一般毒性作用最新課件

第六章

一般毒性(dúxìnɡ)作用

Generaltoxiceffects一.概述二.急性毒性作用三.局部(júbù)毒性作用四.短期、亞慢性和慢性毒性作用（蓄積性與耐受性）第一頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

一般毒性：

1.急性毒性

（acutetoxicity）

2.局部(júbù)毒性

（localtoxicity）

3.亞急性毒性

（subacutetoxicity）

4.亞慢性毒性

（subchronictoxicity）

5.慢性毒性

（chronictoxicity）重復(fù)(chóngfù)暴露毒性第二頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

特殊(tèshū)毒性：

1.致癌

（carcinogenicity）

2.致突變

（mutation）

如：小鼠微核試驗(yàn)（mousemicronucleustest）

小鼠顯性致死試驗(yàn)（mousedominantlethaltest）

大鼠染色體畸變試驗(yàn)（ratchromosomeaberrationtest）

3.致畸

（teratogenesis）

4.生殖發(fā)育毒性

（reproductiveand

developmentaltoxicity）

5.

藥物依賴性

（drugdependence)第三頁，共八十八頁。一般毒性作用最新一、一般毒性(dúxìnɡ)作用概念和意義

一般毒性評價(jià)主要目的：

1.確定受試物毒作用表現(xiàn)與性質(zhì)；2.確定受試物毒作用的劑量與反應(yīng)關(guān)系；獲得的參數(shù)有：LD50、LOAEL、NOAEL3.確定毒作用靶器官；4.評價(jià)毒性損害的可逆性；5.了解化學(xué)藥物毒作用的影響因素等。第一節(jié)概述第四頁，共八十八頁。一般毒性作用最新二、一般毒性試驗(yàn)的動(dòng)物選擇（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇1.物種

選擇原則：⑴與人體生物學(xué)特征(tèzhēng)相似的動(dòng)物；⑵自然壽命不太長的動(dòng)物；⑶易于飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)操作的動(dòng)物；⑷經(jīng)濟(jì)并易于獲得的動(dòng)物。

（一般選擇兩個(gè)物種進(jìn)行試驗(yàn)）第五頁，共八十八頁。一般毒性作用最新2.品系

一般在毒理學(xué)系列研究中應(yīng)使用同一品系。3.級別(jíbié)（質(zhì)量）

Ⅱ級（清潔級）或Ⅲ級（SPF級）的動(dòng)物4.性別

受試物毒性如果有性別差異，應(yīng)選擇敏感的性別，若沒有應(yīng)選擇兩種性別進(jìn)行試驗(yàn)（♂/♀各半）。5.年齡與體重

急性試驗(yàn)-選擇成年動(dòng)物；慢性試驗(yàn)-剛斷乳動(dòng)物。同一性別動(dòng)物的起始體重差異≯平均體重20%。6.生理與健康狀況

不選擇懷孕、哺乳其動(dòng)物，須選擇健康動(dòng)物（健康觀察期5-7天）。第六頁，共八十八頁。一般毒性作用最新（二）染毒方式選擇原則：

一般選擇受試物實(shí)際與人接觸的途徑。

1.呼吸道染毒有：氣管注入染毒吸入染毒（靜式與動(dòng)式兩種）2.消化道染毒有：灌胃法、喂飼法和膠囊法。3.經(jīng)皮染毒

有：表皮涂藥、浸尾法。4.注射途徑

有：靜脈、腹腔(fùqiāng)、肌肉、皮下、皮內(nèi)等。

第七頁，共八十八頁。一般毒性作用最新一、急性毒性概念

是指1次接觸或24小時(shí)內(nèi)多次接觸外源化學(xué)物在短期內(nèi)所產(chǎn)生的健康損害作用和致死效應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)效應(yīng)觀察期：2周。

24小時(shí)多次染毒：毒性(dúxìnɡ)很低或溶解度很低的受試物。一般規(guī)定：≯3次/24小時(shí)，每次間隔4小時(shí)以上。第二節(jié)急性毒性作用(zuòyòng)第八頁，共八十八頁。一般毒性作用最新二、急性毒性試驗(yàn)的目的

1.評價(jià)急性毒性大小

求出LD50、LD100、LD01、LD0或MTD、LOAEL、NOAEL等。

2.了解急性毒性特征（中毒癥狀與體征）

3.為亞急性、亞慢性、慢性、致癌等試驗(yàn)提供劑量設(shè)置的依據(jù)。

4.為毒作用機(jī)制研究提供初步(chūbù)線索。第九頁，共八十八頁。一般毒性作用最新用LD50作為劑量參考(cānkǎo)依據(jù)的毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)類別劑量(jìliàng)設(shè)組要求蓄積毒性試驗(yàn) 1/20-1/5

