GMP質(zhì)量體系124-微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-124-00頁數(shù)34-1實施日期制訂人審核人批準(zhǔn)人制訂日期審核日期批準(zhǔn)日期制訂部門質(zhì)管部分發(fā)部門檢驗室目的：制訂微生物限度檢查法的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。適用范圍：微生物限度檢查。責(zé)任：微生物限度檢查操作人員按本規(guī)程操作，檢驗室主任監(jiān)督本規(guī)程的實施。程序：1.簡述細(xì)菌、霉菌、酵母菌計數(shù)是檢測規(guī)定企業(yè)單位內(nèi)的非滅菌制劑污染的活菌數(shù)量，是判定藥品受到微生物污染程度的重要指標(biāo)，也是對生產(chǎn)企業(yè)的藥品、原料、輔料、設(shè)備器具、工藝流程、生產(chǎn)環(huán)境和操作者的衛(wèi)生狀況進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評價的綜合依據(jù)之一。細(xì)菌、霉菌、酵母菌計數(shù)均采用平板菌落計數(shù)法，這是活菌計數(shù)方法之一，也是目前國際上許多國家常用的一種方法。該方法以在瓊脂平板上，每個細(xì)菌（營養(yǎng)瓊脂）、霉菌（玫瑰紅鈉瓊脂）、酵母菌（玫瑰紅鈉瓊脂或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂）形成一個獨(dú)立可見的菌落為計數(shù)依據(jù)。測定結(jié)果只反映在規(guī)定條件下所生長的細(xì)菌（一群在營養(yǎng)瓊脂上發(fā)育的嗜中溫、需氧和兼性厭氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落數(shù)。不包括對營養(yǎng)、氧氣、溫度、pH和其他因素有特殊要求的細(xì)菌、霉菌和酵母菌。一個細(xì)菌、霉菌和酵母菌菌落均可由一個或多個菌細(xì)胞形成。因此供試品中所測的菌落數(shù)實際為菌落形成單位數(shù)（colonyformingunitg，CFU），而不應(yīng)理解為細(xì)菌、霉菌、酵母菌的個數(shù)。在進(jìn)行本法測定時，必須嚴(yán)格按本法所規(guī)定的條件操作，以免產(chǎn)生實驗誤差。2.設(shè)備、儀器及用具2.1設(shè)備****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-22.1.1無菌室2.1.1.1結(jié)構(gòu)和要求無菌室應(yīng)采光良好、避免潮濕、無離廁所及污染區(qū)（面積不超過10m2，高度不超過2.4m）由緩沖間（2個）、操作間組成。操作間與緩沖間之間應(yīng)有樣品傳遞箱，出入操作間和緩沖間的門不應(yīng)直對。無菌室內(nèi)應(yīng)六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墻與地面及墻壁、天花板連接處應(yīng)呈凹弧形，無縫隙，不留死角。操作間內(nèi)不應(yīng)安裝下水道。無菌室內(nèi)的照明燈應(yīng)嵌裝在天花板內(nèi)，室內(nèi)光照應(yīng)分布均勻，光照度不低于300勒克斯。緩沖間和操作間均應(yīng)設(shè)置紫外線殺菌燈（2～2.5W/m3），紫外殺菌燈距實驗臺面高度不超過1m，并應(yīng)定期檢查輻射強(qiáng)度，不得低于70μW.cm-2（1m距離）。不符合要求的紫外殺菌燈應(yīng)及時更換。2.1.1.2溫度、濕度無菌室內(nèi)溫度和相對濕度直接影響紫外殺菌燈殺菌效果，故溫度應(yīng)控制在18～26℃，相對濕度40～60%。操作間或凈化工作臺的潔凈空氣應(yīng)保持對環(huán)境形成正壓、不低于4.9Pa。2.1.1.3操作間，操作間應(yīng)安裝空氣除菌過濾層流裝置。潔凈度不應(yīng)低于10000級，局部凈化度為100級，或放置同等級凈化工作臺，并準(zhǔn)備藥物天平，乙醇燈，火柴，乙醇棉，大、小橡皮乳頭等。2.1.1.4緩沖間緩沖間內(nèi)應(yīng)有洗手盆，無菌衣、帽、口罩、拖鞋等。緩沖間內(nèi)不應(yīng)放置培養(yǎng)箱和其他雜物。2.1.1.5潔凈級別及檢查方法通常采用塵粒數(shù)及浮游菌數(shù)或沉降菌數(shù)測定法。潔凈級別塵粒數(shù)/m3活微生數(shù)（個）/m3≥0.5≥5100級≤3，500≤0≤510000級≤350，000≤2000≤100100000級（GB/T16294－1996）≤3，500，000≤20，000≤500****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-3潔凈級別個/（∮90mm.0.5h）100級≤11000級≤3100000級≤102.1.1.5.1浮游菌數(shù)測試方法（參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16293-1996）2.1.1.5.2沉降菌數(shù)測定（Ⅱ法）無菌室操作臺消毒擦拭處理后，先啟動層流凈化裝置30min，將備妥的營養(yǎng)瓊脂平板3個（經(jīng)30～35C預(yù)培養(yǎng)48h，證明無菌落生長）。以無菌方式（或經(jīng)傳遞箱）移入操作間，置凈化臺左、中、右各1個，開蓋，暴露30min后將蓋蓋上。在30～35℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)48h，取出檢查。3個平板生長的平均菌落數(shù)不超過1個。無菌操作臺或凈化工作臺要定期檢測其潔凈度，應(yīng)達(dá)到100級。凈化工作臺中的高效及中效過濾器應(yīng)根據(jù)檢測情況，必要時予以更換處理。2.1.1.6消毒處理無菌室應(yīng)在每次操作前、后均用0.1％苯扎溴銨溶液或其他消毒液擦拭操作臺及可能污染的死角。開動層流凈化裝置，同時用紫外殺菌燈照射30min。2.1.2其他設(shè)備凈化工怍臺、恒溫培養(yǎng)箱（30～35℃）、生化培養(yǎng)箱（25～28℃），微波爐（或其他適宜加熱裝置）、康氏振蕩器、勻漿儀（3000～8000r/min）、恒溫水浴、電熱干燥箱（250～300℃）、電冰箱、空調(diào)、高壓蒸汽滅菌器（使用時要進(jìn)行滅菌效果檢查并應(yīng)定期請有關(guān)部門檢定）。2.2儀器及器皿2.2.1菌落計數(shù)器、顯微鏡（1500X）、電子天平或藥物天平（感量0．1g），pH系列比色計。2.2.2玻璃器皿錐形?。?50～300ml，內(nèi)裝玻璃珠若干）、研缽（陶瓷制，直徑10～12cm）、培養(yǎng)皿（9cm）、量筒（100ml）、試管（18×180mm）及塞、吸管（1m1分度0.01，10ml分度0.1）、注射器（20或30ml）、注射針頭、載玻片、蓋玻片、玻璃****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-4消毒缸（帶蓋）。玻璃器皿用前應(yīng)洗滌干凈，無殘留抗菌物質(zhì)。吸管口上端距0.5cm處塞人約2cm的適宜疏松棉花，置吸管桶內(nèi)或牛皮紙袋中。錐形瓶、量筒、試管均應(yīng)加棉塞或硅膠塞，若用振蕩器制備混懸液時，尚需用玻璃紙包裹瓶塞，以免振蕩時供試液污染瓶塞，再用牛皮紙包扎。玻璃器皿，均于160℃干熱滅菌2h或高壓蒸汽12l℃滅菌30min，烘干備用。2.3用具2.3.1大、小橡皮乳頭（放于凈帶蓋的容器中，并應(yīng)定期用70%～75%乙醇溶液浸泡）。2.3.2無菌衣、帽、口罩、手套（洗凈后配套，用牛皮紙包嚴(yán)）滅菌，備用。也可用一次性無菌衣、帽、口罩、手套。2.3.3接種環(huán)（白銥金或鎳鉻合金，環(huán)徑4～5mm、長度6～10cm）、乙醇燈、乙醇棉球或碘伏棉球、滅菌剪刀或滅菌手術(shù)刀和滅菌鑷子、滅菌鋼錐、滅菌稱樣紙、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、白瓷盤、洗手盆、陶瓦蓋（12cm）、實驗記錄紙等。3.試液3.1消毒液3.1.10.1%苯扎溴銨溶液（供洗手、擦拭操作臺面用）。3.1.25%石碳酸溶液（配好后裝入玻璃消毒缸內(nèi)，供消毒帶菌吸管用）亦可選用其他適宜消毒液。