CDR3導(dǎo)向抗體庫(kù)法人源化抗膀胱癌Fab的鑒定

CDR3導(dǎo)向抗體庫(kù)法人源化抗膀胱癌Fab的鑒定【摘要】目的:對(duì)通過dr3導(dǎo)向抗體庫(kù)法挑選到的3株人源化膀胱癌噬菌體抗體進(jìn)展進(jìn)一步分析鑒定。方法:用elisa方法對(duì)挑選特異性克隆進(jìn)展特異性鑒定、抗原表位的核實(shí);采用硫氰酸鹽洗脫elisa法評(píng)估其親和力;選用活性較高的克隆進(jìn)展膀胱癌組織的免疫組化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:3株陽(yáng)性克隆可溶性表達(dá)后可以與膀胱癌ej細(xì)胞特異性結(jié)合;與鼠源噬菌體抗體(bdi)相比,2株克隆的親和指數(shù)比擬低,均為0.25l/l,1株克隆的親和指數(shù)為0.7l/l,略低于鼠源的親和指數(shù)〔0.9l/l〕的程度。選擇活性較高的克隆進(jìn)展膀胱癌組織的免疫組化實(shí)驗(yàn),顯示該克隆可以與癌組織特異性結(jié)合。結(jié)論:用dr3導(dǎo)向庫(kù)法獲得的人源抗體片段根本保持了原鼠源單克隆抗體(ab)bdi的特性?！娟P(guān)鍵詞】抗膀胱癌單克隆抗體噬菌體抗體庫(kù)鼠單克隆抗體人源化單克隆抗體(ab)在許多領(lǐng)域得到極為廣泛的應(yīng)用,但由于其鼠源性,限制了在臨床治療方面的應(yīng)用,近幾年由于人源化和人源抗體研制技術(shù)的進(jìn)展才得以迅速開展。目前,對(duì)鼠ab進(jìn)展人源化改造有多種方案。以噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)為根底的“抗原表位定向選擇法〞是近年來開展起來的一種鼠ab人源化新方法［1,2］。該方法通過鼠-人輕重鏈可變區(qū)雜合配對(duì),用抗原進(jìn)展親和挑選,最終得到與親本鼠ab識(shí)別一樣抗原表位的人源抗體。該方法可以確保所挑選到的抗體為人源抗體,不含鼠源序列。但所獲人源ab的特異性及親和力難以得到保證,有時(shí)所獲人源抗體與抗原的結(jié)合活性會(huì)產(chǎn)生漂移,與親本鼠ab有所不同。dr3導(dǎo)向抗體庫(kù)法是在“抗原表位定向選擇法〞的根底上嘗試的一種新方法。該方法通過構(gòu)建含鼠abdr3區(qū)基因的人源抗體庫(kù),并利用re-lxp定位重組系統(tǒng)構(gòu)建大容量抗體庫(kù),直接挑選與親本鼠ab特異性一樣的人源抗體。運(yùn)用該方法我們嘗試人源化抗膀胱癌鼠abbdi,獲得3株人源噬菌體抗體fab基因,并證實(shí)挑選到的克隆與親本鼠ab識(shí)別一樣的抗原表位［3］。本研究中,我們將對(duì)其特性作進(jìn)一步分析鑒定。1材料和方法1.1材料抗膀胱癌噬菌體抗體由本室運(yùn)用dr3導(dǎo)向抗體庫(kù)法挑選獲得,抗膀胱癌人-鼠嵌合抗體〔bdi〕、抗乙肝外表抗原fab(hbsagfab)、大腸桿菌菌株、vs13、l929細(xì)胞由本室制備保存［4］;抗膀胱癌鼠ab(bdi)、膀胱癌細(xì)胞株〔ej〕由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部泌尿研究所俞莉章教授提供;限制性內(nèi)切酶為takara公司產(chǎn)品;各種酶標(biāo)抗體購(gòu)自prega公司和siga公司。1.2方法1.2.1可溶性fab抗體的表達(dá)及檢測(cè)參照文獻(xiàn)［5］介紹的方法構(gòu)建和表達(dá)可溶性fab抗體,并按照文獻(xiàn)［6］介紹的方法接種膀胱癌ej細(xì)胞及l(fā)929細(xì)胞于96孔板,以hrp-羊抗人fab為二抗,檢測(cè)上清中人fab與膀胱癌細(xì)胞的結(jié)合活性及特異性。