光學(xué)顯微鏡的使用及革蘭氏染色

光學(xué)顯微鏡的使用及革蘭氏染色必需使用它。因此我們應(yīng)了解顯微鏡的構(gòu)造和原理，以到達(dá)正確使用和保養(yǎng)的目的。除暗視野顯微鏡和相差顯微鏡可用于觀看活的細(xì)菌細(xì)胞外，其他一般光學(xué)顯微鏡大都法也是微生物工作者應(yīng)把握的根本技術(shù)。1【目的】了解一般光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造和原理。正確把握使用顯微鏡的方法?！靖攀觥课⑸镌囼?yàn)爭(zhēng)辯的根本技能?！疽话愎鈱W(xué)顯微鏡的根本構(gòu)造】一般光學(xué)顯微鏡由兩大局部組成，即機(jī)械局部和光學(xué)局部。機(jī)械局部包括鏡座、鏡臂、載物臺(tái)及臺(tái)上的標(biāo)本推動(dòng)器、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換盤(pán)、升降調(diào)整器等，其主要作用是支撐、固定鏡頭、調(diào)整物象焦距、擱置和移動(dòng)標(biāo)本。光學(xué)系統(tǒng)包括反光鏡〔或電光源、光圈、聚光器、在裸眼時(shí)不能觀看的細(xì)節(jié)。物鏡一般有4×、10×、40×、100×〔或90×〕等幾種。100×的是油鏡，是微生物試驗(yàn)最常用的物鏡。由于目鏡多為10×，所以使用油鏡觀看標(biāo)本時(shí)，10001μm1mm機(jī)械裝置鏡臂與鏡座之間有一傾斜關(guān)節(jié)，可使顯微鏡傾斜確定的角度便于觀看。160mm。有些顯微鏡的鏡筒長(zhǎng)度是可調(diào)整的。轉(zhuǎn)換器：它是一個(gè)用于安裝物鏡的圓盤(pán)，其上可裝3-4按低倍到高倍的挨次安裝。轉(zhuǎn)換物鏡時(shí)，必需用手按住圓盤(pán)旋轉(zhuǎn)，勿用手指直接推動(dòng)物鏡，以免使物鏡和轉(zhuǎn)換器間的螺旋松脫而損壞顯微鏡。標(biāo)本前后、左右移動(dòng)，有些移動(dòng)器上還裝有刻度標(biāo)尺，可標(biāo)定標(biāo)本的位置，便于重復(fù)觀看。調(diào)焦裝置：調(diào)焦裝置即安裝在鏡筒前方兩側(cè)的粗螺旋和細(xì)螺旋，用于調(diào)整物鏡和標(biāo)本間的距離，使物像更清楚。粗螺旋轉(zhuǎn)一圈可使鏡筒升降約10mm，細(xì)螺旋旋轉(zhuǎn)一圈可使鏡0.1mm光學(xué)系統(tǒng)目鏡物鏡轉(zhuǎn)換器物鏡標(biāo)本推動(dòng)器載物臺(tái)光圈集光器反光鏡

鏡臂粗調(diào)整輪細(xì)調(diào)整輪標(biāo)本推動(dòng)器旋鈕鏡座一般光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造目鏡：目鏡的功能是把物鏡放大的物像再次放大。目鏡由兩片透鏡組成，上面一塊為接目透鏡，下面一塊為聚透鏡，兩片透鏡之間有一光闌。光闌的大小打算了視野的大小，5x、10x、15x可互換位用。(10x(20x(40-65x)和油鏡(90x以上)等不同的放大倍數(shù)。油鏡簡(jiǎn)上刻有“OI”或“HI”字樣，也有刻一圈紅線(xiàn)或黑線(xiàn)為標(biāo)記的，借以區(qū)分于其他物鏡。物鏡上標(biāo)有放大倍數(shù)、數(shù)值孔徑(numericalaperture,簡(jiǎn)寫(xiě)為NA)、工作距離(物鏡下端至蓋玻片間的距離，mm)及要求蓋玻片的厚度等主要參數(shù)。數(shù)值孔徑系指介質(zhì)的折射率與鏡口角1／2正弦的乘積，可用NA=nsinα/2表示。式中，nα為鏡口角(通過(guò)標(biāo)本的光線(xiàn)延長(zhǎng)到物鏡前鏡邊緣所形成的夾角。