CDR3導(dǎo)向抗體庫法人源化抗膀胱癌Fab的鑒定

CDR3導(dǎo)向抗體庫法人源化抗膀胱癌Fab的鑒定【摘要】目的:對通過dr3導(dǎo)向抗體庫法挑選到的3株人源化膀胱癌噬菌體抗體進展進一步分析鑒定。方法:用elisa方法對挑選特異性克隆進展特異性鑒定、抗原表位的核實;采用硫氰酸鹽洗脫elisa法評估其親和力;選用活性較高的克隆進展膀胱癌組織的免疫組化實驗。結(jié)果:3株陽性克隆可溶性表達后可以與膀胱癌ej細胞特異性結(jié)合;與鼠源噬菌體抗體(bdi)相比,2株克隆的親和指數(shù)比擬低,均為0.25l/l,1株克隆的親和指數(shù)為0.7l/l,略低于鼠源的親和指數(shù)〔0.9l/l〕的程度。選擇活性較高的克隆進展膀胱癌組織的免疫組化實驗,顯示該克隆可以與癌組織特異性結(jié)合。結(jié)論:用dr3導(dǎo)向庫法獲得的人源抗體片段根本保持了原鼠源單克隆抗體(ab)bdi的特性?！娟P(guān)鍵詞】抗膀胱癌單克隆抗體噬菌體抗體庫鼠單克隆抗體人源化單克隆抗體(ab)在許多領(lǐng)域得到極為廣泛的應(yīng)用,但由于其鼠源性,限制了在臨床治療方面的應(yīng)用,近幾年由于人源化和人源抗體研制技術(shù)的進展才得以迅速開展。目前,對鼠ab進展人源化改造有多種方案。以噬菌體抗體庫技術(shù)為根底的“抗原表位定向選擇法〞是近年來開展起來的一種鼠ab人源化新方法［1,2］。該方法通過鼠-人輕重鏈可變區(qū)雜合配對,用抗原進展親和挑選,最終得到與親本鼠ab識別一樣抗原表位的人源抗體。該方法可以確保所挑選到的抗體為人源抗體,不含鼠源序列。但所獲人源ab的特異性及親和力難以得到保證,有時所獲人源抗體與抗原的結(jié)合活性會產(chǎn)生漂移,與親本鼠ab有所不同。dr3導(dǎo)向抗體庫法是在“抗原表位定向選擇法〞的根底上嘗試的一種新方法。該方法通過構(gòu)建含鼠abdr3區(qū)基因的人源抗體庫,并利用re-lxp定位重組系統(tǒng)構(gòu)建大容量抗體庫,直接挑選與親本鼠ab特異性一樣的人源抗體。運用該方法我們嘗試人源化抗膀胱癌鼠abbdi,獲得3株人源噬菌體抗體fab基因,并證實挑選到的克隆與親本鼠ab識別一樣的抗原表位［3］。本研究中,我們將對其特性作進一步分析鑒定。1材料和方法1.1材料抗膀胱癌噬菌體抗體由本室運用dr3導(dǎo)向抗體庫法挑選獲得,抗膀胱癌人-鼠嵌合抗體〔bdi〕、抗乙肝外表抗原fab(hbsagfab)、大腸桿菌菌株、vs13、l929細胞由本室制備保存［4］;抗膀胱癌鼠ab(bdi)、膀胱癌細胞株〔ej〕由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部泌尿研究所俞莉章教授提供;限制性內(nèi)切酶為takara公司產(chǎn)品;各種酶標抗體購自prega公司和siga公司。1.2方法1.2.1可溶性fab抗體的表達及檢測參照文獻［5］介紹的方法構(gòu)建和表達可溶性fab抗體,并按照文獻［6］介紹的方法接種膀胱癌ej細胞及l(fā)929細胞于96孔板,以hrp-羊抗人fab為二抗,檢測上清中人fab與膀胱癌細胞的結(jié)合活性及特異性。