3.1.375%乙醇溶液3.1.4碘酊或碘伏溶液3.2稀釋劑和試劑3.2.10.9%無菌氯化鈉溶液（附錄3.1）3.2.2無菌聚山梨酯—803.2.3無菌聚山梨酯—80氯化鈉溶液（附錄3.2）3.2.4無菌磷酸鹽緩沖液（pH7.2）（附錄3.3）3.2.5無菌0.1%氯化三苯四氮唑溶液（TTC）（附錄2.15）****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-54.培養(yǎng)基4.1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（附錄5.2）4.1玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（附錄5.3）4.3酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）瓊脂培養(yǎng)基（附錄5.4）培養(yǎng)基制備應(yīng)注意：4.3.1采用干燥培養(yǎng)基，按說明配制，應(yīng)對滅菌后的培養(yǎng)基PH值進(jìn)行校驗。若為自配培養(yǎng)基，原料應(yīng)挑選，瓊脂凝固力應(yīng)測定，以確定配制時瓊脂用量。試劑規(guī)格應(yīng)為化學(xué)純以上。4.3.2配制的培養(yǎng)基不應(yīng)有沉淀，如有沉淀，應(yīng)于溶化后趁熱過濾，滅菌后使用。4.3.3培養(yǎng)基的分裝量不得超過容器的2/3，以免滅菌時溢出。包裝時，塞子必須塞緊，以免松動或脫落造成染菌。4.3.4培養(yǎng)基配制后應(yīng)在2h內(nèi)滅菌，避免細(xì)菌繁殖。4.3.5滅菌后的培養(yǎng)基在冷暗處保存?zhèn)溆茫胖脮r間不能過長，以免水分散失及染菌。已熔化的培養(yǎng)基應(yīng)一次用完，開啟后不宜再用。4.3.6勿用電爐直接熔化瓊脂培養(yǎng)基，以免營養(yǎng)成份過度受熱而破壞。應(yīng)用水浴或微波爐加熱。5.供試品抽樣、保存及檢驗量5.1抽樣5.1.1一般采用隨機(jī)抽樣方法，抽樣量應(yīng)為檢驗用量（2個以上最小包裝單位）的3倍量（以備復(fù)試）。5.1.2抽樣時，凡發(fā)現(xiàn)有異?；蚩梢傻臉悠?，應(yīng)選取有疑問的樣品，但機(jī)械損傷、明顯破裂的包裝不得作為樣品。5.1.3凡能從藥品、瓶口（外蓋內(nèi)側(cè)及瓶口周圍）外觀看出長螨、發(fā)霉、蟲蛀及變質(zhì)的藥品，可直接判為不合格品，無需再抽樣檢驗。5.2保存****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-65.2.1供試品在檢驗之前，應(yīng)保存在陰涼干燥處，勿冷藏或冷凍，以防供試品內(nèi)污染菌因保存條件不妥引起致死，損傷或繁殖。5.2.2供試品在檢驗之前，應(yīng)保持原包裝狀態(tài)，嚴(yán)禁開啟。包裝已開啟的樣品不得作為供試品。5.3檢驗量5.3.1所有劑型的檢驗量均需取2個以上包裝單位（中藥蜜丸、膜劑，需取自4丸、4片以上）。5.3.2固體及半固體（粘稠性供試品）制劑檢驗量為10g。5.3.3液體制劑檢驗量為10ml。5.3.4膜劑除另有規(guī)定外，中藥膜劑檢驗量為30～50cm2，化學(xué)藥及生化藥膜劑檢驗量為10cm2。5.3.5特殊貴重或微量包裝的藥品，檢驗量可酌減。除另有規(guī)定外，口服固體制劑不低于3g，液體制劑采用原液者不得少于6ml，采用供試液者不得少于3ml，外用藥品不得少于5g。6.操作方法6.1試驗前準(zhǔn)備6.1.1將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、勻漿杯、試管、吸管（1m1、10ml）、量筒、稀釋劑等移至無菌室內(nèi)。每次試驗所用物品必須事先計劃，準(zhǔn)備足夠用量，避免操作中出入操作間。編號后將全部外包裝（牛皮紙）去掉。6.1.2開啟無菌室紫外殺菌燈和空氣過濾裝置，并使其工作不低于30min。6.1.3操作人員用肥皂洗手，關(guān)閉紫外殺菌燈，進(jìn)入緩沖間，換工作鞋。再用0.1%苯扎溴銨溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴無菌衣、帽、口罩、手套。6.1.4操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供試品瓶、盒、袋等的開口處周圍，待干后用滅菌的手術(shù)鑷或剪將供試品啟封。6.2供試液的制備****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-76.2.1液體供試品取供試品10ml，置滅菌錐形瓶中，加入90ml稀釋劑，搖勻，作為1：10供試液。含王漿或蜂蜜的液體制劑和滴眼劑直接用供試品作為供試液。6.2.2固體、半固體或粘稠供試品稱取供試品10g，置于勻漿杯或適當(dāng)滅菌容器中，加入100ml0.9%無菌氯化鈉溶液，用勻漿儀（3000～5000r/，2～4min），振蕩器或乳缽研磨等方法分散混勻。胃溶膠囊加稀釋劑后置45℃土1℃水浴中振搖，腸溶膠囊加無菌磷酸鹽緩沖液后先打碎再置45℃土1℃水浴振搖溶解。6.2.3非水溶性供試品軟膏劑、乳膏劑稱供試品5g（5ml），加入含已滅菌溶化并保溫45℃左右的司盤—805g、單硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯—8010g混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌均勻后，慢慢加入45℃左右的0.9%無菌氯化鈉溶液85ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為供試液（1：20）。油劑取供試品10ml，加入無菌聚山梨酯—805～8ml，搖勻，再加入稀釋劑至100ml。栓劑稱取供試品10g，置滅菌錐形瓶中，加適量稀釋劑，置45℃水浴保溫10min，使溶，加入無菌聚山梨酯—805～8ml，振搖使之乳化，再加稀釋劑（稀釋劑和聚山梨酯—80總量為100ml），搖勻。6.2.4氣霧劑將供試品置冰箱（4—8℃）1h，取出，剛碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供試品開啟部位周圍，然后以無菌鋼錐仔細(xì)鉆孔并插入容器中，勿移出鋼錐，以轉(zhuǎn)動方式使容器內(nèi)拋射劑全部拋出。以無菌注射器吸出全部藥液，按標(biāo)示量補(bǔ)加稀釋劑至足量（若含非水溶性成份，加適量無菌聚山梨酯—80液）此液即為供試品原液。6.2.5膜劑中藥膜劑一般取30～50cm2，將藥膜剪成碎片，置滅菌錐形瓶中，加入稀釋劑100ml，于45℃土1℃水浴中保溫，振搖使溶。西藥藥膜一般取樣為10cm2，制備供試液方法同上。6.2.6茶劑取供試品10g，置滅菌錐形瓶中，加入稀釋劑100ml，振搖30s，以滅菌****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-8紗布過濾（如為袋泡茶，可直接取2袋，以稱樣結(jié)果按1：10加稀釋劑，浸泡30min）。以上供試品如吸水膨脹，或粘度過高，可增加稀釋劑，制成1：20～1：100供試液。6.3供試液的釋?。?0倍遞增稀釋法）6.3.1取2～3支滅菌試管，分別加入9ml滅菌稀釋劑（此時操作一般為：左手執(zhí)試管并將塞打開，傾斜，右手執(zhí)10ml吸管吸量，注意：勿在乙醇燈焰峰正上方操作，以免燈焰將供試液中菌細(xì)胞殺滅）。加完稀釋劑后，試管塞應(yīng)立即塞上。6.3.2另取1支1m1滅菌吸管吸1：10均勻供試液lml，加入裝有9ml滅菌稀釋劑的試管中混勻，即為1：100供試液。以此類推，根據(jù)供試品污染程度，可稀釋至l：102、1：103、1：104等適宜稀釋級（至少共3級）。每遞增1稀釋級，必須另換一支吸管。在作10倍遞增稀釋時，吸管插入第1級稀釋液內(nèi)不低于液面2.5cm，反復(fù)吸吹約10次。吸液時，應(yīng)先吸至高于吸管上部刻度少許，然后提起吸管，貼于試管內(nèi)壁調(diào)整液量至刻度，再沿第2級稀釋管的內(nèi)壁靠近液面（勿接觸液面）緩慢地吹出全部供試液（吸管內(nèi)應(yīng)無粘附或殘留液體），然后將吸管放入消毒液缸內(nèi)。6.4注平皿在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時，以該稀釋級吸管，吸取各級稀釋液各lml至每個滅菌平皿中（從高稀釋級至低稀釋級吸液時可用1支吸管），每一稀釋級注2～3個平皿（此時，一般為左手執(zhí)平皿，將蓋半開，右手執(zhí)吸管），注平皿時，將lml供試液慢慢全部注入平皿中，管內(nèi)無殘留液體，防止反流到吸管尖端部。同時作陰性對照（待各級稀釋液注皿完畢后，用1支lml吸管吸取稀釋劑各1m1，分別注入4個平皿中。