細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)原理及應(yīng)用

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)原理及應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)原理及應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)原理及應(yīng)用xxx公司細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)原理及應(yīng)用文件編號(hào)：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準(zhǔn)審核制定方案設(shè)計(jì)，管理制度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)原理及應(yīng)用研究進(jìn)展姓名：趙鵬學(xué)號(hào)：8專業(yè)：流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)摘要：細(xì)胞培養(yǎng)是指將采集體內(nèi)組織的細(xì)胞模擬體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境，放置在無(wú)菌、一定營(yíng)養(yǎng)條件、適宜的溫度及酸堿度下，使其生長(zhǎng)、繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種技術(shù)，已成為生物、醫(yī)學(xué)研究及應(yīng)用廣泛采用的技術(shù)方法。文章對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用作一綜述。關(guān)鍵詞：細(xì)胞培養(yǎng)；應(yīng)用；研究進(jìn)展細(xì)胞是構(gòu)成機(jī)體的基本單位，是生命活動(dòng)的基本單位。一切有機(jī)體（除病毒）都是由細(xì)胞組成的。細(xì)胞具有獨(dú)立的、有序的自控代謝體系。因此，對(duì)細(xì)胞的深入研究是揭開(kāi)生命奧秘、征服疾病的關(guān)鍵。細(xì)胞培養(yǎng)是指將采集體內(nèi)組織的細(xì)胞模擬體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境，放置在無(wú)菌、一定營(yíng)養(yǎng)條件、適宜的溫度及酸堿度下，使其生長(zhǎng)、繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可以直接觀察活細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生命活動(dòng)及其變化；提供大量生物性狀相似的試驗(yàn)對(duì)象，特別是研究大型動(dòng)物（奶牛）時(shí)具有耗資少的優(yōu)點(diǎn)。但模擬體內(nèi)環(huán)境仍與實(shí)際有很大的差異，因此利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的試驗(yàn)結(jié)果不可以輕易做出與體內(nèi)等同的結(jié)論。動(dòng)物組織（細(xì)胞）培養(yǎng)開(kāi)始于20世紀(jì)初，現(xiàn)已成為生物、醫(yī)學(xué)研究及應(yīng)用廣泛采用的技術(shù)方法[1]。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展，現(xiàn)在也廣泛應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)研究。20世紀(jì)60年代，該技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物的病毒分離和純化，對(duì)于魚類疾病的防治具有重要作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)單一種子細(xì)胞難以完成構(gòu)建復(fù)雜組織的需要，因此產(chǎn)生了聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù)。聯(lián)合培養(yǎng)下的細(xì)胞之間存在著精細(xì)的相互調(diào)控關(guān)系，因而更符合仿生學(xué)的原理且更有利于種子細(xì)胞的增殖與分化，為復(fù)雜的細(xì)胞誘導(dǎo)分化以及體外組織構(gòu)建提供了新思路、新方法[2]。1細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)是將活體組織或細(xì)胞從試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)取出，放在模擬體內(nèi)生存環(huán)境的體外環(huán)境（無(wú)菌、適溫、營(yíng)養(yǎng)豐富）中，使高體細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育的一種方法。按照培養(yǎng)的結(jié)構(gòu)成分不同，將其分為組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)及器官培養(yǎng)等。根據(jù)細(xì)胞是否在支持物上生長(zhǎng)，將其分為貼壁型和懸浮型。一般來(lái)說(shuō)，圓形細(xì)胞如淋巴細(xì)胞屬于懸浮型，而胞體梭型（成纖維型細(xì)胞）、扁平不規(guī)則（上皮型細(xì)胞）等屬于貼壁型，貼壁型細(xì)胞必需貼附在支持物表面生長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)開(kāi)始于1906年，Harrison用蛙新鮮淋巴液培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織4周，首次成功地利用體外培養(yǎng)液培養(yǎng)神經(jīng)元，標(biāo)志著組織細(xì)胞的體外培養(yǎng)模式的基本建立。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，20世紀(jì)50年代進(jìn)入繁盛階段，細(xì)胞培養(yǎng)逐漸被基礎(chǔ)研究與應(yīng)用領(lǐng)域所應(yīng)用，特別是在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到迅速的發(fā)展。