三）切片勞務(wù)費(fèi)：4000元。（五）技術(shù)項(xiàng)目評(píng)審費(fèi)：2000元。（六）其它：5000元。上述各項(xiàng)費(fèi)用共計(jì)27000元。六、課題經(jīng)費(fèi)預(yù)算與用途（一）購(gòu)買(mǎi)試劑：免疫組化試劑1000083七、課題承擔(dān)單位簡(jiǎn)況定西市人民醫(yī)院始建于一九五0年，經(jīng)過(guò)五十年的發(fā)展，已成為醫(yī)療、教學(xué)、科研、預(yù)防、急救為一體的綜合性醫(yī)院。近年來(lái)，醫(yī)院相繼引進(jìn)了美國(guó)GE—9800全身CT，德國(guó)西門(mén)子彩超等現(xiàn)代化醫(yī)療設(shè)備，擁有高中級(jí)專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員160多人，參與了一項(xiàng)國(guó)家“八五”攻關(guān)課題，部分項(xiàng)目已達(dá)到全省領(lǐng)先水平。七、課題承擔(dān)單位簡(jiǎn)況定西市人民醫(yī)院始建于一九五0年，經(jīng)過(guò)五十84課題組成員簡(jiǎn)況本課題技術(shù)指導(dǎo)王麗京教授，蘭州大學(xué)生命科學(xué)院博士，蘭州醫(yī)學(xué)院碩士研究生導(dǎo)師。項(xiàng)目負(fù)責(zé)人陳芳蘭同志系王麗京教授的碩士研究生，1989年從蘭州醫(yī)學(xué)院畢業(yè)，分配到定西市醫(yī)院工作，2019年取得碩士學(xué)位，已具備承擔(dān)科研項(xiàng)目的實(shí)力，于2019年12月晉升為婦產(chǎn)科副主任醫(yī)師。其余主要完成人員名單依次如下：郭碧蓮，1994畢業(yè)于蘭州醫(yī)學(xué)院，本科學(xué)歷，2019年10月晉升為婦產(chǎn)科主治醫(yī)師。李淑梅、孫風(fēng)副主任醫(yī)師，本科學(xué)歷。還有師金梅、孟萍等4名同志參與，都具有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)和扎實(shí)的理論基礎(chǔ)，以上同志均為婦產(chǎn)科的業(yè)務(wù)骨干。課題組成員簡(jiǎn)況本課題技術(shù)指導(dǎo)王麗京教授，蘭州大學(xué)生命科學(xué)院博85《一氧化氮合酶與婦科腫瘤

關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究》

課題技術(shù)報(bào)告《一氧化氮合酶與婦科腫瘤

關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究》

課題技術(shù)報(bào)告86

一氧化氮合酶是催化內(nèi)源性一氧化氮生物合成的關(guān)鍵酶。由于一氧化氮對(duì)腫瘤的影響具有致瘤及抗腫瘤的雙向作用，故人們對(duì)一氧化氮合酶、一氧化氮的研究方興未艾。近年來(lái)，有關(guān)NOS在體內(nèi)外腫瘤組織中表達(dá)的研究報(bào)道很多。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一些動(dòng)物腫瘤模型及人腫瘤系均有NOS表達(dá)，而且在人肝癌、腦腫瘤、肺鱗狀細(xì)胞癌、食管癌、、膀胱癌、乳腺及前列腺等的腫瘤中發(fā)現(xiàn)NOS活性增高。有關(guān)系統(tǒng)地研究NOS在四種婦科腫瘤組織中表達(dá)的研究報(bào)道卻未見(jiàn)到1、國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

一氧化氮合酶是催化內(nèi)源性一氧化氮生物合成的關(guān)鍵酶。由于871、

有人用分光光度計(jì)檢測(cè)了42例卵巢腫瘤中NOS活性，顯示卵巢惡性腫瘤的發(fā)生與NOS的活性有關(guān)，且NOS隨分化程度的降低而呈升高趨勢(shì)2、Sanyal等采用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)了絨癌細(xì)胞株（JEG—3）及正常位置胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞中NOS的表達(dá)，結(jié)果顯示eNOS、iNOS完全缺如，只有nNOS存在。其原因可能是Sanyal等研究的是體外培養(yǎng)的絨癌細(xì)胞株的緣故。國(guó)內(nèi)目前尚未發(fā)現(xiàn)一篇有關(guān)NOS與絨癌相關(guān)的研究報(bào)道；有關(guān)NOS與子宮肌瘤的研究報(bào)道亦未見(jiàn)到。1、