其中2個作細(xì)菌數(shù)陰性對照；另2個作霉菌、酵母菌數(shù)陰性對照，如另用YPD瓊脂測定酵母菌數(shù)時，則再增加2個平皿作酵母菌數(shù)陰性對照）。6.5傾注培養(yǎng)基將預(yù)先配制好的培養(yǎng)基（細(xì)菌計數(shù)用營養(yǎng)瓊脂，霉菌、酵母菌計數(shù)一般用玫瑰紅鈉瓊脂，含蜂蜜、王漿液體制劑另加用YPD瓊脂）熔化，冷至約45℃時，傾注上述各個平皿約15ml，以順時針或反時針方向快速旋轉(zhuǎn)平皿混勻，注意，****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-9混勻時切勿將培養(yǎng)基濺到皿邊及皿蓋上，置操作臺上待凝。6.6培養(yǎng)細(xì)菌計數(shù)平板倒置于30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。霉菌、酵母菌計數(shù)平板于25～28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。6.7菌落計數(shù)6.7.1一般將平板置菌落計數(shù)器上或從平板的背面直接以肉眼點(diǎn)計，以透射光襯以暗色背景，仔細(xì)觀察。勿漏計細(xì)小的瓊脂層內(nèi)和平皿邊緣生長的菌落。注意細(xì)菌落與霉菌菌落和酵母菌菌落以及它們與供試品顆粒、培養(yǎng)基沉淀物、氣泡等的鑒別。必要時用放大鏡或用低倍顯微鏡直接觀察或挑取可疑物涂片鏡檢。6.7.2供試品如為微生物制劑，應(yīng)將有效微生物菌落排除，不可點(diǎn)計在細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)內(nèi)。排除的方法需按該制劑微生物品種而定，并須觀察菌落特征及染色形態(tài)。6.7.3供試品稀釋液常含有不溶性原料、輔料，培養(yǎng)基注皿后亦可能產(chǎn)生沉淀物，經(jīng)過培養(yǎng)后有時形成數(shù)量很多且難與菌落肉眼相鑒別的有形物。為了有利于菌落計數(shù)，可在操作時將適宜稀釋級的供試液多增加注皿（1～2個平皿），注皿后不經(jīng)培養(yǎng)而放置于冰箱（勿結(jié)凍）中，在計數(shù)菌落時作為對照?；騽?.001%TTC營養(yǎng)瓊脂注皿，經(jīng)培養(yǎng)后可將細(xì)菌菌落與其他有形物區(qū)別開來。有些軟膏等非水溶性供試品，經(jīng)營養(yǎng)瓊脂注皿后呈乳白色，培養(yǎng)后生長的菌落不易辨認(rèn)和點(diǎn)計，為防止這種情況，也可用0.001%TTC營養(yǎng)瓊脂注皿，經(jīng)培養(yǎng)后生長的菌落為紅色，襯于白色背景上易于點(diǎn)計。6.7.4若干板上有2個或2個以上菌落重疊，肉眼可辨別時仍以2個或2個以上菌落計數(shù)；若平板生長有鏈狀菌落，菌落間無明顯界線，一條鏈作為—個菌落計，但若鏈上出現(xiàn)性狀與鏈狀菌落不同的可辨菌落時，仍應(yīng)分別計數(shù)，若生長蔓延的較大的片狀菌落或花斑樣菌落，一般不宜作為計數(shù)用。6.7.5記錄各稀釋級平板的菌落數(shù)，求出各稀釋級2或3個平板菌落的平均數(shù)。當(dāng)菌落數(shù)在15以上的同稀釋級二平板菌落數(shù)相差1倍時，該稀釋級菌落數(shù)不得作為計數(shù)****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-10依據(jù)；當(dāng)2個平板菌落數(shù)均在15（含15）以下時，兩個平板菌落數(shù)的差值允許范圍為0～4，1～7，2～9，3～10，4～12，5～14，6～15。超出以上范圍即視為操作誤差，不得作為計數(shù)依據(jù)。6.7.6在下列情況下、點(diǎn)計菌落時間需提前或延長培養(yǎng)時間：6.7.6.1菌落生長呈蔓延趨勢者，細(xì)菌點(diǎn)計需在24h，霉菌點(diǎn)計需在48h作初步點(diǎn)計（點(diǎn)計霉菌菌落時，動作宜輕，勿反復(fù)翻轉(zhuǎn)平板或造成震動，使早期形成的孢子散落在平板的其他部位，又萌生新的霉菌菌落，導(dǎo)致計數(shù)誤差）。6.7.6.2在48h點(diǎn)計細(xì)菌，72h點(diǎn)計霉菌時，菌落極小不易辨認(rèn)，需延長培養(yǎng)時間4～7天，再點(diǎn)計菌落數(shù)。6.7.6.3對有疑議的供試品以YPD培養(yǎng)基作酵母菌計數(shù)時，可培養(yǎng)至1周再點(diǎn)計菌落數(shù)。6.7.7供試品按營養(yǎng)瓊脂平板點(diǎn)計細(xì)菌菌落數(shù)；固體供試品按玫瑰紅鈉瓊脂干板點(diǎn)計霉菌數(shù)，一般液體供試品按玫瑰紅鈉瓊脂平板點(diǎn)計霉菌及酵母菌總數(shù)；含蜂蜜及王漿的合劑按玫瑰紅鈉瓊脂平板點(diǎn)計霉菌菌落數(shù)，按YPD瓊脂平板點(diǎn)計酵母菌菌落數(shù)，二者合并為霉菌及酵母菌數(shù)。6.8菌數(shù)報告規(guī)則6.8.1細(xì)菌數(shù)選取平均菌落數(shù)在30～300之間的稀釋級，霉菌、酵母菌數(shù)選取平均菌落數(shù)在30～100之間的稀釋級作為報告菌數(shù)的依據(jù)。如只有1個稀釋級平均菌落數(shù)在30～300（30～100）之間，則將該稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告（見附表例6.8.1）6.8.2如有2個相鄰稀釋級平均菌落數(shù)在30～300（30～100）時，則按比值計算。當(dāng)比值≤2時，則以2個稀釋級的平均菌落數(shù)均值報告。當(dāng)比值>2時，則以低稀釋級的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告（見附表附6.8.2）。****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-116.8.3如有3個稀釋級平均菌落數(shù)均在30～300（30～100）之間時，則以后2個稀釋級計算級間比值報告（同6.8.2），（見附表例6.8.3）。6.8.4如各稀釋級平均菌落數(shù)均在300（100）以上，則按最高稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；如各稀釋級平均菌落數(shù)均在30以下，則按最低稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告（見附表6.8.4）。6.8.5如各稀釋級平均菌落數(shù)均不在30～300（30～100）之間，則以最接近30或300（100）的稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告（見附表6.8.5）。6.8.6如各稀釋級的平均菌落數(shù)均無菌落生長或最低稀釋級平均菌落數(shù)小于1時，應(yīng)報告菌數(shù)為<10個/g或m1（見附表例6.8.6）。如供試品原液平板均未生長霉菌及酵母菌，報告未檢出霉菌及酵母菌/ml。6.5.7當(dāng)各稀釋級平均菌落數(shù)均小于30時，如高稀釋級平均菌落數(shù)大于或等于低稀釋級平均菌落數(shù)時，應(yīng)以培養(yǎng)基稀數(shù)（見附表例6.8.7）。附表：細(xì)菌數(shù)報告規(guī)則舉例規(guī)則原液各稀釋級菌落數(shù)比值菌落數(shù)報告數(shù)1：101：1021：1036.8.1136516420－16400160006.8.22760295461.637750380006.8.22890271602.227100270006.8.3239202351.727600280006.8.3236196422.11960020006.8.4不可計4650513－5130005100006.8.4241912－2402406.8.5不可計30512－30500300006.8.60.500－5<106.8.722270**培養(yǎng)基稀釋法測定****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-12培養(yǎng)基稀稈法：取低稀釋級供試液（原液或1：10供試液）3份，每份各1ml，分別注入5個或5個以上平皿中（每皿0.2ml或<0．2ml），每1個平皿傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml，混勻，凝固后，倒置培養(yǎng)，計數(shù)。