目前，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)涉及到生物學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域[3]。目前，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，只能根據(jù)離體細(xì)胞的特點(diǎn)和培養(yǎng)條件，提供滿足其生長(zhǎng)和發(fā)育的一些基本生理?xiàng)l件。必須在無(wú)菌條件下進(jìn)行，細(xì)胞感染微生物后，會(huì)因被奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢或停滯，甚至死亡。需要提供適宜的溫度和pH，一般哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的溫度控制在37℃，魚類的溫度要低一些。溫度過(guò)高或過(guò)低時(shí)，均不利于細(xì)胞生長(zhǎng)甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞死亡。動(dòng)物細(xì)胞最適宜pH一般控制在~，在此范圍細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，增殖速度快，如果過(guò)低或過(guò)高性，細(xì)胞會(huì)因?yàn)榧?xì)胞膜受損而死亡。細(xì)胞離體培養(yǎng)技術(shù)的關(guān)鍵是細(xì)胞培養(yǎng)液的設(shè)計(jì)，理想的細(xì)胞培養(yǎng)液可以同時(shí)解決細(xì)胞離體培養(yǎng)所需要的pH、滲透壓、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)節(jié)物質(zhì)的全部需要。細(xì)胞培養(yǎng)液中需含有細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)所需要的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。如提供能量的物質(zhì)（N源、C源）、代謝調(diào)節(jié)控制的物質(zhì)（無(wú)機(jī)鹽、維生素、激素）。另外，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中需要提供一定量的氣體（O2和CO2）。CO2具有調(diào)節(jié)pH和緩沖的作用，一般提供5%CO2。2細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用研究在病毒學(xué)中的應(yīng)用培養(yǎng)細(xì)胞為病毒的增殖提供了場(chǎng)所，細(xì)胞是分離病毒的基質(zhì)，體外培養(yǎng)細(xì)胞無(wú)抗體及非特異頡頏物質(zhì)的影響，而且對(duì)病毒的敏感性較體內(nèi)細(xì)胞高，可采用離心感染法或提取病毒核酸進(jìn)行感染，并以細(xì)胞打孔器協(xié)助感染擴(kuò)大病毒感染的宿主范圍，使病毒感染指標(biāo)容易觀察，光學(xué)顯微鏡下就可見(jiàn)到包涵體、細(xì)胞融合等現(xiàn)象，同時(shí)也便于用分子病毒學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。乙肝病毒（BV）的感染可引發(fā)急、慢性病毒性肝炎，還與肝硬化、肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系。肝源細(xì)胞模型對(duì)研究BV生物學(xué)特性、BV的致病機(jī)制、BV基因組的復(fù)制、表達(dá)和調(diào)控、體外抗病毒藥物的篩選發(fā)揮了重要作用，大大促進(jìn)了對(duì)BV的研究[4]。通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，可了解豬輪狀病毒的培養(yǎng)特性，建立其分離方法以及FQ-PCR檢測(cè)方法，為研發(fā)診斷試劑盒和疫苗奠定基礎(chǔ)。使用細(xì)胞培養(yǎng)研究魚類病毒可以減少隱性感染機(jī)率和個(gè)體差異引起的誤差，使試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確迅速，可建立細(xì)胞株（系）分離和鑒定魚類病毒，進(jìn)行生物學(xué)、病理學(xué)和流行病學(xué)研究，具有非常重要的意義[5-6]。在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用腫瘤是機(jī)體在致癌因子的作用下，組織中的細(xì)胞失去對(duì)其生長(zhǎng)的正常調(diào)控，導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成的新生物。目前對(duì)于各種癌癥還沒(méi)有有效的藥物來(lái)治療，腫瘤研究的首要任務(wù)是明確致癌機(jī)制。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)使研究人員能夠清楚地認(rèn)識(shí)正常細(xì)胞、癌前病變細(xì)胞、生命有限的腫瘤細(xì)胞以及完全轉(zhuǎn)化或永生化的腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征，這些逐級(jí)進(jìn)化的細(xì)胞是體外研究多階段致癌機(jī)制的基礎(chǔ)。體外血管模型主要研究血管的生理和病理以及藥物的作用，根據(jù)培養(yǎng)方式不同可以分為二維和三維血管[7-8]。徐燕等利用人卵巢癌（ODMCs）微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)用抗CD31的免疫磁珠與內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合的原理，分離獲得了高純度可傳代并具有體外二維管腔樣結(jié)構(gòu)形成特性的ODMCs，建立起簡(jiǎn)便快速的卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，為后續(xù)研究卵巢癌抗血管生成提供了良好的試驗(yàn)材料[9]。馬曉雯等建立一種有效培養(yǎng)人肺腺癌A549Sphere細(xì)胞的方法，并在A549Sphere細(xì)胞中初步證明了人肺腺癌中可能存在腫瘤干細(xì)胞，這些Sphere細(xì)胞可富集干細(xì)胞樣細(xì)胞，抗化療藥物的能力也增強(qiáng)。