1.2.2相對(duì)親和力的測(cè)定〔1〕測(cè)定硫氰酸銨(nh4sn)對(duì)ej細(xì)胞抗原的影響:接種ej細(xì)胞于96孔板培養(yǎng)過夜,用2.5l/l戊二醛或丙酮/無水乙醇〔1∶1〕固定細(xì)胞,30g/l的脫脂牛奶-pbs〔pbs〕37℃封閉1h,參加不同濃度〔0～2.0l/l〕的nh4sn,室溫靜置15in,pbs洗3次,參加一樣濃度的鼠ab(bdi)和嵌合抗體〔bdi〕,50μl/孔,37℃孵育1h,0.5l/lteen-20/pbs洗3次,參加hrp-羊抗鼠或hrp-羊抗人fab(1∶2000),37℃孵育1h,再經(jīng)洗滌后pd顯色?！?〕用nh4sn洗脫法測(cè)定相對(duì)親和力:種植于96孔板的ej細(xì)胞經(jīng)固定及封閉后,參加待測(cè)抗膀胱癌abfab噬菌體上清50μl/孔,37℃孵育1h,0.5l/lteen-20/pbs洗3次,加50μl/孔不同濃度的nh4sn,室溫靜置15in,pbs洗3次,參加hrp-抗13〔1∶5000〕37℃孵育2h,再經(jīng)洗滌后pd顯色,a490計(jì)數(shù)。抗體與抗原結(jié)合的a490值在經(jīng)洗脫后下降至50%的nh4sn濃度即為該抗體的親和指數(shù),以l/l表示［7］。1.2.3免疫組化實(shí)驗(yàn)取臨床病理確定的膀胱癌標(biāo)本的石蠟切片脫蠟后,蒸餾水洗滌5in×3次,將切片放入盛有枸櫞酸鹽的緩沖液〔ph6.0〕的容器中,置微波爐內(nèi)加熱,在92℃～95℃之間持續(xù)10～15in,室溫冷卻10～20in。蒸餾水沖洗,pbs浸泡5in。50g/l山羊血清封閉1h,參加待測(cè)的抗體,4℃冰箱放置過夜。次日,pbs沖洗5in×3次,加hrp-抗13或hrp-羊抗人fab,室溫放置2h,繼續(xù)pbs沖洗5in×3次,參加dab顯色,復(fù)染,封片。2結(jié)果2.1可溶性fab抗體的表達(dá)及檢測(cè)將獲得的3株人源抗膀胱癌噬菌體抗體以nhei酶切,除去噬菌體抗體表達(dá)載體中的基因ⅲ片段,得到可溶性fab段的表達(dá)質(zhì)粒,用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌xl1-blue,經(jīng)阿拉伯糖誘導(dǎo)制備可溶性fab上清,用hrp-羊抗人fab進(jìn)展elisa檢測(cè),證明該fab段能特異地與ej細(xì)胞結(jié)合〔表1〕。表1可溶fab與ej細(xì)胞結(jié)合的elisa〔略〕2.2相對(duì)親和力的測(cè)定硫氰酸銨洗脫法是比擬不同抗體相對(duì)親和力的一種方法［8］。一般常用于比擬可溶性單一抗原的相對(duì)親和力,為確定其是否可以用于本實(shí)驗(yàn)中,首先檢測(cè)了不同濃度硫氰酸銨對(duì)ej細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示在2l/l濃度下,硫氰酸銨對(duì)固相化ej細(xì)胞的抗原性無影響〔圖1〕。圖1硫氰酸銨對(duì)固相化ej細(xì)胞抗原的影響〔略〕在此根底上現(xiàn)用該方法比擬了所獲人源與鼠源bdi噬菌體抗體的相對(duì)親和力,說明經(jīng)過dr3引導(dǎo)所獲得的人源抗體陽(yáng)性克隆中,其中的2個(gè)克隆的親和指數(shù)比擬低,均為0.25l/l,1個(gè)克隆的親和指為0.7l/l,接近于鼠源的親和指數(shù)〔0.9l/l〕的程度〔圖2〕。圖2抗體相對(duì)親和力的測(cè)定〔略〕2.3腫瘤組織免疫組化實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步確定所挑選的人源抗體的特異性,現(xiàn)又用確診的膀胱癌組織的石蠟切片進(jìn)展了免疫組化實(shí)驗(yàn),其所挑選到的人源抗膀胱癌抗體可以與膀胱癌組織特異結(jié)合〔圖3〕。圖3免疫組化鑒定人源抗膀胱癌抗體fab〔sp,×100〕〔略〕a:正常組織;b:膀胱癌組織.3討論bdi是一株對(duì)膀胱癌細(xì)胞具有高特異、高親和性的抗膀胱癌ab,在放射免疫診斷和治療試用中獲得良好的效果。