5個或5個以上平板點(diǎn)計的菌落之和，即為每1ml菌落數(shù)，共得3組數(shù)據(jù)。以3份低稀釋級供試液菌落數(shù)的平均值乘以稀釋倍數(shù)報告。6.9結(jié)果報告6.9.1菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按實有數(shù)據(jù)報告。6.9.2菌落數(shù)大于100時，取兩位有效數(shù)字報告，第三位按數(shù)字修約規(guī)則處理。6.10復(fù)試供試品細(xì)菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)其中任一項—次檢驗不合格，應(yīng)重新取2倍包裝量供試品，依法作單項復(fù)試兩份，以三次檢驗結(jié)果的均值報告。7.注意事項7.1供試品檢驗全過程必須符合無菌技術(shù)要求。使用滅菌用具時，不能接觸可能污染的任何器物，滅菌吸管不得用口吹吸。7.2從供試品稀釋至傾注瓊脂培養(yǎng)基操作應(yīng)在1h內(nèi)完成，避免由于時間過長導(dǎo)致菌細(xì)胞繁殖或死亡。7.3供試液稀釋及注皿時應(yīng)取均勻的供試液，以免造成實驗誤差。7.4為避免細(xì)菌菌落蔓延生長，宜采取下列方法處理：7.4.1開蓋干燥，將已凝固的瓊脂平板開蓋，倒置斜放于凈化工作臺上，開機(jī)1～2h后合蓋，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；7.4.2換陶瓦蓋將已凝固的瓊脂平板蓋換上新近干熱滅菌的陶瓦蓋。7.4.3加TTC于傾注培養(yǎng)基前，在每1000ml營養(yǎng)瓊脂內(nèi)加入滅菌1%TTC溶液1ml（最終濃度為0．001%），混勻后傾注平皿。7.5一般情況下，以營養(yǎng)瓊脂平板計數(shù)細(xì)菌數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂平板計數(shù)霉菌，酵母菌數(shù)。在特殊情況下，如營養(yǎng)瓊脂平板生長了霉菌、酵母菌，且多于玫瑰紅鈉瓊脂平板的霉菌和酵母菌菌落數(shù)，則以營養(yǎng)瓊脂平板的霉菌、酵母菌數(shù)報告；反之，如玫瑰紅鈉瓊脂平板生長了細(xì)菌，且多于營養(yǎng)瓊脂平板的細(xì)菌菌落數(shù)，則以玫瑰紅鈉瓊脂平板的細(xì)菌數(shù)報告。如營養(yǎng)瓊脂平板生長的霉菌、酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂平板****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-13生長的細(xì)菌菌落數(shù)超過該品種：微生物限度規(guī)定時，經(jīng)復(fù)試2次，如3次結(jié)果的平均值仍超過規(guī)定，應(yīng)判供試品不合格。8.檢驗報告書寫本品按品按法際準(zhǔn)檢驗，結(jié)果符合或不符合規(guī)定。附表：細(xì)菌、霉菌、酵母菌形態(tài)特征比較（營養(yǎng)瓊脂及玫瑰紅鈉瓊脂平板）細(xì)菌霉菌酵母菌菌落大小差別很大，在同一平板上可出現(xiàn)針尖大小至大于100mm菌落。一般較大，亦有細(xì)小的菌落。在同一平板上生長的菌落大小有時不一致。多數(shù)直徑為1～2mm，在同一平板上生長的菌落大小有時不一致。外觀形態(tài)多樣，小而突起或大而扁平。多為圓形，有的蔓延生長為無定形。培養(yǎng)基表面生長者多為圓形，內(nèi)層生產(chǎn)長者為圓形、鐵餅、紡錘或三角形色澤白、灰白或無色，亦有淡褐、淡黃及淡紅色，菌落正反面顏色相同。小菌落灰白，大菌落形成孢子后顏色多樣。菌落正反面顏色不同。乳白或粉紅色多見，在同一平板上色調(diào)較單透明度透明或不透明小菌落半透明有明顯折光性，大菌落不透明。透明較差邊緣整齊或不整齊，有放射線狀、樹枝狀、鋸齒狀、卷發(fā)狀、低倍鏡下一般見不到邊緣。菌絲體構(gòu)成，多呈放射狀整齊、低倍下可見球狀，卵圓狀或假菌絲狀，細(xì)胞細(xì)密排列。氣味一般有臭味往往有霉味多帶酒香味與培養(yǎng)基結(jié)合不結(jié)合結(jié)合較牢固，不易挑起。不結(jié)合，易挑起。生長速度一般很快較慢較快細(xì)胞形態(tài)球或桿狀，細(xì)小均一，高倍鏡或油鏡下可觀察形態(tài)。菌絲體相互交織，成熟霉菌常有產(chǎn)孢組織及孢子。多數(shù)為圓或卵圓形，常有芽體相連排列單個、分散或有一定的排列方式。絲狀交織單個分散****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-14大腸桿菌檢查法1.簡述大腸桿菌即大腸埃希菌（Escherichiacoli），為腸桿菌科埃希菌屬的模式種。埃希菌屬除大腸埃希菌外，新近發(fā)現(xiàn)有非脫羧希菌等四個種。大腸埃希菌是人和溫血動物腸道內(nèi)的棲居菌，隨糞便排出體外。在藥品中檢出大腸桿菌，表明該樣品受到人和溫血動物的糞便污染，即可能污染腸道道病原體。大腸埃希菌除普通大腸桿菌外尚有致病性大腸桿菌，可引起嬰幼兒、成人爆發(fā)性腹瀉。為保證人體健康，口服藥品必須檢查大腸桿菌。用4-甲基傘形酮葡糖苷酸（4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，即MUG）和靛基質(zhì)（Indole）試驗檢查大腸桿菌是一項新技術(shù)，其檢驗步驟為：增菌培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)種MUG蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，多數(shù)情況下不需要從混合菌中分離單個菌，如MUG、Indole試驗為陽性或陰性即可報告結(jié)果，如MUG與Indole試驗不一致時，則需分離培養(yǎng)、革蘭染色、鏡檢及生化試驗鑒別。原理：利用目標(biāo)菌限定酶作用的底物的水解產(chǎn)物，產(chǎn)生顏色或熒光反應(yīng)作為指示系統(tǒng)來鑒定目標(biāo)菌。實驗證明96%的大腸桿菌含β-葡糖苷酸酶（β-glucuronidase，CUD），約10%的沙門菌屬一些菌種也含有此酶。MUG被GUD水解，產(chǎn)生熒光，由于熒光反應(yīng)的敏感度較顏色反應(yīng)強(qiáng)千萬倍，易于觀察，沒有主觀性，因而用MUG鑒定大腸桿菌已被廣泛應(yīng)用于臨床、食品、飲水、污水等的檢測。單一的MUG鑒別大腸桿菌其漏檢率達(dá)6%，鑒于98%的大腸桿菌靛基質(zhì)試驗為陽性，故將MUG-靛基質(zhì)試驗結(jié)合，用EMB瓊脂平板分離，輔以IMViC試驗，在理論上可使大腸桿菌的檢出率達(dá)99%。2.儀器、設(shè)備及用具2.1無菌室[參照細(xì)菌、霉菌（酵母菌）計數(shù)2.1.1]2.2凈化工作臺2.3恒溫培養(yǎng)基箱（36±1℃）****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-152.4高壓蒸汽滅菌器2.5顯微鏡（1500×）2.6微波爐或其他適宜加熱裝置。2.7水浴箱45±1℃2.8離心機(jī)（500～4000/min）2.9薄膜過濾裝置微孔濾膜直徑約50mm，孔徑0.45±0.02μm2.10電冰箱2.11勻漿儀2.12366nm紫外燈2.13玻璃器皿[參照細(xì)菌、霉菌（酵母菌）計數(shù)2.2.2]3.試液指示液3.10.9%無菌氯化鈉溶液[附錄3.1]3.2無菌磷酸鹽緩沖溶液（pH7.2）[附錄3.3]3.3無菌對氨基苯甲酸溶液[附錄2.2]3.4無菌聚山梨酯80氯化鈉溶液[附錄3.2]3.5歐-波（Ehrlich-Boehme）試液[附錄2.17]3.6甲基紅試液[附錄4.2]3.7V-P試液[附錄2.11，2.13]3.8革蘭染色液[附錄2.4，2.10，2.16]3.9中性紅指示液[附錄4.1]3.10亞甲藍(lán)指示液[附錄4.3]3.11溴麝香草酚藍(lán)指示液[附錄4.6]3.12酸性品紅指示液[附錄4.7]3.13曙紅鈉指示液[附錄4.9]4.培養(yǎng)基****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-164.1營養(yǎng)肉湯[附錄5.1]4.2營養(yǎng)瓊脂[附錄5.2]4.3膽鹽乳糖(BL)培養(yǎng)基[附錄5.6]4.44－甲基傘形酮葡糖苷酸蛋白胨培養(yǎng)基[附錄5.7]4.5乳糖培養(yǎng)基、5%乳糖培養(yǎng)基[附錄5.21，5.22]4.6蛋白胨水培養(yǎng)基[附錄5.18]4.7磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基[附錄5.19]4.8枸櫞酸鹽培養(yǎng)基[附錄5.20]4.9曙紅亞甲藍(lán)（EMB）瓊脂[附錄5.8]4.10麥康凱瓊脂[附錄5.9]5.