經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)

現(xiàn)代免疫分析技術(shù)

經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)1免疫分析技術(shù)的發(fā)展多元免疫技術(shù)免疫沉淀免疫凝集補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)中和反應(yīng)免疫標(biāo)記技術(shù)經(jīng)典免疫學(xué)方法化學(xué)發(fā)光膠體金酶免疫免疫熒光放射免疫PCR-免疫分析時(shí)間分辨熒光分析2Chapteroutline沉淀反應(yīng)（Precipitation）凝集反應(yīng)（Agglutination）補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)中和反應(yīng)3概念：沉淀反應(yīng)又稱免疫沉淀反應(yīng)，是指可溶性抗原（如細(xì)菌浸出液、含菌病理浸出液或血清以及其他來源的蛋白質(zhì)、多糖、類脂質(zhì)體等）與相應(yīng)抗體在液相或凝膠中特異性結(jié)合后，形成的免疫復(fù)合物在一定條件下出現(xiàn)的蛋白質(zhì)析出現(xiàn)象。

A.

Precipitation

原理：蛋白質(zhì)表面—極性分子—水膜

適量電解質(zhì)+比例適合的抗原抗體=沉淀

4

A.

Precipitation

沉淀反應(yīng)的類型溶液中沉淀反應(yīng)凝膠中沉淀反應(yīng)絮凝沉淀試驗(yàn)，環(huán)狀沉淀試驗(yàn)，免疫比濁法，免疫沉淀技術(shù)，免疫共沉淀技術(shù)

單(雙)向免疫擴(kuò)散，免疫電泳，對(duì)流免疫電泳，火箭免疫電泳，交叉免疫電泳，免疫固定電泳，免疫印記技術(shù)51.溶液中的免疫沉淀反應(yīng)6Negativetest

PositivetestUsesfineparticlesofantigentodetectantibodyinpatient’sserum.1.1絮凝試驗(yàn)(Flocculation)抗原抗體比例是關(guān)鍵！稀釋法、方陣滴定法。梅毒的檢測(cè)71902年，Ascoli建立。早期用途：獸類內(nèi)臟、皮毛浸液等標(biāo)本中的炭疽桿菌抗原。

1.2環(huán)狀沉淀試驗(yàn)(ringprecipitationtest)抗血清抗原37℃與絮凝實(shí)驗(yàn)相比：減少了反應(yīng)體積；提高了反應(yīng)靈敏度?？捎糜谳^少量的抗原檢測(cè)，如血跡分析、病原昆蟲的流行病學(xué)分析。8原理：抗原抗體充分反應(yīng)后，所形成的絮狀或顆?？乖贵w復(fù)合物會(huì)增加反應(yīng)體系的濁度。特點(diǎn)：現(xiàn)代光學(xué)技術(shù)與自動(dòng)分析技術(shù)相結(jié)合，提高了靈敏度和易操作性。分類：透射比濁法、散射比濁法（靈敏度高）

1.3免疫比濁法(Immunoturbidimetry)YYY9光線穿透待測(cè)溶液時(shí)，會(huì)受到抗原抗體復(fù)合物的作用而發(fā)生散射，散射光的強(qiáng)度與復(fù)合物的含量以及散射夾角成正比，因此可以通過測(cè)定散射光強(qiáng)度的變化來推測(cè)抗原抗體反應(yīng)的情況。LightsourceDetector1.反應(yīng)動(dòng)力學(xué)測(cè)定2.快速、敏感、精確度高（ng）3.儀器價(jià)格昂貴、對(duì)抗體要求高散射比濁法(Nephelometry)10利用抗原抗體的特異性結(jié)合作用，使靶蛋白（抗原）形成抗原抗體復(fù)合物并最終從溶液中沉淀出來。第一階段改進(jìn)：改變反應(yīng)條件促進(jìn)抗原抗體多聚物形成，使其更加容易沉淀。第二階段改進(jìn)：加入二抗，促進(jìn)更大的抗原抗體網(wǎng)絡(luò)形成。第三階段（20世紀(jì)70年代）改進(jìn)：采用固相載體提高對(duì)靶蛋白的沉淀。細(xì)菌蛋白質(zhì)A，細(xì)菌蛋白質(zhì)G。1.4免疫沉淀法(immunoprecipitation)11免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是利用抗體將相應(yīng)蛋白沉淀的同時(shí)，與該分子特異性結(jié)合的其他分子同時(shí)被沉淀出來。通過進(jìn)一步與其他技術(shù)結(jié)合，如SDS，Westernblot可以進(jìn)一步對(duì)靶蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。1.5免疫共沉淀法(co-immunoprecipitation)1213相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，保持了蛋白質(zhì)的天然活性；蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響；可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；如用westernblot檢驗(yàn)，必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)的抗體，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果。優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)142.凝膠中的免疫沉淀反應(yīng)152.1單向免疫擴(kuò)散(SingleImmunodiffusion)凝膠中抗原或抗體其中之一保持相對(duì)靜止，通過對(duì)應(yīng)的抗原或抗體分子的運(yùn)動(dòng)而在合適的位置上形成沉淀?？捎糜诳乖蚩贵w的定量。16

2.2雙向免疫擴(kuò)散(DoubleImmunodiffusion/OuchterlonyMethod)Testingperformedinagargel.Antigenisplacedinonewell.Antibodyisplaceinotherwell.Eachdiffusesthroughgel.Ifantibodyisspecifictothatantigen,aprecipitinlinewillformwherethe2meet.Ag01/4Ab1/2Ab1/1Ab1/16Ab1/8Ab172.3免疫電泳