顯微鏡的優(yōu)劣主要取決于物鏡區(qū)分力的大小間最小距離(D)的力氣。DDD=0.61/NA要提高物鏡的區(qū)分力有兩條途徑400—770ｎｍ)。②增大物鏡的數(shù)值孔徑。其影響因素之一是鏡口角α，當(dāng)sinα增大到最大時(shí)，α值＝90°，就是說(shuō)進(jìn)入透鏡的光線(xiàn)與光軸成90°角，這是不行能的，所以sinα/2的最大值總是小1α60介1.3玻璃的折射率為1.5。因此，通常在物鏡和標(biāo)本之間參與香柏油作介質(zhì)就可使數(shù)值孔徑值增大到1.2—1.4l1.25的油鏡來(lái)觀看標(biāo)本時(shí)，就能區(qū)分出距離不小于0.2μm0.5μm左右，故在油鏡下能看清其細(xì)胞形態(tài)及某些構(gòu)造。顯微鏡的總放大率是指物鏡放大率和目鏡放大率的乘積。但由于物鏡和目鏡搭配的不同，其區(qū)分力也不同，例如，在總放大率一樣的狀況下，承受數(shù)值孔徑大的40倍物鏡和10倍目鏡相搭配其區(qū)分力就比數(shù)值孔徑小的2090好。聚光器：聚光器起會(huì)聚光線(xiàn)的作用，可上下移動(dòng)在其邊框上刻有數(shù)值孔徑值。當(dāng)用低倍物鏡時(shí)聚光器應(yīng)下降而當(dāng)用油鏡時(shí)則聚光器應(yīng)升到最高位置變光闌(光圈)，它是由十幾張金屬薄片組成可放大或縮小用以調(diào)整光強(qiáng)度和數(shù)值孔徑的大小。在觀看較透亮的標(biāo)本時(shí)，光圈宜縮小一些，這時(shí)區(qū)分力雖降低，但反差增加，從而使透亮的標(biāo)本看得更清楚。但不宜將光圈關(guān)得太小，以免由于光干預(yù)現(xiàn)象而導(dǎo)致成像模糊。反光鏡：反光鏡安裝在聚光器下方的鏡座上，它是一個(gè)有平、凹兩個(gè)面的雙面鏡，較強(qiáng)及用聚光器時(shí)一般可用平面鏡。【材料和器皿】標(biāo)本金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)及大腸桿菌(Escheri-chiacoli)的染色涂片，釀酒酵母(Saccharomycescerevisias)的水封片。儀器：顯微鏡(有油鏡)。其他：香柏油，二甲苯，擦鏡紙等?！痉椒ê筒襟E】用低倍鏡觀看酵母菌調(diào)整光源，將低倍物鏡轉(zhuǎn)到工作位置。上升聚光器，可變光闌完全翻開(kāi)，然后轉(zhuǎn)動(dòng)用一般日光燈或臺(tái)燈照明。弱光的強(qiáng)度同時(shí)又可吸取掉紅光，使視野光線(xiàn)嚴(yán)峻，并可保護(hù)眼睛。旋轉(zhuǎn)反光鏡射到反光鏡中心，并調(diào)整聚光器或調(diào)整光圈大小，使視野得到均勻的照明。調(diào)整聚光器和物鏡數(shù)值孔徑相全都：取下目鏡直接向鏡筒內(nèi)觀看先將可變光闌縮到目的是使入射光所開(kāi)放的角度與鏡口角的角度相符合物鏡的數(shù)值孔徑不同，所以每轉(zhuǎn)換一次物鏡都要進(jìn)展調(diào)整。在實(shí)際操作中觀看者往往只依據(jù)視野的亮度和標(biāo)本明暗比照度來(lái)調(diào)整光圈大小慮聚光器與物鏡數(shù)值孔徑的協(xié)作。只要能到達(dá)較好的效果，這種調(diào)整法也是可取的。但是，如。放置標(biāo)本：上升鏡筒將釀酒酵母水封片放在鏡臺(tái)上，用玻片夾夾住然后降下低倍物鏡，使其下端接近于玻片。調(diào)焦：轉(zhuǎn)動(dòng)粗螺旋，使鏡筒漸漸上升到觀看模糊物像時(shí)，再轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)螺旋，調(diào)整到物像清楚時(shí)為止。觀看觀看并繪制酵母菌形態(tài)。