寧夏馬鈴薯Y病毒(PVY)外殼蛋白基因分子變異分析

寧夏馬鈴薯Y病毒(PVY)外殼蛋白基因分子變異分析摘要：馬鈴薯〔Solanumtuberosum〕Y病毒〔PotatovirusY，PVY〕是危害我國馬鈴薯的主要病毒之一。利用馬鈴薯Y病毒通用ELISA試劑盒確定所攜帶Y病毒的試驗(yàn)材料，設(shè)計(jì)了特異性引物通過反轉(zhuǎn)錄PCR獲得PVYCP基因序列，通過克隆PVY衣殼蛋白基因〔Coatprotein，CP〕序列分析其進(jìn)化與變異類型。結(jié)果說明，別離得到11株病毒，根據(jù)其CP序列特性分為4類；寧夏地區(qū)主要流行的病毒類型為PVYO進(jìn)化分枝，同時(shí)也可能出現(xiàn)了具有高致病性的PVYNTN新株系，占到被檢出病毒別離株的9.1%。結(jié)果提醒了寧夏地區(qū)PVY的進(jìn)化與變異類型，有助于針對(duì)性地防控PVY。關(guān)鍵詞：馬鈴薯〔Solanumtuberosum〕；馬鈴薯Y病毒；分子變異中圖分類號(hào)：S532文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439-8114〔2022〕22-5558-04馬鈴薯〔Solanumtuberosum〕Y病毒〔PotatovirusY，PVY〕在世界各地均有報(bào)道，其能侵染34個(gè)屬170余種植物，但主要以茄科作物為主[1]。PVY是危害我國馬鈴薯的主要病毒之一[2]。PVY包括3個(gè)株系組：馬鈴薯Y病毒普通株系組〔PVYO〕、馬鈴薯點(diǎn)條斑株系〔PVYc〕、馬鈴薯Y病毒褐脈株系〔PVYN〕[3]。PVY染病植株25℃時(shí)其體內(nèi)病毒濃度最高，有利于該病的發(fā)生；30℃時(shí)染病植株體內(nèi)病毒濃度最低，表現(xiàn)為隱癥。PVYO和PVYC初期感染病癥主要是葉片壞死和斑駁；PVYN那么導(dǎo)致不同程度的花葉。PVYO和PVYC繼發(fā)侵染的植株表現(xiàn)出矮化、皺縮、斑駁和卷曲等病癥；而PVYN感染植株通常為花葉和斑駁，當(dāng)溫度低于10℃和高于25℃時(shí)，不表現(xiàn)花葉病癥。PVY通常不引發(fā)塊莖病癥，但近年來在歐洲出現(xiàn)PVYN中的一個(gè)株系PVYNTN，PVYNTN株系具有PVYN株系的血清型，在煙草和馬鈴薯地上局部引起的病癥與PVYN株系相似。同時(shí)PVYNTN株系還可引起馬鈴薯塊莖壞死、環(huán)斑病，在塊莖的內(nèi)部或外部引起環(huán)狀、弧狀壞死斑，嚴(yán)重影響馬鈴薯的品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。血清學(xué)方法最常用于PVY株系的鑒定，但單純的血清學(xué)關(guān)系已被證明不完全可靠，因?yàn)樵S多病毒編碼的蛋白質(zhì)都有高度保守的區(qū)域，即使親緣關(guān)系很遠(yuǎn)的病毒在這些保守區(qū)域序列也可能相近，導(dǎo)致血清學(xué)反響難以區(qū)分。近年來，隨著基因測序技術(shù)的成熟，大量病毒衣殼蛋白〔CoatingProtein，CP〕基因的序列被測定，而且測定了不少病毒的全序列。CP基因序列分析在一定程度上對(duì)說明PVY分類具有一定的參考作用[4，5]。RNA植物病毒的遺傳多樣性主要由突變、重組、重排等因素造成[6-8]，以快速適應(yīng)多變的生存環(huán)境。PVY突變頻率較高、重組頻繁，造成遺傳多樣性變化很大，因此能在不同寄主和不同環(huán)境中生存與傳播。研究病毒變異和進(jìn)化有助于理解病毒的起源、進(jìn)化機(jī)制、分類關(guān)系和種群遺傳構(gòu)造的形成。本研究對(duì)寧夏地區(qū)流行的馬鈴薯Y病毒CP基因進(jìn)展測序，研究其分子變異，有助于掌握該病毒的變異類型與流行區(qū)域，從而更為有效地防控該病毒的大面積流行。1材料與方法1.1材料2022年，在寧夏固原農(nóng)業(yè)推廣總站馬鈴薯種質(zhì)資源圃中，搜集195份疑似攜帶馬鈴薯Y病毒樣本。該資源圃中種植了目前全區(qū)大多數(shù)主栽馬鈴薯品種，選擇有病理病癥明顯，從植株的頂部、中部和底部各取一片葉子合在一起，帶回實(shí)驗(yàn)室-70℃低溫保存。1.2試劑〔北京〕；引物由北京奧科鼎盛生物科技合成；其他化學(xué)試劑均為分析純。1.3方法1.3.1馬鈴薯Y的鑒定稱取0.10～0.15g馬鈴薯病葉樣品放置于樣品袋中，并標(biāo)記；然后向樣品袋中參加進(jìn)展雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附〔DAS-ELISA〕鑒定馬鈴薯病葉樣品，在典型陽性植株中根據(jù)顯色吸光度由高到低選取11株備用。