LD50范圍設(shè)組亞慢性試驗(yàn)1/20-1/5LD50作最高劑量慢性(致癌)試驗(yàn)1/10LD50作最高劑量第十頁，共八十八頁。一般毒性作用最新三、急性毒性試驗(yàn)方法要點(diǎn)(yàodiǎn)

（一）經(jīng)典急性毒性試驗(yàn)

（即傳統(tǒng)LD50法）

基本要求:（OECD）

1.檢疫觀察3-5d，成年健康動(dòng)物（大鼠首選）；

2.5-7個(gè)劑量組，每組10只動(dòng)物以上（♀/♂各半）；

3.劑量組距合適，一般為等比級數(shù)；

4.給藥途徑盡量與實(shí)際接觸一致；

（隔夜禁食（12-14h），給藥后再禁食3-4小時(shí)）

5.毒性(dúxìnɡ)觀察期至少2周以上，每天觀察1次。第十一頁，共八十八頁。一般毒性作用最新LD50計(jì)算方法：

①曲線擬合法

（概率單位(dānwèi)法或Bliss法）

②插值法

累積法

寇氏法

移動(dòng)平均法

霍恩(Horn)法-查表法

Weil查表法等第十二頁，共八十八頁。一般毒性作用最新劑量設(shè)置依據(jù)：

①參考同系物或類似物的急性毒性資料；

②最大耐受致死量（LD0）測定(cèdìng)；

WHO規(guī)定給藥劑量：經(jīng)口5000mg/kg

經(jīng)呼吸道5000ppm

經(jīng)皮膚2000mg/kg

③預(yù)試驗(yàn)測定致死劑量范圍

即死亡率從0%～100%（10%～90%)

-Lork法（）

-組距法第十三頁，共八十八頁。一般毒性作用最新改良Lork簡化(jiǎnhuà)劑量設(shè)計(jì)方案第十四頁，共八十八頁。一般毒性作用最新公式：

i=（lgLD90-lgLD10）/（n-1）

或

i=（lgLD100-lgLD0）/（n-1）

式中：i-為組距

n-為設(shè)計(jì)(shèjì)的劑量組數(shù)組距法確定(quèdìng)各組劑量第十五頁，共八十八頁。一般毒性作用最新假定某化學(xué)藥物(yàowù)LD100為2000mg/kg,LD0為500mg/kg,設(shè)6個(gè)劑量組，各染毒組的劑量是多少？1.按公式求出對數(shù)劑量組距（I）公式：

I=（lgLD100-lgLD0）/（n-1)=（lg2000-lg500）/(6-1)=（3.301-2.699）/5=0.1202.確定各組實(shí)際劑量（見下表）實(shí)例(shílì)第十六頁，共八十八頁。一般毒性作用最新某化學(xué)藥物急性毒性試驗(yàn)劑量(jìliàng)設(shè)置組別劑量(jìliàng)對數(shù)劑量(jìliàng)（mg/kg）12.701502.322.821662.232.941873.043.0611150.853.1811517.163.301

2000.0

注：劑量對數(shù)組距=0.12，劑量組間的等比級數(shù)=1.318

第十七頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

要求：

①5～6個(gè)劑量組，每組動(dòng)物數(shù)相等；

②死亡率呈正態(tài)分布；

③最低劑量組死亡率＜20%；

最高劑量組死亡率＞80%，

④各組劑量呈等比級數(shù)（）。

特點(diǎn)：

①計(jì)算結(jié)果簡便（按公式(gōngshì)計(jì)算）

②精確度高1.改良(gǎiliáng)寇氏(Karber)法–點(diǎn)斜法LD50(或LC50)計(jì)算(jìsuàn)第十八頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

公式(gōngshì)：

lgLD50＝Xk－i(p－0.5)pqS＝i

n

LD50的95%可信限＝(LD50±1.96S)

LD50計(jì)算公式：式中：

m-lgLD50;

i-組間對數(shù)劑量差值；

Xk-最大劑量的對數(shù)值(shùzí)；

q-存活率（q=1-p）；

∑p-各劑量組死亡率總和；

n-每組動(dòng)物數(shù)。第十九頁，共八十八頁。一般毒性作用最新應(yīng)用(yìngyòng)實(shí)例公式(gōngshì)：lgLD50=1.4961-0.08(2.3-0.5)

=1.3521lgLD50及其95%可信限為1.3521±1.96×0.0213=1.3104~1.3938LD50及其95%可信限為22.5mg/kg（20.44~24.76mg/kg）第二十頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

要求：

①4個(gè)劑量組，每組動(dòng)物數(shù)相等(xiāngděng)（4只或5只）

②雌雄分開試驗(yàn)