如要精細(xì)觀看可轉(zhuǎn)換高倍鏡。2．高倍鏡觀看將在低倍鏡下找到的適宜部位移至視野當(dāng)中。轉(zhuǎn)換高倍鏡：用手按住轉(zhuǎn)換器漸漸地旋轉(zhuǎn)，當(dāng)聽(tīng)到“喀嚓”一聲即說(shuō)明物鏡已轉(zhuǎn)到正確的工作位置上。倍鏡轉(zhuǎn)到高倍鏡再稍調(diào)一下細(xì)螺旋就可看清物像。如用不齊焦的物鏡時(shí)，每轉(zhuǎn)換筒并細(xì)心調(diào)整粗、細(xì)螺旋，直至物像清楚為止。觀看：認(rèn)真地觀看酵母菌的構(gòu)造。3．用油鏡觀看細(xì)菌放置標(biāo)本：將染色的細(xì)菌涂片置于鏡臺(tái)上。找適宜的視野：先用低倍鏡查找

透鏡香柏油玻片

油鏡原理示意圖適宜的視野，并將欲觀看的部位穆到視野中心。轉(zhuǎn)換油鏡：將油鏡轉(zhuǎn)到工作位置。調(diào)整聚光器與油鏡數(shù)值孔徑相全都：只要將聚光器上升到最高位置，可變光光闌開(kāi)到最大，此時(shí)兩者的數(shù)值孔徑即到達(dá)全都。加香柏油：從雙層瓶的內(nèi)層小管中取香柏油1—2滴加到欲觀看部位的涂片上(切勿加多)，然后將油鏡轉(zhuǎn)到工作位置，下降鏡頭使油鏡浸入香柏油中，并從側(cè)面觀看使鏡頭降至既格外接近玻片，又不能與玻片相撞的適宜位置。此狀況，應(yīng)重操作。觀看：認(rèn)真觀看細(xì)菌形態(tài)并將結(jié)果填入表中。4．顯微鏡用畢后的處理上升鏡筒取下玻片清潔顯微鏡：①清潔油鏡，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，再用沾少許二甲苯的擦鏡紙擦掉殘留的香柏油最終再用干凈的擦鏡紙抹去殘留的二甲苯；②清潔目鏡和其他物鏡，用擦鏡紙擦凈其他的物鏡和目鏡；⑨用松軟的綢布螺凈機(jī)械局部的灰塵。清潔后應(yīng)將物鏡轉(zhuǎn)成“八”字式，緩慢下降鏡筒，使物鏡擱在鏡臺(tái)上。將聚光器降到最低位置。反光鏡轉(zhuǎn)成垂直狀。2—3輕輕壓在涂片上，吸掉二甲苯和香柏油以免損壞涂片?！居涗浗Y(jié)果】將觀看到的結(jié)果記錄于下表中低低倍高倍油鏡放大倍數(shù) 放大倍數(shù) 放大倍數(shù) 釀酒酵母大腸桿菌金黃色葡萄球菌【留意事項(xiàng)】顯微鏡使用時(shí)應(yīng)留神疼惜，不得任憑拆卸，搬動(dòng)顯微鏡時(shí)應(yīng)用右手握住鏡臂，左手托住底座，使鏡身保持直立，并緊靠身體。切忌單手拎提。載物臺(tái)要放平，以防滴加的香柏油流出玻片，各個(gè)鏡面切忌用手涂抹，以免手上的油、汗污損鏡面，造成日后發(fā)霉。用二甲苯接鏡頭時(shí)用量要少，不宜久抹，以防溶解膠粘透鏡的樹(shù)脂。切勿用乙醇擦鏡頭和支架。因油鏡的工作距離甚短，故操作時(shí)要特別慎重切忌承受眼睛對(duì)著目鏡邊觀看邊下降鏡筒的錯(cuò)誤操作。調(diào)整粗調(diào)整器時(shí)，動(dòng)作要輕，側(cè)面觀看鏡頭和玻片的距離，留意使鏡頭與玻片不相碰。用擦鏡紙擦拭油鏡頭時(shí)，留意手法輕柔，并按同一方向拖拭，防止旋轉(zhuǎn)擦拭，以免損傷貴重的油鏡光學(xué)系統(tǒng)?！舅伎碱}】要使視野光明，除光源外，還可實(shí)行哪些措施？使用油鏡應(yīng)留意哪些問(wèn)題?試列表比較油鏡、高倍鏡和低倍境在數(shù)值孔徑、工作距離及物鏡鏡頭的大小等方面的差異。試述影響區(qū)分力的三因素。如何調(diào)整？2細(xì)菌的涂片及簡(jiǎn)潔染色法【目的】把握細(xì)菌的涂片和簡(jiǎn)潔染色技術(shù)。【概述】低，當(dāng)它生長(zhǎng)子中性、堿性或弱酸性的溶液中時(shí)常帶負(fù)電荷，所以通常承受堿性染料(如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅或孔雀綠等)使其著色。