為使其更好的用于臨床,在克隆bdi輕、重鏈基因的根底上,通過構(gòu)建含鼠abbdidr3區(qū)基因的人源抗體庫(kù),利用re-lxp定位重組系統(tǒng)構(gòu)建大容量抗體庫(kù)。用ej細(xì)胞對(duì)所獲的抗體庫(kù)進(jìn)展挑選,獲得了3株與ej細(xì)胞具有特異結(jié)合活性的人源化的噬菌體抗體。與嵌合抗體的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)顯示所獲的噬菌體抗體與親本鼠ab識(shí)別一樣的抗原表位。通過對(duì)所獲陽(yáng)性克隆可變區(qū)序列測(cè)定,顯示所獲得的克隆均為人源fab,抗體的基因與人胚系免疫球蛋白基因庫(kù)中的基因有極高的同源性。在本實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)把得到的3個(gè)克隆表達(dá)為可溶性fab分子后,elisa結(jié)果顯示,盡管3個(gè)克隆均可以與ej細(xì)胞特異性結(jié)合,只有一株可溶性克隆顯示出較高的特異性,可能是噬菌體抗體利用噬菌體展示技術(shù)將抗體蛋白展示在噬菌體外表,噬菌體表達(dá)的抗體數(shù)量有幾倍得到幾十倍的放大,結(jié)果顯示親和力高［9］。說明盡管用dr3導(dǎo)向抗體庫(kù)法可以獲得與鼠ab識(shí)別一樣表位的人源抗體,要想獲得具有高親和力的具有臨床應(yīng)用前景的抗體,還需進(jìn)一步進(jìn)展體外親和力成熟實(shí)驗(yàn)。在本實(shí)驗(yàn)中,我們還運(yùn)用硫氰酸銨洗脫法比擬了所獲人源與鼠源bdi噬菌體抗體的相對(duì)親和力,盡管結(jié)果顯示其中一個(gè)克隆的親和指數(shù)為0.7l/l,接近于鼠源的親和指數(shù)〔0.9l/l〕的程度,由于噬菌體抗體具有一定的放大效應(yīng),要想得到準(zhǔn)確的結(jié)果,還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證,相關(guān)工作正在進(jìn)展中?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】［1］jespersls,rbertsa,ahlers,etal.guidingtheseletinfhuanantibdiesfrphagedisplayrepertirestasingleepitpefanantigen［j］.bitehnlgy,1994,12〔9〕:899-903.［2］angzz,angy,lizf,etal.huanizatinfausenlnalantibdyneutralizingtnf-αbyguidedseletin［j］.jiunlethds,2000,241(1-2):171-184.［3］周麗君,王琰,王堃,等.用dr3導(dǎo)向抗體庫(kù)法對(duì)鼠抗人膀胱癌單抗進(jìn)展人源化［j］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2022,24(2):150-154.［4］白銀,王琰,周麗君,等.抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗體真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)［j］.北京大學(xué)學(xué)報(bào)〔醫(yī)學(xué)版〕,2001,33〔5〕:402-406.［5］李竟,王琰,王卓智,等.抗胃癌鼠單抗3h11fab段載體的構(gòu)建、表達(dá)及抗體活性檢測(cè)［j］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,1999,19〔2〕:158-161.［6］周麗君,白銀,王琰,等.抗膀胱癌單抗fab段基因的克隆及表達(dá)［j］.中國(guó)腫瘤生物治療雜志,2002,9(2):117-121.［7］王剛,王琰.用硫氰酸鹽洗脫法挑選高親和力噬菌體抗體［j］.中國(guó)免疫學(xué)雜志,2002,18〔2〕:93-9