不僅為分離A549細(xì)胞中的腫瘤干細(xì)胞提供一種可能的有效途徑，也為理解臨床肺腺癌治療的耐藥性提供了新思路[10]。在藥理學(xué)中的應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)在藥理學(xué)中的應(yīng)用比較廣泛。通過(guò)培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線可計(jì)數(shù)細(xì)胞增長(zhǎng)的絕對(duì)指數(shù)，從而可以直觀地了解細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡的動(dòng)態(tài)變化，一般用于檢測(cè)各種藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。利用培養(yǎng)細(xì)胞的放射自顯技術(shù)，研究細(xì)胞的物質(zhì)代謝、動(dòng)態(tài)變化和細(xì)胞周期等，對(duì)于藥物作用機(jī)制的研究有重要作用。細(xì)胞培養(yǎng)可用于抗動(dòng)脈粥樣硬化、血糖等藥物的研究等應(yīng)用。目前，體外培養(yǎng)活的心肌細(xì)胞已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥理學(xué)方面的研究。此方法通過(guò)對(duì)心肌細(xì)胞的培養(yǎng)，可以觀察各種藥物對(duì)其直接作用和對(duì)活細(xì)胞影響的動(dòng)態(tài)過(guò)程，深入研究藥物對(duì)心肌細(xì)胞的離子轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，建立各種心肌細(xì)胞損傷模型，利于探討藥物的作用機(jī)制。此外，還具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快捷、節(jié)約動(dòng)物和藥品等特點(diǎn)，可大幅提高研究效率。陽(yáng)海鷹等利用試驗(yàn)建立的新生小鼠心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，結(jié)果表明，單細(xì)胞收獲率和心肌細(xì)胞純度高，心肌細(xì)胞搏動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)；并應(yīng)用此細(xì)胞模型觀察了鐮刀菌毒素丁烯酸內(nèi)酯（BUT）對(duì)心肌的毒性作用，證明具有結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[11]。這不僅為毒理學(xué)，還為藥理學(xué)研究提供了一個(gè)較好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。在?dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)作為細(xì)胞生物學(xué)乃至生物學(xué)研究的重要技術(shù)，在生物領(lǐng)域中占有重要地位。動(dòng)物組織（細(xì)胞）培養(yǎng)開(kāi)始于20世紀(jì)初，發(fā)展至今已成為生物、醫(yī)學(xué)研究及應(yīng)用廣泛采用的技術(shù)方法，目前這項(xiàng)技術(shù)也廣泛應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)的研究。球蟲是一類寄生于雞等動(dòng)物腸道上皮細(xì)胞引起的一種原蟲，廣泛分布于世界各地，是目前危害養(yǎng)雞業(yè)的重要疾病之一。而細(xì)胞培養(yǎng)為球蟲研究提供潔凈無(wú)污染的環(huán)境，為研究抗球蟲藥物的作用機(jī)制、活性以及球蟲的發(fā)育、行為、結(jié)構(gòu)、免疫、遺傳、細(xì)胞化學(xué)和生物化學(xué)等方面提供更有效的研究工具[12]。在魚類方面，利用細(xì)胞克隆技術(shù)可以培育出新品種，還可以通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)于魚類病毒的分離、鑒定和增殖，病毒抑制和復(fù)制途徑的阻斷等方面具有重要作用。Nicolajsen等證明，虹彩病毒在BF-2、EPC、CHSE-214、RTG-2、FHM等5種細(xì)胞系均有較好的繁殖，這為研究宿主和病原之間的機(jī)理提供了幫助[13]。鄭凱等研究通過(guò)獲得較高純度的牦牛子宮肉阜上皮細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，可為牦牛胎兒與母體之間的相互調(diào)控及物質(zhì)運(yùn)輸提供簡(jiǎn)捷的研究平臺(tái)[14]。在其他方面的應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可用于有毒物質(zhì)的毒性機(jī)理的研究?？衫皿w外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞來(lái)研究氟化物的毒性機(jī)制[15]。木脂素類、黃酮等活性物質(zhì)是植物的次生代謝產(chǎn)物，其具有抗腫瘤、抗氧化等多種功能，現(xiàn)在可以利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)從植物細(xì)胞獲取。利用連翹葉子的懸浮細(xì)胞可進(jìn)行培養(yǎng)提取木脂素；可利用銀杏液體懸浮細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮、藥材金鐵鎖細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)皂苷等[16-21]。除此之外，細(xì)胞培養(yǎng)在生產(chǎn)疫苗方面也做出了貢獻(xiàn)。法國(guó)巴斯德研究所和美國(guó)西奈山醫(yī)學(xué)中心就在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中成功表達(dá)了乙肝表面抗原。我國(guó)也成功研制了由中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）細(xì)胞系表達(dá)的基因工程乙肝疫苗。