對照用菌液取大腸桿菌[CMCC（B）44102]的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，接種至5ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，36±1℃培養(yǎng)18～24h后，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至1：106，使對照菌液加入量含菌50～100個（一般用量為0.1ml），其菌數(shù)在做陽性對照的同時用營養(yǎng)瓊脂注皿或平板涂布，經(jīng)培養(yǎng)后計數(shù)確定。6.準(zhǔn)備6.1供試品的檢驗量[見細(xì)菌、霉菌（酵母菌）計數(shù)5.3]6.2供試液的制備6.2.1液體供試品[見細(xì)菌、霉菌（酵母菌）計數(shù)6.2.1]6.2.2固體、半固體或粘稠液供試品[見細(xì)菌、霉菌（酵母菌）計數(shù)6.2.2]6.2.3非水溶性供試品[見細(xì)菌、霉菌（酵母菌）計數(shù)6.2.3]6.2.4含抑菌成分供試品供試品按常規(guī)檢查法，加入規(guī)定量的對照菌。不能檢出時，該供試液須按以下方法之一或兩種以上方法聯(lián)合處理后，依法檢查。同時做陽性和陰性對照。6.2.4.1稀釋法取規(guī)定量的供試液種入較大體積的培養(yǎng)基中，使該供試液稀釋至不****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-17具抑菌作用的濃度。6.2.4.2離心沉淀集菌法取規(guī)定量的供試液于無菌刻度離心管中，3000r/min離心30min，移去上清液，留底部集菌液約2ml，并稀釋該供試液至原規(guī)定量。如有不溶性藥渣，可先以500r/min離心5min，取全部上層液，再按上述方法集菌處理。6.2.4.3薄膜過濾法取規(guī)定量的供試液于稀釋劑100ml中，搖勻，以無菌操作加入裝有直徑約50mm、孔徑不大于0.45±0.02μm微孔濾膜的薄膜過濾器內(nèi)，過濾，用稀釋劑沖洗濾膜，每次不少于100ml，將培養(yǎng)基加入濾器或取出濾膜，加入增菌培養(yǎng)基中。6.2.4.4中和法取規(guī)定量含磺胺類的供試品，于100ml增菌液（含1%對氨基苯甲酸約1～5ml）中：含砷、汞類的供試品，于硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基100ml中；含洗必泰供試品，于含適量聚山梨酯80等表面活性劑的100ml增菌液中（表面活性劑的用量應(yīng)預(yù)試，用量過大有抑菌作用）。供試品供試液BL增菌培養(yǎng)液MUG蛋白胨EMB或麥康凱瓊脂平板MUG陽性、靛基質(zhì)陽性；供試品供試液BL增菌培養(yǎng)液MUG蛋白胨EMB或麥康凱瓊脂平板MUG陽性、靛基質(zhì)陽性；MUG陰性、靛基質(zhì)陰性；MUG陽性、靛基質(zhì)陰性；MUG陰性、靛基質(zhì)陽性；報告疑似菌落純培養(yǎng)革蘭染色、乳糖、靛基質(zhì)、甲基紅、V-P、枸椽酸鹽利用報告36±1℃18～24h5、24h36±1℃36±1℃18～24h18～24h36±1℃36±1℃24～48h7.操作步驟7.1檢驗程序 ****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-187.2增菌培養(yǎng)取膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基3瓶，每瓶各100ml。2瓶分別加入規(guī)定量的供試液，其中1瓶加入對照菌50～100個作陽性對照，第3瓶加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對照。37℃培養(yǎng)18～24h（必要時可延至48h）。陰性對照應(yīng)無菌生長。搖勻上述BL增菌培養(yǎng)液，以滅菌吸管取供試品膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)液、供試品陽性對照培養(yǎng)液、陰性對照培養(yǎng)液各0.2ml，分別加入MUG－蛋白胨培養(yǎng)基（培養(yǎng)基5.7）管，37℃培養(yǎng)4、24h后，將各管置366nm紫外燈下觀察有無藍(lán)白色熒光，然后加歐－波試液4～5滴于上述MUG管內(nèi)，觀察液面顏色。MUG陽性（有熒光）、靛基質(zhì)陽性（玫瑰紅色），報告檢出大腸桿菌；MUG陰性（無熒光）、靛基質(zhì)陰性（無色），報告未檢出大腸桿菌。7.3分離培養(yǎng)如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性時，將上述供試品BL增菌培養(yǎng)液輕輕搖動，以接種環(huán)沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液劃線于EMB或麥康凱瓊脂平板上，培養(yǎng)18～24h，觀察EMB或麥康凱瓊脂平板有無可疑大腸桿菌菌落生長。當(dāng)陽性對照的平板呈典型菌落生長時，供試品分離平板無菌落生長，或有菌落但不同于表1所列特征，可判為供試品1g或1ml未檢出大腸桿菌。表1大腸桿菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂(EMB)典型菌落呈紫黑色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，有金屬光澤。非典型菌落呈淺紫色、粉紅色，或菌落中心紫色或無明顯暗色中心，無金屬光澤。麥康凱瓊脂典型菌落呈鮮桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤。非典型菌落呈微紅色，或菌落中心呈紅色。當(dāng)陽性菌對照平板未生長或生長菌落經(jīng)檢查不是大腸桿菌，應(yīng)研究原因，重新試驗或重新制備供試液，以消除供試品抑菌成分的影響。有疑似菌落生長者，挑取可疑菌落做革蘭染色、鏡檢、IMViC試驗。7.4純培養(yǎng)如生長菌落與表1所列特征相符或疑似者，以接種針輕輕接觸單個疑似****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-19菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑選2～3個以上疑似菌落，分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)18～24h，作以下檢查。如平板上無單個可疑菌落，但有可疑菌團(tuán)（紫黑色，或有金屬光澤），應(yīng)沾取可疑團(tuán)培養(yǎng)物少許，或重新取增菌培養(yǎng)液劃線接種于EMB瓊脂平板，培養(yǎng)18～24h，再挑選單個疑似菌落，純培養(yǎng)，作以下檢查。7.5革蘭染色、鏡檢。7.5.1以接種環(huán)沾取無菌水于潔凈載玻片上，取上述疑似菌落的營養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許，制成均勻涂片，自然或微溫干燥，再通過火焰2～3次（載玻片不燙手）固定。7.5.2滴加結(jié)晶紫染液，染色1min，水洗。7.5.3滴加碘液，媒染1min，水洗，以濾紙吸干余水。7.5.4滴加95%乙醇，脫色20～30s，水洗。7.5.5滴加沙黃染液，復(fù)染1min，待干后，鏡檢。7.5.6染色結(jié)果革蘭陽性菌呈藍(lán)紫色；革蘭陰性菌呈紅色。大腸桿菌為革蘭陰性短桿菌，或球桿菌狀，亦有桿菌狀。7.5.7注意事項：7.5.7.1玻片必須潔凈，涂片菌量宜少，菌不可濃。否則，菌細(xì)胞成堆或連成片。染色反應(yīng)難于判斷，菌細(xì)胞形態(tài)難于觀察。7.5.7.2培養(yǎng)物的菌齡以16～24h為宜。培養(yǎng)時間過長的革蘭陽性菌易染成紅色。7.5.7.3脫色是關(guān)鍵，脫色時間不足菌細(xì)胞易染成陽性，脫色時間過長易染成陰性。8.生化試驗8.1乳糖發(fā)酵試驗取上述斜面培養(yǎng)物，接種于乳糖發(fā)酵管，培養(yǎng)24～48h，觀察產(chǎn)酸（指示劑為酸性品紅者為紅色；指示劑為溴麝香草酚藍(lán)者為黃色），產(chǎn)氣（小倒管內(nèi)有氣泡，氣泡無論大?。