1.3.2馬鈴薯總RNA的提取采用SVTotalRNAIsolationSystem試劑盒提取樣品總RNA，然后保存于-70℃超低溫冰箱備用。1.3.3引物設(shè)計(jì)從GenBank中獲得PVYCP基因核苷酸序列〔HQ631374.1、AY601680.1、HM036202.1〕，并利用BLAST和Clustal軟件進(jìn)展保守性分析，上游引物序列PVY_CPF：5′-GGAAATGACACAATCGATGCAGG-3′和下游引物序列PVY_CPR：5′-CATGTTCTTGACTCCAAGTAGAG-3′。1.3.4RT-PCR擴(kuò)增PVYCP基因取2μg馬鈴薯總RNA，以O(shè)ligodT為引物，進(jìn)展總cDNA反轉(zhuǎn)錄。以PVY_CPF、PVY_CPR為引物，cDNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板PCR擴(kuò)增PVYCP基因。PCR反響體系為25μL，包含10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs1.5μL，上、下游引物〔10μmol/μL〕各1μL，Pfu高保真聚合酶〔5U/μL〕1μL，總cDNA模版〔1μg/μL〕1μL，補(bǔ)ddH2O至25μL。PCR反響程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，50℃退火40s，72℃延伸50s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送天根生化科技〔北京〕進(jìn)展測序。1.3.5PVYCP基因序列分析對(duì)PVYCP基因序列進(jìn)展BLAST比對(duì)，DNAMAN7.0進(jìn)展生物信息學(xué)分析。進(jìn)化樹采用MEGA軟件繪制，計(jì)算方法采用Neighbor-joining方法[9]。2結(jié)果與分析2.1PVY陽性植株的鑒定經(jīng)PVY通用ELISA試劑盒鑒定的陽性植株分別編號(hào)為PVY14，PVY24，PVY29，PVY31，PVY35，PVY36，PVY47，PVY58，PVY59，PVY60，PVY63。2.2PVYCP基因的克隆利用RNA提取試劑盒提取陽性馬鈴薯植株葉片總RNA電泳結(jié)果見圖1，泳道1、2均為PVY陽性植株。以PVY_CPF、PVY_CPR為引物，以反轉(zhuǎn)錄為模板進(jìn)展PVYCP基因的RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖2。由圖2可知，11個(gè)樣品擴(kuò)增出了801bp的目的片段，與預(yù)期大小一致，說明成功擴(kuò)增出了CP基因。2.3PVYCP基因的生物信息學(xué)分析11個(gè)樣品PVY別離株CP基因的序列與GenBank上已公布的PVY不同別離株CP基因序列核苷酸序列同源性均在89.5%以上〔表1〕。其中，PVY59、PVY63與PVYNTN-NW株系的一致性達(dá)99.4%。根據(jù)Potyvirus病毒劃分種的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)CP基因的核苷酸序列一致性高于76%時(shí)，應(yīng)歸為同一個(gè)種。因此，11個(gè)別離株應(yīng)為PVY別離株。11個(gè)別離株中其核苷酸序列一致性為98.82%，共計(jì)57個(gè)位置堿基發(fā)生了變化，且多為同義突變即編碼的氨基酸序列沒有發(fā)生變化，編碼267個(gè)氨基酸序列，造成16個(gè)氨基酸序列存在變異〔圖3〕。該地區(qū)PVY的親緣關(guān)系見圖4。由圖4可知，11個(gè)別離株可分為4類。第一類PVY29、PVY31、PVY58、PVY24、PVY47、PVY36屬于PVYN：O株系，與高芳鑾等[10]鑒定的14個(gè)不同省份PVY別離株〔圖4中藍(lán)色框標(biāo)識(shí)局部〕聚類到一起，但是明顯具有一定的區(qū)域性。這說明在本地區(qū)馬鈴薯長期種植過程中，PVY病毒進(jìn)化有別于其他省份別離得到的病毒株系，開展成為較新的一類型。第二類PVY14、PVY59、PVY63屬于PVYNTN-NW株系，與第一類同屬于PVYO型這一進(jìn)化分枝；第三類PVY60，介于PVYO型化分枝和C型化分枝之間。