酸性染料的離子帶負(fù)電荷，能與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合當(dāng)細(xì)菌分解糖類(lèi)產(chǎn)酸使培育基pH下降時(shí)，細(xì)菌所帶正電荷增加因此易被伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結(jié)合物又稱(chēng)復(fù)合染料，如伊紅美藍(lán)、伊持細(xì)胞原有形態(tài)，防止細(xì)胞膨脹或收縮?！静牧虾推髅蟆烤N：大腸桿菌，金黃色葡萄球菌。儀器：顯微鏡。染料：草酸銨結(jié)品紫或石炭復(fù)紅。材料：載玻片，擦鏡紙，二甲苯，香柏油和玻片擱架等?！痉椒ê筒襟E】l—2滴水)，用無(wú)菌的接種環(huán)挑取少量菌體與水滴充分混勻，涂成極薄的菌膜。涂布面積約12。3手為宜)。待玻片冷卻后，再加染料。1—2min。水洗：傾去染色液，用洗瓶中的自來(lái)水，自玻片一端輕輕沖洗至流下的水中無(wú)染色液的顏色時(shí)為止。5。枯燥：自然枯燥或用吸水紙蓋在涂片部位以吸取水分(留意勿擦去菌體)。6．鏡檢：用油鏡觀看并繪細(xì)菌形態(tài)圖于記錄表中。染色過(guò)程示意圖染色過(guò)程示意圖7．清理：試驗(yàn)完畢，要求清潔顯微鏡。有菌的玻片用洗衣粉水煮沸后，清洗干凈?！窘Y(jié)果記錄】將細(xì)菌簡(jiǎn)潔染色和形態(tài)觀看的結(jié)果記錄于下表中菌名染色液名稱(chēng)菌體顏色菌體形態(tài)〔畫(huà)圖〕大腸桿菌金黃色葡萄球菌【留意事項(xiàng)】玻片要干凈無(wú)油，否則菌濃涂不開(kāi)。挑菌量宜少，涂片宜薄，過(guò)厚則不易觀看?！舅伎碱}】涂片為什么要固定?固定時(shí)應(yīng)留意什么問(wèn)題？你在涂片染色過(guò)程中曾遇到什么問(wèn)題？試分析其中緣由。3革蘭氏染色法【目的】了解革蘭氏染色的原理，并把握革蘭氏染色方法。生疏革蘭染色法在鑒定細(xì)菌上的重要意義?！靖攀觥考?xì)菌染色法是細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查的一項(xiàng)根本技術(shù)。由于細(xì)菌個(gè)體微小，無(wú)色半透亮，在一般光學(xué)顯微鏡下不易清楚觀看染料有帶陰離子著色基團(tuán)的酸性染料和帶陽(yáng)離子著色基團(tuán)的堿性染料。在一般生理?xiàng)l件下pH7.4左右胺染料，如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等，它們較易與細(xì)菌菌體結(jié)合。革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。革蘭氏染色法可將全部的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-色)者為革蘭氏陽(yáng)性菌，如被脫色后又染上復(fù)染劑的顏色(紅色)者為革蘭氏陰性菌。該染色法之所以能將細(xì)菌區(qū)分為G+菌和G-菌，是由于這兩類(lèi)菌的細(xì)胞壁構(gòu)造和成分的不同所打算的。G醇或丙酮脫色時(shí)溶解了類(lèi)脂質(zhì)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)沙黃復(fù)染后就染成紅色。G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層較厚且交聯(lián)度高，類(lèi)染時(shí)的顏色。革蘭染色的原理目前存在三種假說(shuō)。