楸苊膺t緩發(fā)酵乳糖產(chǎn)生假陰性，亦可接種5%乳糖發(fā)酵管。絕大多數(shù)遲緩發(fā)酵乳****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-20糖的細(xì)菌，可于24h出現(xiàn)陽性?；蜻m當(dāng)延長培養(yǎng)時間。8.2靛基質(zhì)試驗（I）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白胨水培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～48h，沿管壁加入歐-波試液數(shù)滴，輕輕搖動試管，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。98%的大腸桿菌靛基質(zhì)試驗為陽性。一般24h即可出現(xiàn)陽性結(jié)果，以無菌操作先從管中取出1或2ml培養(yǎng)液進(jìn)行檢查，如靛基質(zhì)是陰性，余下的蛋白胨水培養(yǎng)物再培養(yǎng)24h，作靛基質(zhì)試驗。8.3甲基紅試驗（M）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2h，于培養(yǎng)液中加入甲基紅指示液2～3滴（約每ml培養(yǎng)液加指示液1滴），輕微搖動，立即觀察，呈鮮紅色或桔紅色為陽性，呈黃色為陰性。8.4乙酰甲基甲醇生成試驗（V-P）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2h，于2ml培養(yǎng)液中加入a-萘酚乙醇試液1ml，混勻，再加40%氫氧化鉀試液0.4ml，充分振搖，在4h（通常在30min）內(nèi)出現(xiàn)紅色應(yīng)陽性，無紅色反應(yīng)為陰性。8.5枸櫞酸鹽利用試驗（C）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)2～4天，培養(yǎng)基斜面有菌苔生長，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色時為陽性，培養(yǎng)基顏色無改變、無菌苔生長為陰性。9.結(jié)果判斷9.1當(dāng)陰性對照試驗呈陰性，陽性對照試驗MUG呈陽性，供試品MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，報告1g或1ml供試品檢出大腸桿菌。MUG陰性、靛基質(zhì)陽性，報告報告1g或1ml供試品檢出大腸桿菌。9.2MUG陽性、靛基質(zhì)陰性、IMViC試驗為－+――、革蘭陰性桿菌，報告1g或1ml供試品檢出大腸桿菌；MUG陰性、靛基質(zhì)陽性、IMViC試驗為++――、革蘭陰性桿菌，報告1g或1ml供試品檢出大腸桿菌。9.3供試品培養(yǎng)物檢查不符合9.2二項中的任一項，報告1g或1ml供試品未檢出大腸桿菌。****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-219.4當(dāng)陰性對照有菌生長或陽性對出檢驗報告。10.注意事項：10.1MUG法不必從混合菌中分離單個菌落。除大腸埃希菌外，尚有部分志賀菌屬、沙門菌屬的菌株；以及少數(shù)革蘭陽性球菌、桿菌和芽孢菌，其MUG為陽性。因此，在MUG培養(yǎng)基成分中增加了去氧膽酸鈉，可排除革蘭陽性菌的干擾。至于志賀菌、沙門菌在膽鹽乳糖培養(yǎng)基中較難生長，即使有生長，本法能檢出。既然藥品中不得檢出大腸桿菌，更不允許檢出志賀菌、沙門菌。10.2配制MUG培養(yǎng)基時，務(wù)必校正pH值，滅菌后pH不得過7.4，否則pH值偏高，MUG分解，本身則顯熒光；分裝MUG培養(yǎng)基的試管應(yīng)挑選，試管、蛋白胨不得顯熒光。10.3培養(yǎng)時間供試品培養(yǎng)液接種于MUG培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間，一般在4h、24h觀察是否產(chǎn)生熒光，如熒光很微弱，不能準(zhǔn)確判斷時，可延長培養(yǎng)至48h再觀察結(jié)果。由于大腸埃希菌各菌株間的GUD的活性不完全相同，對底物和底物的濃度反應(yīng)的差異；培養(yǎng)基中選擇因子的影響；培養(yǎng)時間、溫度；pH的改變；大量競爭菌和樣品本身物質(zhì)成分的干擾等，對結(jié)果的判斷亦有影響。10.4結(jié)果觀察取供試品的MUG試驗管、陽性對照管、陰性對照管同時在366nm紫外燈下觀察，陽性對照管應(yīng)有較強(qiáng)藍(lán)白色熒光，陰性對照管無熒光。供試品MUG管是否有熒光，應(yīng)仔細(xì)觀察比較，或?qū)⒏鞴苷{(diào)換位置（陰性管居中），適當(dāng)傾斜試管。如陽性對照管熒光強(qiáng)烈，影響供試品管與陰性對照管的觀察時，亦或移去陽性對照管。10.5藥品中污染的大腸桿菌，易受生產(chǎn)工藝及藥物的影響。在曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或表康凱瓊脂平板上的菌落形態(tài)特征時有變化，挑取可疑菌落往往憑經(jīng)驗，主觀性較大，務(wù)必挑選2～3個以上菌落分別做IMViC試驗鑒別，挑選菌落越多，檢出陽性菌的機(jī)率越高，如反挑選一個菌落做IMViC試驗鑒別，則易漏檢。10.6在IMViC試驗中，以滅菌接種針沾取菌苔，首先接種于枸櫞酸鹽瓊脂斜面上，然后接種于蛋白胨水培養(yǎng)基、磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中。切勿將培養(yǎng)基帶入枸櫞酸鹽瓊脂斜面上，以免產(chǎn)生假陽性結(jié)果。****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-22枸櫞酸鹽利用試驗培養(yǎng)時間，原訂為2天，根據(jù)試驗資料，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)3天后，枸櫞酸鹽利用試驗產(chǎn)生陽性。僅培養(yǎng)2天是不夠的，故試驗培養(yǎng)時間改為2～4天。10.7陽性對照試驗是檢查供試品是否有抑菌作用及培養(yǎng)條件是否適宜。陽性對照菌液的制備、計數(shù)及加入含供試品的培養(yǎng)基中等操作，不能在檢測供試品的無菌室或凈化臺上進(jìn)行，必須在單獨(dú)的隔離間或凈化臺操作，以免污染供試品及操作環(huán)境。10.8在各類供試品中檢測大腸桿菌及其他控制菌，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再抽樣復(fù)驗。檢出大腸桿菌及其他控制菌培養(yǎng)物須保留1個月，備查。沙門菌檢查法1.簡述沙門菌屬是腸桿菌科的重要致病菌，按Bergey系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊第一卷（1984），沙門菌分5個亞屬，包括常見的傷寒、甲型副傷寒、乙型副傷寒、丙型副傷寒、鼠傷塞，豬霍亂等沙門菌在內(nèi)，迄今已發(fā)現(xiàn)2000多個菌型。藥品中沙門菌，是以鑒定沙門菌屬為準(zhǔn)，即對每g（或ml）藥品中是否檢出沙門菌作出檢驗報告。由于沙門菌菌型繁多，各菌型的生化及血清學(xué)特性雖密切相關(guān)，卻不盡相同，采用一種增菌培養(yǎng)基和兩種分離培養(yǎng)基，不可能是所有沙門菌的最適增菌及分離條件。此外，由于藥品在生產(chǎn)過程中，常受到加熱、干燥等加工步驟影響，藥品中污染的沙門菌可受到損傷或呈體眠狀態(tài)，故須在增菌培養(yǎng)前先進(jìn)行預(yù)增菌。然后再進(jìn)行增菌及分離、三糖鐵瓊脂初步鑒別、生化試驗、血清學(xué)試驗等步驟。2.儀器在、設(shè)備及用具（見大腸桿菌檢查法2）3.試液指示液（參見大腸桿菌檢查法3）3.1無菌脲試液[附錄2.5]3.2酚磺酞指示液[附錄4.4]3.3亮綠試液[附錄2.9]3.4氰化鉀試液[附錄2.14]3.5溴甲酚紫指示液[附錄4.5]****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-233.6革蘭染色液[附錄2.4，2.10，2.16]3.7沙門菌改進(jìn)屬A～F“0”多價血清（0多價1）生物制品研究所供應(yīng)4.