③每組劑量為固定倍數(shù)遞增（2.15倍，3.16倍）

特點(diǎn)：

①動(dòng)物用量少

②結(jié)果查表可得（查表可得LD50及95%可信限范圍）

③精確度不高2.霍恩(Horn)法–又稱劑量(jìliàng)遞增法第二十一頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

霍恩(Horn)法查表-2.15倍組距例如(lìrú)：全活-全死劑量范圍為200-1500mg/kg劑量組選擇215,464,1000,2150(t=2)第二十二頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

霍恩(Horn)法查表-3.16倍組距例如(lìrú)：全活-全死劑量范圍為180-3500mg/kg劑量組選擇100,316,1000,3160(t=2)第二十三頁，共八十八頁。一般毒性作用最新(二）急性毒性替代法

“3R”原則要求：

替代（Replacement）

減少（Reduction）

優(yōu)化（Refinement）

常見的替代法有：

1.限量試驗(yàn)(shìyàn)（limittest）

2.固定計(jì)量法（fixeddosemethod）

3.急性毒性分級法（acutetoxicclassmethod）

4.上下法（upanddownprocedure）-序貫法第二十四頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

使用條件：

受試物急性毒性很低時(shí)可采用此法。

方法要求：

①受試動(dòng)物一般(yībān)為嚙齒類動(dòng)物；

②24小時(shí)內(nèi)多次給予受試物；

③20只動(dòng)物，雌雄各半；

④給予最大劑量，一般為10000mg/kg；

⑤毒性觀察期14天；

毒性評價(jià)：

LD50＞給藥劑量（mg/kg）1.限量(xiànliàng)試驗(yàn)第二十五頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

方法要求：（實(shí)際上是一種非死亡毒性評價(jià)）

①固定劑量：5、50、300、2000mg/kg；

②預(yù)試驗(yàn)：用單性別1只動(dòng)物循序進(jìn)行，接受試驗(yàn)前后的2只動(dòng)物間隔24小時(shí)。如一個(gè)劑量無中毒表現(xiàn)，其上個(gè)劑量動(dòng)物死亡，需在中間(zhōngjiān)插入劑量進(jìn)行試驗(yàn)；

③正式試驗(yàn)：根據(jù)預(yù)結(jié)果，取5只動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)；

④限量試驗(yàn)：如果2000mg/kg預(yù)試驗(yàn)和正式試驗(yàn)均不出現(xiàn)中毒表現(xiàn)，試驗(yàn)終止，為未觀察到毒性(U)。

⑤若正式試驗(yàn)5mg/kg出現(xiàn)中毒表現(xiàn)或死亡，試驗(yàn)終止，可定為高度(T+)。

結(jié)果判斷（OECD）：

高毒(T+)、有毒(T)、有害(H)、未觀察到毒性(U)。2.固定(gùdìng)劑量法第二十六頁，共八十八頁。一般毒性作用最新FD法急性毒性分級(fēnjí)選定：第二十七頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

3.急性毒性分級(fēnjí)法注：按全球(quánqiú)化學(xué)品分類及標(biāo)簽協(xié)調(diào)制度（GHS）標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)定級第二十八頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

要求：

先以一個(gè)劑量進(jìn)行一個(gè)動(dòng)物試驗(yàn)，如動(dòng)物死亡，則以下一個(gè)較小劑量試探，若仍動(dòng)物死亡則以下一個(gè)更小劑量試探；如動(dòng)物存活(cúnhuó)，則以較大劑量試探，依次類推，最終按公式計(jì)算LD50值。

死亡觀察為48小時(shí)，存活動(dòng)物觀察14天。

特點(diǎn)：

①節(jié)省動(dòng)物（一般6-10只動(dòng)物或以上）；

②適用于毒性反應(yīng)快速的化學(xué)藥物。4.序貫法（-又稱上-下法）第二十九頁，共八十八頁。一般毒性作用最新序貫法實(shí)驗(yàn)(shíyàn)計(jì)算公式：式中：n-使用(shǐyòng)動(dòng)物總數(shù)；x-每個(gè)劑量組的劑量；f-每個(gè)劑量組動(dòng)物數(shù)。第三十頁，共八十八頁。一般毒性作用最新應(yīng)用(yìngyòng)實(shí)例第三十一頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

（三）急性毒作用觀察

觀察記錄內(nèi)容：

①中毒癥狀（觀察2周，記錄癥狀發(fā)生(fāshēng)的時(shí)間、程度和持續(xù)時(shí)間等）；

②試驗(yàn)前后記錄體重（每周至少稱體重1次）；

③死亡記錄（死亡數(shù)用于計(jì)算LD50）；

④大體解剖與病理學(xué)檢查等。第三十二頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

四、急性毒性分級(fēnjí)WHO急性毒性分級(fēnjí)標(biāo)準(zhǔn)：第三十三頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