1.2.2相對親和力的測定〔1〕測定硫氰酸銨(nh4sn)對ej細胞抗原的影響:接種ej細胞于96孔板培養(yǎng)過夜,用2.5l/l戊二醛或丙酮/無水乙醇〔1∶1〕固定細胞,30g/l的脫脂牛奶-pbs〔pbs〕37℃封閉1h,參加不同濃度〔0～2.0l/l〕的nh4sn,室溫靜置15in,pbs洗3次,參加一樣濃度的鼠ab(bdi)和嵌合抗體〔bdi〕,50μl/孔,37℃孵育1h,0.5l/lteen-20/pbs洗3次,參加hrp-羊抗鼠或hrp-羊抗人fab(1∶2000),37℃孵育1h,再經(jīng)洗滌后pd顯色?！?〕用nh4sn洗脫法測定相對親和力:種植于96孔板的ej細胞經(jīng)固定及封閉后,參加待測抗膀胱癌abfab噬菌體上清50μl/孔,37℃孵育1h,0.5l/lteen-20/pbs洗3次,加50μl/孔不同濃度的nh4sn,室溫靜置15in,pbs洗3次,參加hrp-抗13〔1∶5000〕37℃孵育2h,再經(jīng)洗滌后pd顯色,a490計數(shù)?？贵w與抗原結(jié)合的a490值在經(jīng)洗脫后下降至50%的nh4sn濃度即為該抗體的親和指數(shù),以l/l表示［7］。1.2.3免疫組化實驗取臨床病理確定的膀胱癌標本的石蠟切片脫蠟后,蒸餾水洗滌5in×3次,將切片放入盛有枸櫞酸鹽的緩沖液〔ph6.0〕的容器中,置微波爐內(nèi)加熱,在92℃～95℃之間持續(xù)10～15in,室溫冷卻10～20in。蒸餾水沖洗,pbs浸泡5in。50g/l山羊血清封閉1h,參加待測的抗體,4℃冰箱放置過夜。次日,pbs沖洗5in×3次,加hrp-抗13或hrp-羊抗人fab,室溫放置2h,繼續(xù)pbs沖洗5in×3次,參加dab顯色,復(fù)染,封片。2結(jié)果2.1可溶性fab抗體的表達及檢測將獲得的3株人源抗膀胱癌噬菌體抗體以nhei酶切,除去噬菌體抗體表達載體中的基因ⅲ片段,得到可溶性fab段的表達質(zhì)粒,用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌xl1-blue,經(jīng)阿拉伯糖誘導(dǎo)制備可溶性fab上清,用hrp-羊抗人fab進展elisa檢測,證明該fab段能特異地與ej細胞結(jié)合〔表1〕。表1可溶fab與ej細胞結(jié)合的elisa〔略〕2.2相對親和力的測定硫氰酸銨洗脫法是比擬不同抗體相對親和力的一種方法［8］。一般常用于比擬可溶性單一抗原的相對親和力,為確定其是否可以用于本實驗中,首先檢測了不同濃度硫氰酸銨對ej細胞的影響。結(jié)果顯示在2l/l濃度下,硫氰酸銨對固相化ej細胞的抗原性無影響〔圖1〕。圖1硫氰酸銨對固相化ej細胞抗原的影響〔略〕在此根底上現(xiàn)用該方法比擬了所獲人源與鼠源bdi噬菌體抗體的相對親和力,說明經(jīng)過dr3引導(dǎo)所獲得的人源抗體陽性克隆中,其中的2個克隆的親和指數(shù)比擬低,均為0.25l/l,1個克隆的親和指為0.7l/l,接近于鼠源的親和指數(shù)〔0.9l/l〕的程度〔圖2〕。圖2抗體相對親和力的測定〔略〕2.3腫瘤組織免疫組化實驗為進一步確定所挑選的人源抗體的特異性,現(xiàn)又用確診的膀胱癌組織的石蠟切片進展了免疫組化實驗,其所挑選到的人源抗膀胱癌抗體可以與膀胱癌組織特異結(jié)合〔圖3〕。圖3免疫組化鑒定人源抗膀胱癌抗體fab〔sp,×100〕〔略〕a:正常組織;b:膀胱癌組織.3討論bdi是一株對膀胱癌細胞具有高特異、高親和性的抗膀胱癌ab,在放射免疫診斷和治療試用中獲得良好的效果。