培養(yǎng)基4.1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[附錄5.2]4.2營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基[附錄5.1]4.3半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(TTB)[附錄5.3]4.4曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB)[附錄5.8]4.5麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MacC)[附錄5.9]4.6四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基(TTB)[附錄5.11]4.7 三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基(TSI)[附錄5.10]4.8膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基(DHL)[附錄5.13]4.9沙門菌屬志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基(S.S)[附錄5.12]4.10蛋白胨水培養(yǎng)基[附錄5.18]4.11脲(尿素)瓊脂培養(yǎng)基[附錄5.23]4.12氰化鉀培養(yǎng)基[附錄5.24]4.13賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基[附錄5.25]5.對照用菌液取乙型副傷寒沙門菌[CMCC(B)50094]的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，接種至5ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，36±1℃培養(yǎng)18～24h后，用0.9%無菌氯化鈉溶液釋至1：106（50～100個菌/0.1ml），作陽性對照用菌液。其菌液濃度可用平板菌落計數(shù)法測得。即取0.1ml加入平皿內(nèi)，傾注營養(yǎng)瓊脂，混勻，或以0.1ml均勻涂布于事先準(zhǔn)備好的營養(yǎng)瓊脂平板上，經(jīng)培養(yǎng)后點(diǎn)計求得。6.操作方法6.1準(zhǔn)備工作：[見細(xì)菌、霉菌（酵母菌）計數(shù)6.1]6.2供試液的制備：[見細(xì)菌、霉菌（酵母菌）計數(shù)6.2]****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-24含抑菌成分供試品供試液的制備：（見大腸桿菌檢查法6.2.4）6.3增菌培養(yǎng)6.3.1預(yù)增菌取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基3瓶，每瓶各100ml，2瓶加入1：10供試液各10ml，其中1瓶加入對照菌液0.1ml（含菌50～100個）作陽性對照，第3瓶加入稀釋劑10ml作陰性對照，培養(yǎng)18～24h后觀察。搖動陰性對照瓶后應(yīng)清亮透明，無菌生長，否則試驗無效。6.3.2增菌培養(yǎng)輕微搖動供試品增菌培養(yǎng)瓶和陽性對照培養(yǎng)瓶，分別吸取1ml接種于各1管四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24h。陽性對照管應(yīng)呈現(xiàn)混濁。6.4分離培養(yǎng)輕微搖動供試品增菌培養(yǎng)瓶和陽性對照增菌培養(yǎng)瓶，以接種環(huán)分別沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液接種于膽鹽硫乳瓊脂（DHL）或沙門菌志賀菌瓊脂（S.S）平板及曙紅亞甲藍(lán)（EMB）瓊脂或麥康凱瓊脂平板各1個，倒置培養(yǎng)24～48h。檢查平板上有無疑似沙門菌菌落。沙門菌在上述平板上的菌落形態(tài)特征見表。沙門菌的菌落特征平板沙門菌屬亞屬ⅠⅡⅣⅤ沙門菌亞屬Ⅲ膽鹽硫乳瓊脂（DHL）無色或微帶橙色，透明或半透明，邊緣整齊、光滑、中等大小或較小，產(chǎn)H2S的菌落中心或幾乎全黑色。發(fā)酵乳糖的菌株菌落為粉紅色，中心帶黑色，遲緩發(fā)酵乳糖或不發(fā)酵乳糖的菌株菌落與亞屬ⅠⅡⅣⅤ同沙門菌屬志賀菌屬瓊脂（S.S）無色或微帶粉色，透明或半透明，邊緣整齊、光滑、中等大小或較小，產(chǎn)H2S的菌落，中心呈黑色。同一平板上常有多數(shù)菌落無黑色中心同膽鹽硫乳瓊脂平板。但發(fā)酵乳糖無黑色中心的菌落與大腸埃希菌不能區(qū)別****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-25曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB）無色或微帶橙色，透明或半透明，中等大小，邊緣整齊光滑發(fā)酵乳糖的菌落為紫色。遲緩發(fā)酵乳糖或不發(fā)發(fā)酵乳糖的菌株與沙門菌亞屬ⅠⅡⅣⅤ麥康凱瓊脂（MacC）同曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板發(fā)酵乳糖的菌株菌落為粉紅色，不發(fā)酵乳糖或遲緩發(fā)酵乳糖的菌株與沙門菌亞屬ⅠⅡⅣⅤ同由于沙門菌不發(fā)酵乳糖和蔗糖，不產(chǎn)酸，菌落不著色，一般為無色透明，多數(shù)沙門菌因產(chǎn)生H2S，菌落中心呈現(xiàn)黑色甚至全黑色，在DHL瓊脂平板上較為明顯。在SS瓊脂平板上，H2S特征有時不明顯，沙門菌屬Ⅲ因多數(shù)菌株發(fā)酵乳糖，故在上述平板上的乳糖發(fā)酵菌落呈現(xiàn)粉紅或紫色，但由于產(chǎn)生H2S,在有H2S指示系統(tǒng)的平板上仍出現(xiàn)黑色中心。在上述培養(yǎng)基上，有些非沙門菌屬細(xì)菌，也可呈現(xiàn)類似沙門菌菌落形態(tài)，須進(jìn)一步鑒別。陽性對照平板上，應(yīng)有沙門菌落形態(tài)特征的菌落生長，否則，應(yīng)查明原因。若為供試品抑菌成分所致，須重新制備供試液，消除抑菌成分影響后再行檢查。如陽性對照平板有典型菌落生長，供試品平板均未生長或無疑似菌落生長，則報告1g或1ml供試品未檢出沙門菌。由于藥物的影響或非典型菌株的存在，沙門菌菌落可呈現(xiàn)非典型形態(tài)，如色澤變深，菌落粗糙等，應(yīng)注意辨別。6.5初步鑒別試驗從每個供試品的分離平板上挑取2-3個疑似菌落（無色或微帶橙色，產(chǎn)H2S的菌落；無色或微帶橙色、不產(chǎn)H2S的菌落；紅色，產(chǎn)H2S的菌落）分別接種于三糖鐵瓊脂斜面，接種時應(yīng)以接種針輕輕接觸單個菌落中心部位，沾取培養(yǎng)物劃線于斜面并穿刺****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-26底層再劃斜面，培養(yǎng)24±2h，觀察結(jié)果。疑似沙門菌在三糖鐵瓊脂瓊斜面上的反應(yīng)為：①斜面紅色（產(chǎn)堿），底層黑色（產(chǎn)H2S）并顯示黃色（產(chǎn)酸）；②斜面紅色，底層黃色；③斜面黃色，底層黑色，并顯示黃色。多數(shù)沙門菌在三糖鐵瓊脂上產(chǎn)生氣體，使底層瓊脂出現(xiàn)氣泡或使瓊脂斷裂，但也有不產(chǎn)生氣體的菌種。對在三糖鐵瓊脂斜面黃色并同時底層無黑色，或斜面及底層均為紅色者可以排除沙門菌。將疑似沙門菌的三糖鐵瓊脂或營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作生化試驗，血清學(xué)凝集試驗及革蘭染色，鏡檢。沙門菌為革蘭陰性桿菌。6.6生化試驗6.6.1靛基質(zhì)試驗用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，接種到蛋白胨水培養(yǎng)基中，照大腸桿菌檢查法靛基質(zhì)試驗項下操作、判斷結(jié)果。沙門菌應(yīng)為陰性反應(yīng)。6.6.2脲酶試驗用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，劃線接種于脲瓊脂斜面，培養(yǎng)4及24h，觀察結(jié)果，紅色為陽性反應(yīng)，沙門菌屬為陽性反應(yīng)。