國內(nèi)健康相關(guān)產(chǎn)品(chǎnpǐn)毒性分級第三十四頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

第三十五頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

第三十六頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

第三十七頁，共八十八頁。一般毒性作用最新GHS化學(xué)品急性毒性分級(fēnjí)標(biāo)準(zhǔn)

（2002）

≥第4級上限值注：GHS-全球(quánqiú)化學(xué)品分類及標(biāo)簽協(xié)調(diào)制度

（GloballyHarmonizedSystemofClassificationandLabelingofChemicals

）第三十八頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

LD50評價(jià)問題

1.毒性大小比較

LD50值較大者的95%可信限的下限＞LD50值較小者的95%可信限的上限。前者的毒性小于后者。

如果可信區(qū)間存在(cúnzài)重疊，按公式進(jìn)行t檢驗(yàn)：

公式：

2.劑量-反應(yīng)曲線斜率比較

（可分析毒性特征）

3.LD50值表示第三十九頁，共八十八頁。一般毒性作用最新第四十頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

表示LD50時(shí)應(yīng)注意標(biāo)明：

動(dòng)物品系(pǐnxì)；

染毒途徑；

95%可信限范圍。LD50±1.96S例如：異氰酸甲酯

大鼠經(jīng)口LD50值為69mg/kg±5.6即63.4～74.6mg/kg。第四十一頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

概念：

局部毒性作用又稱局部損害作用，是指生物機(jī)體暴露于化學(xué)物后，在其接觸或暴露部位造成的局部毒性損害作用，包括腐蝕性、刺激性與過敏性作用。

目的：

1.評價(jià)化學(xué)物對眼睛、皮膚的刺激與腐蝕作用和皮膚的致敏作用及其程度或等級；

2.為制定(zhìdìng)化學(xué)物安全使用規(guī)范提供科學(xué)依據(jù)。第三節(jié)

局部(júbù)毒性作用第四十二頁，共八十八頁。一般毒性作用最新一、眼睛刺激試驗(yàn)

眼刺激性（eyeirritation）指眼球(yǎnqiú)表面接觸受試物后所產(chǎn)生的可逆性炎性變化。

眼腐蝕性（eyecorrosion）指眼球表面接觸受試物后引起的不可逆性組織損傷。

試驗(yàn)方法：Draize法（1944年）

常用動(dòng)物：白兔第四十三頁，共八十八頁。一般毒性作用最新Draize法：

（自身對照原則）

試驗(yàn)方法：一般采用(cǎiyòng)4只白兔，受試物以一次劑量滴入每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)（0.1ml），以生理鹽水處理另一側(cè)眼作為自身對照。在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)觀察對兔眼的刺激和腐蝕作用程度，并按規(guī)定的分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。

觀察指標(biāo)：結(jié)膜(發(fā)紅、球結(jié)膜水腫和分泌物)，角膜(混濁程度和范圍)，虹膜(充血、腫脹和角膜周圍充血)。

實(shí)驗(yàn)期限：一般為7天，必要時(shí)延長至21天(觀察期能足已評價(jià)刺激是否存在可逆性)。

注意事項(xiàng)：

如72h眼刺激反應(yīng)仍不消退時(shí)，需另取4只白兔觀察洗眼效果，即滴入受試物后分別在4s和30s時(shí)，用生理鹽水洗眼5min，觀察洗眼后的眼睛反應(yīng)。（洗眼效果試驗(yàn)）第四十四頁，共八十八頁。一般毒性作用最新第四十五頁，共八十八頁。一般毒性作用最新Draize法眼(fǎyǎn)損傷程度評分表：第四十六頁，共八十八頁。一般毒性作用最新（續(xù)表）第四十七頁，共八十八頁。一般毒性作用最新第四十八頁，共八十八頁。一般毒性作用最新第四十九頁，共八十八頁。一般毒性作用最新眼睛刺激動(dòng)物試驗(yàn)替代法：

1.受精雞卵尿囊絨膜試驗(yàn)

利用尿囊絨膜與結(jié)膜結(jié)構(gòu)相似性。

2.細(xì)胞膜損傷溶血試驗(yàn)

用分光光度計(jì)法測定溶血程度(chéngdù)（Hb從RBC漏出）。

3.血紅蛋白變性試驗(yàn)（用酶標(biāo)儀測定）

因角膜透明度降低是化學(xué)物破壞了蛋白質(zhì)構(gòu)象。

4.細(xì)胞毒性試驗(yàn)