3小結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)過(guò)不斷的研究和完善，已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室常用的研究方法，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥學(xué)等領(lǐng)域。目前，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)可以降低試驗(yàn)成本、避免浪費(fèi)等優(yōu)點(diǎn)也逐漸應(yīng)用于在動(dòng)物生產(chǎn)中。但細(xì)胞培養(yǎng)只是在模擬機(jī)體內(nèi)的生理環(huán)境，使細(xì)胞維持生長(zhǎng)、繁殖的技術(shù)，相對(duì)于機(jī)體這個(gè)系統(tǒng)來(lái)講，存在很大的差異，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞或組織的形態(tài)或功能發(fā)生不同程度的改變，因此試驗(yàn)的結(jié)果不能等同于在體內(nèi)研究的結(jié)果。[參考文獻(xiàn)][1]李勇.細(xì)胞培養(yǎng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].才}}",2011(18)：92-93.[2]劉流.聯(lián)合細(xì)胞培養(yǎng)在組織工程中的研究進(jìn)展fJl.昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010(3):1-3.[3]張卓然.培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2004.[4]段彪，中元英.乙肝病毒肝源細(xì)胞培養(yǎng)模型的研究進(jìn)展[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2011.6(8):618-620[5]魏鎖成，鞏轉(zhuǎn)娣，宋昌軍.豬輪狀病毒的細(xì)胞培養(yǎng)特性}FQ-PCR檢測(cè)力一法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011.31(3):373-377.[6]李文峰，麥康森，黃捷，等.魚類細(xì)胞培養(yǎng)及其在病毒學(xué)研究中的應(yīng)用[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010,31(5):107-110.[7]LadakisSM.NcremRM.Endothelialcellmonolayerformation:effectofsubstrateandfluidshearstress[J].Endothelium,2004,11(1):29-44.[8]OpdcnhuijsJ,MustersM,VerripsT,etal.Mathematicalmodelingofvascularendotheliallayermaintenance:theroleofendothelialcelldivision,progenitorcellhoming,andtelomereshortening[J].AmericanJournalofPhysiology-HeartandCirculatoryPhysiology,2004,287(6):2651-2658.[9]徐燕，王丹，謝堯，等.人卵巢癌微}(u.管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及體外管腔樣結(jié)構(gòu)形成的觀察[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)2010,32(3):201-205.[10]馬曉雯，劉彤，孫力超，等.人肺腺癌A549細(xì)胞系干細(xì)胞樣細(xì)胞的培養(yǎng)檢測(cè)及其抗順鉑能力的研究[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011,28(2):187-191.[11]陽(yáng)海鷹，丁巍，丁愛(ài)石，等.新生小鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)模型的建立及其在毒性評(píng)價(jià)研究中的應(yīng)用[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2010,34(1):30-33.[12]姜連連，黃兵，林矯矯.細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在雞球蟲研究中的應(yīng)用[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展2011.32(2):82-85.[13]AridE,NicolajsenN,ChristophersenMB,etal.Propagationandisolationofranavirusesincellculture[J].Aquaculture,2009,294(3-4):159-164.[14]鄭凱，劉弄，張濤杰，等.妊娠期耗牛子宮肉阜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2011,41(8):855-858.[15]張德新，王福元，王瑞綿.氟化鈉對(duì)體外培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中NO濃度影響[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2010,10(1):73-74.[16]KimHJ,OnoE,MorimotoK,etal.Metabolicengineeringoflignanbiosynthesisinforsythiacellculture[J].PlantCellPhysiology,2009,50(12):2200-2209.[17]胡燕梅，韓曉紅，周全，等.銀杏液體懸浮細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生黃酮的研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011,6(2):360-363,374.[18]劉同祥，耿韶華，張宗申，等.苗藥金鐵鎖藥材和植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的總皂苷含量比較[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011,22(9):2235-2236.[1