通透性學(xué)說(shuō)革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁構(gòu)造較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量少，乙醇不易透入；革蘭陰性菌細(xì)胞壁構(gòu)造疏松，肽聚糖層薄，含大量脂質(zhì)，乙醇易滲入。等電點(diǎn)學(xué)說(shuō)革蘭陽(yáng)性菌等電點(diǎn)〔pI2~3〕比革蘭陰性菌〔pI4~5〕低，在一樣pH易脫色。化學(xué)學(xué)說(shuō)革蘭陽(yáng)性菌菌體含大量核糖核酸鎂鹽，可與碘、結(jié)晶紫結(jié)實(shí)結(jié)合，使已著色的細(xì)菌不被乙醇脫色；革蘭陰性菌菌體含核糖核酸鎂鹽很少，故易被脫色。革蘭〔Gram〕染色法是細(xì)菌學(xué)中最常用的一種鑒別染色法。用本法不僅可以觀看細(xì)菌被酒精脫色仍保存紫色者為革蘭陽(yáng)性菌G+菌〔G－菌供給了依據(jù)。殺死細(xì)菌，且保持原有形態(tài)，并使細(xì)菌粘附在載玻片上，不致染色時(shí)脫落?！静牧虾推髅蟆烤N：大腸桿菌斜面菌種一支，金黃色葡萄球菌斜面菌種一支。儀器：顯微鏡。染色液：草酸銨結(jié)晶紫染色液，魯格(Lugol)碘液，95%乙醇，0．5％沙黃染色液。材料：載玻片，香柏油，二甲苯，擦鏡紙，毛邊紙，染色缸等。【方法和步驟】涂片常規(guī)涂片法：挑l環(huán)水于載玻片上，再用接種環(huán)挑取少量的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌與玻片上的水滴混合均勻。并涂成薄的菌膜(留意挑取金黃色葡萄球菌的量應(yīng)少于大腸桿菌)?！叭齾^(qū)”涂片洗在玻片的左、右端各加l滴水，用無(wú)菌接種環(huán)挑少量金黃色葡萄球菌無(wú)菌的接種環(huán)挑少量大腸桿菌與右邊水滴充分混合成僅有大腸桿菌的區(qū)域菌液延長(zhǎng)至玻片中心，與金黃色葡萄球菌相混合成含有兩種菌的混合區(qū).固定涂片在空氣中枯燥。手執(zhí)玻片一端，有菌膜的一面朝上玻片在微火上通過(guò)3次(用手指觸涂片反面，以不燙手為宜)。待冷卻后，再加染料。染色初染：將玻片置于玻片擱架上，加草酸銨結(jié)晶紫染色液(加量以蓋滿(mǎn)菌膜為度)，染1—2min。傾去染色液，用自來(lái)水留神地沖洗。媒染：滴加魯格碘液，染l2min，水洗。脫色：滴加952—3次，馬上水洗，以終止脫色。復(fù)染：滴加沙黃液，染色2—3min,水洗。最終用吸水紙輕輕吸干。鏡檢用油鏡觀看，將結(jié)果記錄于表中。試驗(yàn)完畢后處理1.1清洗染色破扇用洗衣粉水煮沸、清洗、晾干后備用?！窘Y(jié)果記錄】菌名菌體顏色菌名菌體顏色菌體形態(tài)G+G-大腸桿菌金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌【留意事項(xiàng)】標(biāo)本片不能涂的太薄或太厚，以免影響結(jié)果觀看。革蘭染色成敗的關(guān)鍵在于脫色時(shí)間。如脫色過(guò)度，革蘭陽(yáng)性菌也可被脫色而被誤認(rèn)受涂片厚薄、脫色時(shí)玻片晃動(dòng)的快慢及乙醇用量多少等因素影響，難以嚴(yán)格規(guī)定。染色過(guò)程中勿使染色液枯槁。用水沖洗應(yīng)甩去玻片上的殘留以免染色液被稀釋而影響染色效果。選用培育18-24h性菌轉(zhuǎn)呈陰性反響?！舅伎碱}】革蘭氏染色中哪一步是關(guān)鍵?為什么?你如何把握這一步?不經(jīng)復(fù)染這一步，能否區(qū)分革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌?固定的目的之一是殺死菌體，這與用自然死亡的菌體進(jìn)展染色有何不同？【附錄】革蘭染色液配制：結(jié)晶