兔眼角膜上皮細(xì)胞SIRC模型，觀察細(xì)胞增殖、膜完整性等（中性紅不能沉積在死細(xì)胞內(nèi)，用酶標(biāo)儀測定）

5.生物膜替代法等方法

受試物+立體人類皮膚+MTT，用酶標(biāo)儀測定提取液中的MTT吸光度（MTT不能沉積在死細(xì)胞內(nèi)）第五十頁，共八十八頁。一般毒性作用最新二、皮膚刺激試驗(yàn)

皮膚刺激性（dermalirritation）指皮膚接觸或涂敷受試物后，局部產(chǎn)生的可逆性炎性變化。

皮膚腐蝕性(dermalcorrosion）指皮膚接觸或涂敷受試物后，引起局部的不可逆性組織損傷。

皮膚刺激試驗(yàn)類型：

①單次和多次皮膚刺激試驗(yàn)；

②完整皮膚和破損皮膚刺激試驗(yàn)等。

試驗(yàn)方法：Draize法（1944年）

常用動(dòng)物(dòngwù)：家兔或豚鼠

第五十一頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

破損皮膚刺激試驗(yàn)

是人為將動(dòng)物皮膚某部位(bùwèi)擦傷（不能傷及真皮和產(chǎn)生出血），以比較受試物對完整皮膚及受損皮膚造成的刺激反應(yīng)的差異。

傷口消毒藥物一般都需要做破損皮膚刺激試驗(yàn)。第五十二頁，共八十八頁。一般毒性作用最新皮膚刺激試驗(yàn)（Draize法）：

（自身對照原則）

試驗(yàn)方法：

將受試物一次或多次涂敷于受試動(dòng)物背部一側(cè)皮膚上(0.5ml)，涂敷持續(xù)時(shí)間一般(yībān)為4h，以生理鹽水處理另一側(cè)背部皮膚作自身對照。

觀察指標(biāo)：

皮膚反應(yīng)常為紅斑或紫紅色斑、水腫等，損傷嚴(yán)重時(shí)可形成焦痂，一般按紅斑和水腫的嚴(yán)重程度評分，并與自身對照比較，從而評價(jià)受試物對皮膚的刺激作用。

實(shí)驗(yàn)觀察期：一般為14天。第五十三頁，共八十八頁。一般毒性作用最新皮膚(pífū)刺激試驗(yàn)結(jié)果的影響因素：

1.皮膚的完整性（皮膚受損程度）；

2.固態(tài)受試物的物理狀態(tài)與溶解度；

3.受試動(dòng)物年齡與性別；

4.實(shí)驗(yàn)人員主觀因素（存在判斷差異）等。

無需做皮膚刺激試驗(yàn)條件：

①受試物為強(qiáng)酸或強(qiáng)堿類腐蝕性物質(zhì)（pH≤2或≥11.5）

②受試物有很強(qiáng)的經(jīng)皮吸收毒性，經(jīng)皮LD50小于200mg/kg體重；

③急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)中，受試物劑量達(dá)2000mg/kg體重仍未出現(xiàn)皮膚刺激性作用。

第五十四頁，共八十八頁。一般毒性作用最新皮膚刺激/腐蝕的體外替代法：

1.單層皮膚細(xì)胞培養(yǎng)模型

單層細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

（如：皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞、皮膚黑色素細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞等）

2.表皮組織培養(yǎng)模型

EpidermTM重組(zhònɡzǔ)人表皮模型（美國）

3.器官型人工皮膚模型

即體外構(gòu)建的含表皮和真皮雙層結(jié)構(gòu)第五十五頁，共八十八頁。一般毒性作用最新Draize法皮膚(pífū)損傷程度評分表：第五十六頁，共八十八頁。一般毒性作用最新第五十七頁，共八十八頁。一般毒性作用最新第五十八頁，共八十八頁。一般毒性作用最新三、皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)

皮膚變態(tài)反應(yīng)（skinsensitization）

是皮膚對化學(xué)物產(chǎn)生的免疫源性皮膚反應(yīng)，又稱過敏性接觸性皮炎或皮膚致敏反應(yīng)。

在人身上有瘙癢、紅斑、丘疹(qiūzhěn)、水皰、融合水皰等，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物身上，通常只能見到皮膚紅斑和水腫等反應(yīng)。

試驗(yàn)?zāi)康模捍_定重復(fù)接觸化學(xué)物是否可引起變態(tài)反應(yīng)及其反應(yīng)程度。

受試動(dòng)物：豚鼠，每組動(dòng)物10~20只。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：需做陽性對照和陰性對照，陰性對照動(dòng)物僅給予受試物激發(fā)接觸。（陽性物-2,4-二硝基氯苯）