為使其更好的用于臨床,在克隆bdi輕、重鏈基因的根底上,通過構(gòu)建含鼠abbdidr3區(qū)基因的人源抗體庫,利用re-lxp定位重組系統(tǒng)構(gòu)建大容量抗體庫。用ej細胞對所獲的抗體庫進展挑選,獲得了3株與ej細胞具有特異結(jié)合活性的人源化的噬菌體抗體。與嵌合抗體的競爭抑制實驗顯示所獲的噬菌體抗體與親本鼠ab識別一樣的抗原表位。通過對所獲陽性克隆可變區(qū)序列測定,顯示所獲得的克隆均為人源fab,抗體的基因與人胚系免疫球蛋白基因庫中的基因有極高的同源性。在本實驗中,當(dāng)把得到的3個克隆表達為可溶性fab分子后,elisa結(jié)果顯示,盡管3個克隆均可以與ej細胞特異性結(jié)合,只有一株可溶性克隆顯示出較高的特異性,可能是噬菌體抗體利用噬菌體展示技術(shù)將抗體蛋白展示在噬菌體外表,噬菌體表達的抗體數(shù)量有幾倍得到幾十倍的放大,結(jié)果顯示親和力高［9］。說明盡管用dr3導(dǎo)向抗體庫法可以獲得與鼠ab識別一樣表位的人源抗體,要想獲得具有高親和力的具有臨床應(yīng)用前景的抗體,還需進一步進展體外親和力成熟實驗。在本實驗中,我們還運用硫氰酸銨洗脫法比擬了所獲人源與鼠源bdi噬菌體抗體的相對親和力,盡管結(jié)果顯示其中一個克隆的親和指數(shù)為0.7l/l,接近于鼠源的親和指數(shù)〔0.9l/l〕的程度,由于噬菌體抗體具有一定的放大效應(yīng),要想得到準確的結(jié)果,還需進一步試驗驗證,相關(guān)工作正在進展中?！緟⒖嘉墨I】［1］jespersls,rbertsa,ahlers,etal.guidingtheseletinfhuanantibdiesfrphagedisplayrepertirestasingleepitpefanantigen［j］.bitehnlgy,1994,12〔9〕:899-903.［2］angzz,angy,lizf,etal.huanizatinfausenlnalantibdyneutralizingtnf-αbyguidedseletin［j］.jiunlethds,2000,241(1-2):171-184.［3］周麗君,王琰,王堃,等.用dr3導(dǎo)向抗體庫法對鼠抗人膀胱癌單抗進展人源化［j］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2022,24(2):150-154.［4］白銀,王琰,周麗君,等.抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗體真核表達載體的構(gòu)建和表達［j］.北京大學(xué)學(xué)報〔醫(yī)學(xué)版〕,2001,33〔5〕:402-406.［5］李竟,王琰,王卓智,等.抗胃癌鼠單抗3h11fab段載體的構(gòu)建、表達及抗體活性檢測［j］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,1999,19〔2〕:158-161.［6］周麗君,白銀,王琰,等.抗膀胱癌單抗fab段基因的克隆及表達［j］.中國腫瘤生物治療雜志,2002,9(2):117-121.［7］王剛,王琰.用硫氰酸鹽洗脫法挑選高親和力噬菌體抗體［j］.中國免疫學(xué)雜志,2002,18〔2〕:93-9