有人用分光光度計(jì)檢測(cè)了42例卵巢腫瘤中NOS活性，顯示882、關(guān)鍵技術(shù)2.1

HE切片形態(tài)學(xué)觀察：實(shí)驗(yàn)的每一蠟塊連續(xù)切片3張，一張做HE染色，其余兩張分別用于eNOS、iNOS染色。仔細(xì)觀察每張切片的病理特點(diǎn)，并且作好記錄。2.2免疫組織化學(xué)染色：每次染色設(shè)置陽(yáng)性，陰性對(duì)照。采用常規(guī)的SP法，具體方法如下:2、關(guān)鍵技術(shù)2.1HE切片形態(tài)學(xué)觀察：實(shí)驗(yàn)的每一蠟塊連續(xù)切89(1)切片650G烘烤72小時(shí)后浸入新鮮二甲苯15min×2(2)梯度酒精各5min至水(3)0.01mol/LPBS洗5min×3(4)3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶10min(5)PBS洗5min×3(6)加入復(fù)合消化液置370G恒溫箱15分鐘，以充分暴露組織中的抗原。(7)PBS洗5min×3。(1)切片650G烘烤72小時(shí)后浸入新鮮二甲苯15min×290(8)正常山羊血清封閉細(xì)胞中非特異性抗原，減少非特異性著色，室溫下孵育10分鐘，PBS洗一次即可。(9)加入第一抗體兔抗人NOS2、NOS3多克隆抗體，溫盒內(nèi)40G冰箱過(guò)夜(10)40G冰箱取出后，室溫下復(fù)溫1小時(shí)。(11)PBS洗5min×3(12)加生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫下孵育10分鐘。(13)PBS洗5min×3(8)正常山羊血清封閉細(xì)胞中非特異性抗原，減少非特異性著色，91(14)加入鏈霉素抗生物素蛋白—過(guò)氧化酶溶液，室溫下孵育10分鐘。(15)PBS洗5min×3(16)加入新鮮配制的3,3—二氨基苯二胺（DAB）底物溶液，室溫避光顯色30—40分鐘，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，流水沖洗終止反應(yīng)。(17)蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗，鹽酸酒精分化數(shù)秒。(18)自來(lái)水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。(14)加入鏈霉素抗生物素蛋白—過(guò)氧化酶溶液，室溫下孵育10922.3、對(duì)照觀察1、陰性對(duì)照：用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。2、陽(yáng)性對(duì)照片由武漢博士德公司提供的乳腺癌陽(yáng)性片。2.3、對(duì)照觀察1、陰性對(duì)照：用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。933、技術(shù)研究的內(nèi)容3、技術(shù)研究的內(nèi)容943.1一氧化氮合酶在絨毛膜癌及正常絨毛組織中的表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：絨毛膜癌組與對(duì)照組間eNOS蛋白陽(yáng)性表達(dá)率有顯著性差異（Χ2=5.122727，P<0.05）。

鏡下可見(jiàn)eNOS蛋白表達(dá)主要位于細(xì)胞漿，呈棕黃色。如下表1：組別 例數(shù)eNOS表達(dá)陽(yáng)性率-++++++ （%）