第五十九頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

致敏機(jī)制：

化學(xué)物在穿透皮膚的過程中，可作為半抗原與體內(nèi)某些特定的載體蛋白共價(jià)結(jié)合，形成完全抗原，誘導(dǎo)抗體形成，產(chǎn)生免疫記憶(jìyì)，如再次接觸較低濃度的相同或結(jié)構(gòu)相似的化學(xué)物，即能引發(fā)皮膚變態(tài)反應(yīng)。

試驗(yàn)方法：

①局部封閉涂皮法（BuehlerTest）（傳統(tǒng)方法）

②豚鼠最大值試驗(yàn)（guineapigmaximizationtest）

用完全福氏佐劑，皮內(nèi)注射。

③局部淋巴結(jié)試驗(yàn)（locallymphnodeassay，LLNA）

實(shí)驗(yàn)記錄：

記錄皮膚具有紅斑和水腫（過敏反應(yīng)）的動(dòng)物數(shù)。第六十頁，共八十八頁。一般毒性作用最新局部封閉涂皮法（二步法）

致敏接觸：

實(shí)驗(yàn)前將受試動(dòng)物背部左側(cè)(zuǒcè)皮膚去毛區(qū)3cm×3cm，將受試物0.1~0.2ml涂在2cm×2cm濾紙上，將其敷貼在去毛區(qū)，用兩層紗布，一層油紙或不透水塑料膜覆蓋，再以無刺激膠布固定，持續(xù)6h，6h后去除敷貼及受試物。第7天和第14天以同樣方法重復(fù)一次。

激發(fā)接觸：

實(shí)驗(yàn)前將受試動(dòng)物背部右側(cè)皮膚去毛區(qū)2cm×2cm。末次致敏后14~28天，將0.1~0.2ml或低于致敏濃度的受試物斑貼于右側(cè)去毛區(qū)，覆蓋方法同前，持續(xù)6h，去掉斑貼及受試物后，每日觀察至第12天。第六十一頁，共八十八頁。一般毒性作用最新第六十二頁，共八十八頁。一般毒性作用最新第六十三頁，共八十八頁。一般毒性作用最新一、概述

重復(fù)(chóngfù)多次接觸化學(xué)物的毒性研究。

根據(jù)持續(xù)時(shí)間分類（按OECD）：

短期毒性作用（亞急性）

（染毒期一般為28天）

亞慢性毒性作用

（嚙齒類動(dòng)物一般為90天，犬為1年）

慢性毒性作用

（嚙齒類動(dòng)物一般為1年，或終身染毒）第四節(jié)

短期、亞慢性(mànxìng)和慢性(mànxìng)毒性作用第六十四頁，共八十八頁。一般毒性作用最新短期、亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)的主要目的：

1.觀察長期接觸受試物的毒效應(yīng)(xiàoyìng)譜、毒作用特征與毒作用靶器官以及中毒表現(xiàn)（包括癥狀與體征）等；

2.探索受試物的作用機(jī)制；

3.觀察長期接觸受試物所致毒作用的可逆性；

4.評價(jià)毒作用的劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系，確定最大無作用劑量（NOAEL）、閾劑量（LOAEL），為制訂人類基礎(chǔ)的安全限值提供依據(jù)；

5.觀察不同動(dòng)物種屬的毒性差異，為試驗(yàn)結(jié)果外推到人，確定安全系數(shù)提供依據(jù)。第六十五頁，共八十八頁。一般毒性作用最新二、研究方法

（一）短期重復(fù)毒性和亞慢性毒性試驗(yàn)

基本要求：

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

（1）物種與品系

①嚙齒類動(dòng)物（首選大鼠，品系Wister與SD大鼠）

②非嚙齒類動(dòng)物（犬，品系Beagle）

（2）性別(xìngbié)、年齡和動(dòng)物數(shù)

雌雄各半；大鼠年齡一般≯6周，體重50-100克，每組動(dòng)物≮20只。犬用4-6月齡(≯9個(gè)月)，每組動(dòng)物≮8只。

（3）動(dòng)物等級與飼養(yǎng)條件

清潔級及以上等級動(dòng)物，屏障環(huán)境飼養(yǎng)，飼料、飲水、墊料、氣溫、氣濕、壓力、光照等符合GLP要求。第六十六頁，共八十八頁。一般毒性作用最新2.染毒途徑與染毒期限

應(yīng)盡量與人實(shí)際接觸相似的途徑；染毒頻率一般為每日1次，連續(xù)給予（每周可給予5-6次）

（1）經(jīng)口染毒

①灌胃法-大小鼠

②喂飼法-大小鼠（受試物在飼料一般≯5%）

③吞咽膠囊法-犬

（2）呼吸道染毒

每天染毒時(shí)間2-6小時(shí)（OECD：為持續(xù)4小時(shí)染毒）

（3）注射途徑

應(yīng)注意無菌操作

染毒期限：短期重復(fù)(chóngfù)暴露-28天；亞慢性暴露-90天第六十七頁，共八十八頁。一般毒性作用最新3.劑量選擇與分組

一般選擇至少3個(gè)劑量組和1個(gè)陰性對照組（溶劑），若要中期觀察或?qū)嶒?yàn)結(jié)束后恢復(fù)期觀察，對照組與高劑量組需設(shè)計(jì)“衛(wèi)星組”。