(Immunoelectrophoresis)瓊脂平板電泳+雙向擴(kuò)散18

2.4火箭免疫電泳

(Rocketimmunoelectrophoresis)單向擴(kuò)散+水平瓊脂電泳pH條件：抗體分子不帶電荷，抗原分子帶負(fù)電荷。19

2.5交叉免疫電泳

(Rocketimmunoelectrophoresis)雙向火箭電泳（電場(chǎng)方向垂直的兩次電泳）抗原根據(jù)不同遷移率分離抗原抗體復(fù)合物形成火箭峰20

2.6免疫固定電泳(ImmunofixationElectrophoresis)與免疫電泳原理相同。電泳后直接將抗體加于蛋白質(zhì)區(qū)帶表面，形成的復(fù)合物嵌于固相支持物中。洗去游離的抗原抗體后，染色觀察被固定的區(qū)帶。

Anode

PatientserumCathode(+electrode)(-electrode)Applicationpoint21Westernblotting(Immunoblotting)1979，Rebart&TowbinIdentificationofproteinantigenfollowingSDS

2.7免疫印記(Immunoblotting)WesternblottingSDSIFE（固免）?高分辨率?操作簡(jiǎn)單?高特異性?高靈敏度22SeparateproteinsbySDSPAGETransferproteinstomembranes(i.e.Nitrocellulose)Blocknon-specificsitesonmembraneIncubatewithprimaryantibody,washIncubatewithsecondaryantibody,washDetectsecondaryantibody

2.7免疫印記(Immunoblotting)23

2.7免疫印記(Immunoblotting)24顆粒型抗原或細(xì)胞型抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在有適當(dāng)電解質(zhì)存在下，抗原與抗體充分反應(yīng)，相互聚集，形成肉眼可見的凝集塊團(tuán)。B.凝集反應(yīng)Agglutinogen

抗原性質(zhì)，反應(yīng)方式，實(shí)驗(yàn)?zāi)康?--

直接凝集反應(yīng)（Directagglutination）

間接凝集反應(yīng)（Indirectagglutination）

血凝和血凝抑制反應(yīng)

（InhibitionofAgglutination）25細(xì)菌、螺旋體或紅細(xì)胞與其相應(yīng)抗體直接混合，經(jīng)一定時(shí)間，形成細(xì)菌或紅細(xì)胞凝集。Oftenperformedatroomtemperature.Mayusecentrifugationtobringantigenandantibodyintocloserproximity.某些病原菌感染的檢測(cè)（傷寒、副傷寒）。Clickonimageatrightwaitforanimationtobegin.

1直接凝集DirectAgglutination26載體種類：血細(xì)胞聚苯乙烯膠乳顆粒（羧化）2間接凝集PassiveAgglutination與直接凝集不同，間接凝集反應(yīng)中的可溶性抗原或抗體需要吸附或偶聯(lián)在一種與免疫無關(guān)的、具有一定大小的不溶性顆粒物的表面，使其成為致敏載體。間接血凝試驗(yàn)，膠乳凝集試驗(yàn)，活性碳粒試驗(yàn)正向間接凝集反應(yīng)，反向間接凝集反應(yīng)

27Antigensonacarriermolecule,suchaslatex,combinewithpatient’ssampleforantibodydetection.Clickonimageabovewaitforanimationtobegin.2.1正向間接凝集ForwardPassiveAgglutination28Antibodyisboundtothecarriermolecule,whichisthenmixedwithpatient’ssampletodetectantigen.Clickonimageabovewaitforanimationtobegin.2.2反向間接凝集試驗(yàn)ReversePassiveAgglutination提高了單純抗原抗體反應(yīng)的靈敏度對(duì)微量抗原（真菌毒素）檢測(cè)具有一定優(yōu)勢(shì)29Antibodyreagentiscombinedwithpatient’sspecimen.Ifpatient’sspecimencontainstheantigenforthatantibody,theywillreact.Erythrocyte（紅細(xì)胞）isadded.Apositivereactionwillshownoagglutination.Anegativereactionshowsagglutinationbetweenreagentantibodiesandantigen.YYYYYY3血凝抑制反應(yīng)InhibitionofAgglutination+-含血凝素（HA）的病毒能凝集人或動(dòng)物紅細(xì)胞，稱為血凝現(xiàn)象！30JulesBordet（1870-1961）Discovererofcomplement19世紀(jì)末概念：新鮮血液中含有的一種不耐熱成分，可輔助和補(bǔ)充特異性抗體介導(dǎo)的免疫溶菌、溶血作用；特點(diǎn)：補(bǔ)體的激活沒有抗原抗體特異性；原理：作為一種通用試劑來檢測(cè)反應(yīng)體系中抗原抗體復(fù)合物的存在，并利用補(bǔ)體對(duì)紅細(xì)胞的裂解作用，通過紅細(xì)胞的變化可以很容易的對(duì)反應(yīng)進(jìn)行示蹤。

C.補(bǔ)體參與的抗原抗體反應(yīng)31補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)原理受檢系統(tǒng)指示系統(tǒng)溶血反應(yīng)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)1.僅有抗原或抗體補(bǔ)體紅細(xì)胞溶血素陽(yáng)性陰性2.抗原抗體反應(yīng)紅細(xì)胞溶血素陰性陽(yáng)性抗原抗體補(bǔ)體抗原/抗體32

D.中和反應(yīng)中和試驗(yàn)是免疫學(xué)和病毒學(xué)中常用的一種抗原抗體反應(yīng)試驗(yàn)方法，用以測(cè)定抗體中和病毒感染性或細(xì)菌毒素的生物學(xué)效應(yīng)。凡能與病毒結(jié)合，使其失去感染力的抗體又稱中和抗體。能與細(xì)菌外毒素結(jié)合，中和其毒性作用的抗體稱為抗毒素。33中和試驗(yàn)可以在敏感動(dòng)物體內(nèi)(包括雞胚)，體外組織(細(xì)胞)培