對(duì)照組221840018.18絨毛膜癌 241247150.00

3.1一氧化氮合酶在絨毛膜癌及正常絨毛組織中的表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)分95iNOS蛋白表達(dá)也位于細(xì)胞漿，只是染色強(qiáng)度較弱而已。陽(yáng)性情況見(jiàn)表2。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：絨毛膜癌組與對(duì)照組間iNOS蛋白陽(yáng)性表達(dá)率有顯著性差異（Χ2=5.517919，P<0.05）。表2組別例數(shù)iNOS表達(dá)陽(yáng)性率-++++++（%） 對(duì)照組22211004.55絨毛膜癌241590037.50 iNOS蛋白表達(dá)也位于細(xì)胞漿，只是染色強(qiáng)度較弱而已。陽(yáng)性情況963.2一氧化氮合酶在子宮肌瘤及正常平滑肌組織中的表達(dá)在子宮肌瘤組織中，eNOS陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞主要分布在肌瘤組織的中央，呈局灶性分布，其染色較強(qiáng)，呈棕黃色細(xì)顆粒狀。iNOS的分布特點(diǎn)基本類(lèi)似于eNOS，只是染色強(qiáng)度較弱。結(jié)果見(jiàn)表3表3組別 例數(shù)eNOS iNOS 陽(yáng)性數(shù) 陽(yáng)性率% 陽(yáng)性數(shù)陽(yáng)性率% 子宮肌瘤組 42 35 83.33 25 59.52 正常對(duì)照組 8 2 25.00 1 12.50 X2值 9.046 4.218 P值 <0.005 <0.05 3.2一氧化氮合酶在子宮肌瘤及正常平滑肌組織中的表達(dá)在子宮肌9735例eNOS陽(yáng)性表達(dá)的子宮肌瘤組織中，iNOS陽(yáng)性表達(dá)者為25例，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩者有顯著的相關(guān)性（P<0.05）見(jiàn)表4。表4eNOS iNOS 合計(jì) 陽(yáng)性 陰性 陽(yáng)性 25 10 35 陰性 1 6 7 35例eNOS陽(yáng)性表達(dá)的子宮肌瘤組織中，iNOS陽(yáng)性表達(dá)者為983.3一氧化氮合酶在宮頸癌及正常宮頸組織中的表達(dá)eNOS蛋白陽(yáng)性的細(xì)胞主要分布于癌巢組織中，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，免疫細(xì)胞無(wú)eNOS蛋白陽(yáng)性表達(dá)。iNOS陽(yáng)性的細(xì)胞分布基本與eNOS蛋白的一致，只是表達(dá)強(qiáng)度較弱而已，eNOS、iNOS在子宮頸癌組織的表達(dá)率明顯高于其正常對(duì)照組織（P均<0.01），見(jiàn)表5表5組別 例數(shù) eNOS表達(dá) iNOS表達(dá) -++++++陽(yáng)性率(%)-++++++陽(yáng)性率（%）宮頸癌組51 68112688.2310278680.39 對(duì)照組50 30155040.004073 020.00 3.3一氧化氮合酶在宮頸癌及正常宮頸組織中的表達(dá)eNOS蛋白99在不同病理分級(jí)中，經(jīng)RXC聯(lián)表的x2檢驗(yàn)，eNOS、iNOS各組間比較P均<0.05，且隨著病理分級(jí)的升高而呈上升趨勢(shì)；eNOS、iNOS在臨床分期的比較中無(wú)顯著性差異P均>0.05。具體結(jié)果見(jiàn)表6。表6類(lèi)型 例數(shù)eNOS表達(dá)強(qiáng)度 iNOS表達(dá)強(qiáng)度 - ++++++ -++++++病理分級(jí) G1~G22663512 9 1043 G32505614 1 1743 臨床分期 Ⅰ期~Ⅱ期304 58136 1554 Ⅲ期~Ⅳ期212 3313 4 1232 在不同病理分級(jí)中，經(jīng)RXC聯(lián)表的x2檢驗(yàn)，eNOS、iNOS1003.4一氧化氮合酶在卵巢癌組織及正常卵巢組織中的表達(dá)檢測(cè)顯示：eNOS、iNOS蛋白表達(dá)在卵巢癌組織中均明顯高于正常對(duì)照組織（P均<0.01），兩者相比有極顯著性差異。而eNOS、iNOS在卵巢癌不同組織類(lèi)型的陽(yáng)性表達(dá)率相互比較無(wú)顯著性差異P>0.05。結(jié)果見(jiàn)表7表7類(lèi)別 例數(shù) *eNOS **iNOS 陽(yáng)性率(%) 陽(yáng)性率(%) 對(duì)照組 50 5（10.00）0（0） 卵巢癌組 55 40（72.73） 25(45.46) 組織類(lèi)型 漿液性乳頭狀囊腺癌16 13(81.25) 9(56.25) 粘液性乳頭狀囊腺癌19 11(57.89) 6(31.58) 卵巢轉(zhuǎn)移癌 14 10(71.43)6(42.86) 卵巢顆粒細(xì)胞癌 6 6(100.00) 4(66.67) 3.4一氧化氮合酶在卵巢癌組織及正常卵巢組織中的表達(dá)檢測(cè)顯示101技術(shù)研究結(jié)論技術(shù)研究結(jié)論1024.1絨毛膜癌組研究結(jié)論eNOS、iNOS蛋白的高表達(dá)與絨毛膜癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，它們可能