劑量組設(shè)計(jì)原則：

①高劑量組動(dòng)物應(yīng)有(yīnɡyǒu)明顯中毒反應(yīng)，但不引起死亡；

②中劑量組動(dòng)物出現(xiàn)輕度的中毒反應(yīng)；

(相當(dāng)于LOAEL水平)

③低劑量組動(dòng)物無毒性反應(yīng)；

（相當(dāng)于NOAEL水平）

④劑量組間距一般為2-4倍。第六十八頁，共八十八頁。一般毒性作用最新劑量組設(shè)計(jì)應(yīng)注意的問題：

①以急性毒性試驗(yàn)中同一動(dòng)物品系和同一染毒途徑獲得的LD50為依據(jù)；

如28天經(jīng)口毒性試驗(yàn)可按LD50的10-25%作為最高劑量，最低劑量應(yīng)是人體預(yù)期實(shí)際攝入量3倍以上。

②對于求不出LD50的受試物，即毒性很低的受試物，如藥品、食品，可根據(jù)(gēnjù)人體實(shí)際攝入量為依據(jù)。

藥品：大鼠可用人臨床擬用劑量的10、30、100倍，非嚙齒類動(dòng)物可用5、15、50倍的劑量進(jìn)行劑量設(shè)置；

食品：試驗(yàn)劑量應(yīng)涵蓋人體預(yù)期攝入量的100倍，在不影響營養(yǎng)攝食與營養(yǎng)平衡情況下，高劑量組可按最大給予量設(shè)計(jì)。第六十九頁，共八十八頁。一般毒性作用最新4.觀察指標(biāo)選擇

應(yīng)能觀察到受試物的靶器官和敏感毒性指標(biāo)。

①一般觀察指標(biāo)（中毒癥狀）；

②體重、食物消耗量與飲水(yǐnshuǐ)消耗量；

③眼部觀察；

④血液學(xué)指標(biāo)；

⑤血液生化指標(biāo)；

⑥尿常規(guī)指標(biāo)；

⑦體溫與心電圖檢查；

⑧病理學(xué)檢查（大體解剖與組織病理學(xué)檢查）；

⑨特異性指標(biāo)（效應(yīng)標(biāo)志物）。第七十頁，共八十八頁。一般毒性作用最新第七十一頁，共八十八頁。一般毒性作用最新5.觀察時(shí)間

如果設(shè)計(jì)恢復(fù)期觀察：

28天亞急性毒性試驗(yàn)：衛(wèi)星觀察期14天；

90天亞慢性毒性試驗(yàn)：衛(wèi)星觀察期28天；

觀察目的：

①毒性可逆性；

②毒性持續(xù)性；

③毒性遲發(fā)效應(yīng)等；

觀察要求：

至少每天觀察一次，詳細(xì)記錄中毒(zhòngdú)癥狀、體征、毒

效應(yīng)性質(zhì)、毒性持續(xù)時(shí)間、死亡等情況。第七十二頁，共八十八頁。一般毒性作用最新（二）慢性毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)?zāi)康模?/p>

評價(jià)受試動(dòng)物大部分生命期間給予受試物所發(fā)生慢性毒性效應(yīng)，闡明其劑量-反應(yīng)關(guān)系和靶器官，確定慢性毒性的NOAEL和LOAEL。

根據(jù)“3R”原則，慢性毒性試驗(yàn)與致癌試驗(yàn)合并。

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與染毒途徑選擇（與亞急性與亞慢性相同）

2.染毒劑量與染毒期限

一般選擇至少3個(gè)劑量組和1個(gè)陰性對照組（溶劑），若要中期觀察或?qū)嶒?yàn)結(jié)束(jiéshù)后恢復(fù)期觀察，對照組與高劑量組需設(shè)計(jì)“衛(wèi)星組”。劑量組距一般為2-4倍，≯10倍。染毒期限一般至少12個(gè)月。

3.觀察指標(biāo)選擇（同亞慢性試驗(yàn)）第七十三頁，共八十八頁。一般毒性作用最新（三）實(shí)驗(yàn)結(jié)果評價(jià)