第四類PVY35，與本次別離得到的其他株系關(guān)系較遠(yuǎn)，同源性僅為93%，因此，將此別離株CP基因序列注冊GenBank，登入號(hào)為JN635310.1，與PVYNTN株系親緣關(guān)系較近，可能是一種新的PVYNTN株系變種。2.4寧夏地區(qū)PVY類型分析在核苷酸程度根據(jù)PVYCP基因第50位和86位核苷酸是A與否，可將PVY35別離株確定為PVYN型或PVYNTN型，其余別離株為PVYo型[2]。在蛋白質(zhì)程度，根據(jù)PVYCP蛋白第98和99位氨基酸為QL大多屬于PVYNTN型，為RM大多屬于PVYo[11]。別離株P(guān)VY35可能為PVYNTN型，其余別離株屬于PVYO型進(jìn)化分枝。據(jù)此，推測寧夏地區(qū)主要流行的病毒類型為PVYO型進(jìn)化分枝，分屬于PVYNTN、PVYNTN-NW和PVYO3種病毒類型，占調(diào)查總數(shù)的90.9%〔10/11〕，但是也可能出現(xiàn)了具有高致病性的PVYNTN新株系，占調(diào)查總數(shù)的9.1%〔1/11〕。3小結(jié)與討論P(yáng)VY不同株系間可能具有一樣的血清型或生物學(xué)特性，單獨(dú)利用免疫學(xué)技術(shù)和接種鑒別寄主等方法均無法對(duì)各株系進(jìn)展準(zhǔn)確鑒定。以PCR為主要手段的分子檢測能很核苷酸程度準(zhǔn)確檢測其基因型，這對(duì)快速掌握和防控PVY流行趨勢具有一定的指導(dǎo)意義。本研究設(shè)計(jì)的引物為擴(kuò)增PVYCP基因全長序列，其能提供更多的分型位點(diǎn)，在一定程度上彌補(bǔ)了血清學(xué)檢測的缺乏。通過PVY通用型ELSIA試劑盒對(duì)寧夏地區(qū)馬鈴薯疑似病株進(jìn)展檢測，共檢測出11株P(guān)VY別離株，對(duì)這些病毒的衣殼蛋白基因進(jìn)展測序，可以劃分為4個(gè)類型；寧夏地區(qū)主要流行的病毒類型為PVYo，但也可能出現(xiàn)了具有高致病性的PVYNTN新株系，占到被檢出病毒的9.1%。近20年來，很多人在全球范圍研究PVY在馬鈴薯中的傳播和重組。在歐洲，PVYNTN和PVYN-Wi型已經(jīng)替代了PVYO和PVYN；在美國和加拿大，PVYO仍然是主要流行病型，PVYN較少，但是重組型有增長的趨勢并偶有分布。高芳鑾等[10]對(duì)中國PVY病毒進(jìn)展了CP基因變異研究，但沒有寧夏地區(qū)病株材料。本研究中，在寧夏地區(qū)195份疑似病株中僅檢測出PVY病毒11株，僅占整個(gè)檢測材料的5.64%，這個(gè)原因可能是由于多病毒復(fù)合感染，造成類似表型。參考文獻(xiàn)：[1]張帥.我國主要煙區(qū)PVY株系分化研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，2022.[2]楊慶東，吳興泉，陳士華，等.PVY株系間的分子變異及分子鑒定方法[J].中國馬鈴薯，2022，25〔3〕：166-169.[3]劉金亮，四種馬鈴薯Y病毒屬病毒的分子變異及HC-Pro構(gòu)造對(duì)抑制RNA沉默的影響[D]，山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2022.[4]江彤，陳偉.來自安徽不同寄主PVY別離物的血清學(xué)鑒定及其cp基因分子進(jìn)化分析[J].植物病理學(xué)報(bào)，2022，39〔5〕：540-543.[5]李向東，李懷方，范在豐.馬鈴薯Y病毒屬病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，1999〔4〕：283-285.[6]ROOSSINCKMJ.Mechanismsofplantvirusevolution[J].AnnuRevPhytopathol，1997，35：191-209.[7]ROOSSINCK，MJ.PlantRNAvirusevolution[J].CurrOpinMicrobiol，2022，6：406-409.[8]SIMONAE，BUJARSKIJJ.RNA-RNArebinationandevolutioninvirus-infectedplants[J].AnnuRevPhytopathol，1994，32：337-362.[9]TAMURAK，PETERSOND，PETERSONN，etal.MEGA5：Molecularevolutionarygeneticsanalysisusingmaximumlikelihood，evolutionarydistance，andmaximumparsimonymethods[J].MolecularBiologyandEvolution，2022，28〔10〕：2731-2739.[10]高芳鑾