（短期、亞慢性與慢性毒性結(jié)果）

評價(jià)要求：

確定受試動(dòng)物發(fā)生毒效應(yīng)的劑量-反應(yīng)關(guān)系和靶器官，求得NOAEL和LOAEL。

要與正常對照組比較，作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析：

1.劑量-效應(yīng)（反應(yīng)）關(guān)系趨勢；

2.實(shí)驗(yàn)效應(yīng)重現(xiàn)性（毒性“三個(gè)重現(xiàn)”）；

3.相關(guān)指標(biāo)變化分析；

4.毒性的性別差異；

5.持續(xù)(chíxù)效應(yīng)趨勢分析；

6.效應(yīng)差異大小；

7.實(shí)驗(yàn)室的歷史對照分析（有助于排除假陽性）第七十四頁，共八十八頁。一般毒性作用最新毒理學(xué)研究的實(shí)際意義：

如食品安全性毒理學(xué)評價(jià)中90天喂養(yǎng)試驗(yàn)：

1.最大無作用劑量(NOAEL)≤人可能實(shí)際攝入量100倍，表示毒性(dúxìnɡ)較強(qiáng)，應(yīng)放棄該化學(xué)物用于食品；

2.最大無作用劑量(NOAEL)在人可能實(shí)際攝入量100-300倍時(shí)，應(yīng)進(jìn)行慢性試驗(yàn)；

3.最大無作用劑量(NOAEL)≥人可能實(shí)際攝入量300倍時(shí)，不必進(jìn)行慢性試驗(yàn)，即可進(jìn)行安全性評價(jià)。第七十五頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

又如工業(yè)化學(xué)物毒物的慢性毒性試驗(yàn)：

1.LOAEL與NOAEL值越小，慢性中毒的危險(xiǎn)性越大，制定安全限值（衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)）應(yīng)越嚴(yán)格（即安全系數(shù)要大）。

2.慢性吸入中毒危險(xiǎn)指數(shù)

（Rchip=20℃毒物蒸汽飽和濃度/Limch）

評價(jià)(píngjià)危險(xiǎn)性大?。?/p>

Rchip＜100輕微危害

100≤Rchip＜1000中等危害

1000≤Rchip＜10000高度危害

Rchip＞10000極高危害第七十六頁，共八十八頁。一般毒性作用最新第七十七頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

蓄積毒性試驗(yàn)

研究(yánjiū)意義：

1.求出蓄積系數(shù)(K)，判斷化學(xué)藥物蓄積性大??；

2.為其他相關(guān)毒性試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

基本方法：

1.理化檢驗(yàn)法-（物質(zhì)蓄積，求t1/2）

（殘留率測定法）

2.生物效應(yīng)法-（物質(zhì)蓄積與功能蓄積）

①蓄積系數(shù)法（有固定劑量法與遞增劑量法）

②20天蓄積試驗(yàn)法第七十八頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

蓄積系數(shù)法

蓄積系數(shù)是指多次染毒所產(chǎn)生的毒效應(yīng)(ED50(n)或LD50(n))與一次染毒所產(chǎn)生相同毒效應(yīng)(ED50(1)或LD50(1))的比值。公式：

Kacc=ED50(n)/ED50(1)或Kacc=LD50(n)/LD50(1)求出蓄積系數(shù)K值。根據(jù)K值的大小判斷化學(xué)(huàxué)物蓄積作用的強(qiáng)弱，K值越小蓄積毒性越大。第七十九頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

1.固定計(jì)量法基本方法：①求出化學(xué)物1次染毒的LD50(1)值；②對另一組動(dòng)物每天給予1/10LD50(1)劑量直至受試動(dòng)物死亡一半為止，計(jì)算所用總劑量即LD50(n)；③如果到50天死亡動(dòng)物仍未達(dá)一半，停止(tíngzhǐ)試驗(yàn)（達(dá)5個(gè)LD50(1)劑量），這時(shí)可判斷為輕度蓄積作用。第八十頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

2.遞增劑量法基本方法：①求出化學(xué)物1次染毒(rǎndú)的LD50(1)值；②測定另一組動(dòng)物L(fēng)D50(n)；

以4天為一周期，在同一周期劑量相同，下一周期為上一周期劑量的1.5倍，第一周期每天劑量為0.1LD50(1)，直至受試動(dòng)物死亡一半為止，計(jì)算總劑量即LD50(n)；③如果到28天，死亡動(dòng)物仍未達(dá)一半，可停止試驗(yàn)，這時(shí)總劑量達(dá)12.8LD50(1),可認(rèn)為無蓄積性。第八十一頁，共八十八頁。一般毒性作用最新

劑量遞增法(1.5倍)使用(shǐyòng)劑量表

接觸天數(shù)1~45~89~1213~1617~2021~2425~28每日接觸劑量(LD50)0.10.150.220.340.500.751.124日接觸總劑量(LD50)