6.6.3氰化鉀試驗將培養(yǎng)物先接種至營養(yǎng)肉培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h，用接種環(huán)沾取培養(yǎng)液1環(huán)，接種至氰化鉀培養(yǎng)基內(nèi)，另取一環(huán)培養(yǎng)液接種于不含氰化鉀的同樣培養(yǎng)基內(nèi)作對照管，接種后即以橡膠塞塞緊，培養(yǎng)24-48h，觀察結(jié)果。對照管內(nèi)有菌生長（混濁），而試驗管也有菌生長為陽性反應(yīng)；對照管有菌生長（混濁）而試驗管也有菌生長（清亮）為陰性反應(yīng)。沙門菌應(yīng)為陰性反應(yīng)。本試驗應(yīng)十分注意密封管口，夏天分裝培養(yǎng)基宜在冰浴中進(jìn)行，防止氰化鉀分解，產(chǎn)生氫氰酸逸出，致使培養(yǎng)基內(nèi)氰化鉀濃度降低，不能抑制細(xì)菌生長，造成假陽性。氰化鉀劇毒品、操作時須謹(jǐn)慎，切勿用口吸液。用后的培養(yǎng)基每管加樹數(shù)粒硫酸亞鐵和20%氫氧化鉀0.5ml去毒。然后再滅菌、洗滌。6.6.4賴氨酸脫羧酶試驗用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，接種在賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基中，同時接種一支不含賴氨酸的同樣培養(yǎng)基作為對照管，培養(yǎng)24-48h觀察結(jié)果。對****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-27照管黃色（產(chǎn)酸），試驗管呈紫色為陽性反應(yīng)（賴氨酸脫羧產(chǎn)堿）；試驗管黃色為陰性反應(yīng)。沙門菌因為陽性反應(yīng)。6.6.5動力試驗用接種針沾取培養(yǎng)物，穿刺接種于半固體營養(yǎng)瓊脂管中，培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。有動力的細(xì)菌能在穿刺線以外的培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)散生長，使培養(yǎng)基呈混濁現(xiàn)象；無動力的細(xì)菌僅能沿穿刺線長，不向外擴(kuò)散，培養(yǎng)基仍呈清晰透明狀；無動力表現(xiàn)的培養(yǎng)物，應(yīng)在室溫保留2-3天后，再行觀察。沙門菌除雞雛沙門菌及無動力的變種外，均具有周身鞭毛，能運(yùn)動。沙門菌生化反應(yīng)的初步鑒別見表。沙門菌與有關(guān)細(xì)菌在三糖鐵瓊脂及初步生化試驗的鑒別序號三糖鐵瓊脂靛基質(zhì)脲酶氰化鉀賴脫氨羧酸酶判定菌屬斜面底層產(chǎn)氣硫化氫1.11.2-+++++++------++沙門菌屬沙門菌屬Ⅲ2-++++--+沙門菌屬緩慢愛德華菌屬3.13.2+/--++++S++--++++--弗勞地檸檬酸桿菌奇異變形桿菌4+++S++++-普通變形桿菌5.15.25.3+--+++++-------------+/-+-大腸埃希菌沙門菌屬、大腸埃希菌志賀菌屬、大腸埃希菌6.16.26.3+--++++-----+++------+/-+-大腸埃希菌大腸埃希菌志賀菌屬、大腸埃希菌7.17.2++/-++++/-----+-/+++-+陰溝腸桿菌、弗勞地檸檬酸桿菌肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌蜂窩哈夫尼亞屬、粘質(zhì)沙門菌8-++S/--++/-+-普羅菲登斯菌屬、摩根菌屬****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-28+產(chǎn)酸（黃色）-多數(shù)陽性、少數(shù)陰性+S產(chǎn)生少量氣體。反應(yīng)序號1除典型反應(yīng)外，脲酶、氰化鉀試驗、賴氨酸脫羧酶試驗三項中有一項異常；反應(yīng)序號2僅靛基質(zhì)陽性；反應(yīng)序號5.2不產(chǎn)H2S，可結(jié)合血清學(xué)凝集試驗，或加做部分生化試驗，判定為沙門菌。其他情況可排除沙門菌。6.7血清學(xué)凝集試驗沙門菌菌型繁多?？乖N類復(fù)雜，不少抗原與屬外抗原關(guān)系密切，對一種沙門菌型鑒定較為困難。根據(jù)調(diào)研數(shù)據(jù)，95%以上的沙門菌屬于A-F六個0群，常見的菌型約20個左右，故選用0多價1血清做凝集試驗。6.7.1準(zhǔn)備1片潔凈的滅菌載玻片，在近中央的一端，以直徑3mm接種環(huán)沾取0多價1血清2-3環(huán)制成與玻片橫徑相垂直的條形涂沫，長約1.5cm，寬約0.5cm。6.7.2用接種環(huán)挑取三糖鐵瓊脂斜面或營養(yǎng)瓊脂斜面的新鮮培養(yǎng)物少許，在血清中混勻。菌量要適當(dāng)，勿過濃。6.7.3將玻片前后傾斜數(shù)次，以暗色背景襯底，在良好的照明條件下進(jìn)行觀察，任何程度的凝集現(xiàn)象都是陽性反應(yīng)。陽性反應(yīng)通常在3min內(nèi)發(fā)生。有時因血清效價低、反應(yīng)遲緩時，應(yīng)將玻片置培養(yǎng)皿內(nèi)，并放一個濕棉球在旁邊，蓋上皿蓋，經(jīng)約20min，再觀察結(jié)果。對出現(xiàn)凝集現(xiàn)象的待檢培養(yǎng)物，應(yīng)以0.9%無菌氯化鈉溶液代替血清，與培養(yǎng)物混勻作對照試驗，對照無凝集現(xiàn)象，方可按陽性反應(yīng)報告。如試驗及對照試驗均出現(xiàn)凝集現(xiàn)象為非特異反應(yīng)，須對該菌株培養(yǎng)物進(jìn)行處理后再作凝集試驗。6.7.4當(dāng)培養(yǎng)物與0多價1血清未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象時，應(yīng)以接種環(huán)取上述斜面培養(yǎng)物，置于含少量0.9%無菌氯化鈉溶液的試管中，制成濃菌懸液，在100℃水浴中保溫30min，以除去可能存在的Vi抗原，待冷后再以此處理后的菌懸液與沙門菌0多價1血清按上法作凝集試驗。如出現(xiàn)凝集，仍判為陽性反應(yīng)；如不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則為陰性反應(yīng)。7.結(jié)果判斷****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-297.1供試品培養(yǎng)物為革蘭陰性桿菌，三糖鐵瓊脂反應(yīng)及生化反應(yīng)符號沙門菌反應(yīng)，沙門菌屬0多價1血清凝集試驗陽性反應(yīng)（含待檢培養(yǎng)物經(jīng)100℃30min處理后凝集試驗為陽性反應(yīng)），報告1g或1ml供試品檢出沙門菌。7.2供試品培養(yǎng)物三糖鐵瓊脂反應(yīng)及生化反應(yīng)不符合沙門菌屬反應(yīng)及沙門菌屬0多個價1血清凝集試驗為陰性反應(yīng)（含待檢培養(yǎng)物經(jīng)10030℃min處理后凝集試驗為陰性反應(yīng)），報告1g或1ml供試品未檢出沙門菌。7.3供試品培養(yǎng)物出現(xiàn)下列情況應(yīng)繼續(xù)鑒定或保留菌種送交有關(guān)單位鑒定后，再作報告。7.3.1供試品培養(yǎng)物生化反應(yīng)符合沙門菌屬反應(yīng)，沙門菌屬0多價1血清凝集試驗陰性反應(yīng)。7.3.2供試品培養(yǎng)物生化反應(yīng)不符合沙門菌反應(yīng)，沙門菌屬0多價1血清凝集反應(yīng)呈陽性反應(yīng)。7.4對已檢出沙門菌的供試品分離菌種，有條件者，應(yīng)進(jìn)一步作菌型鑒定。根據(jù)檢出菌的特性，推斷可能菌型，增加生化試驗項目及沙門菌單因子血清“O”及“H”進(jìn)行鑒定。8.注意事項8.1試驗用培養(yǎng)基，需經(jīng)過質(zhì)量鑒定，用已知典型反應(yīng)菌株進(jìn)行測試，其靈敏度及特征性反應(yīng)應(yīng)符合要求。培養(yǎng)基需在規(guī)定條件保存，在規(guī)定時間內(nèi)使用。分離平板在使用前應(yīng)置36℃溫箱內(nèi)倒置孵育1-2h，使其表面溫暖濕潤，利于分離。8.2在對供試品進(jìn)行測試的同時，需故陽性對照。陰性對照應(yīng)無菌生長，陽性對照應(yīng)顯示陽性結(jié)果，否則檢驗結(jié)果無效。在進(jìn)行陽性菌對照試驗時，應(yīng)與供試品檢驗分開操作，避免污染。特別是用接種環(huán)沾取菌液進(jìn)行接種或分離時，避免動作過大，形成氣溶膠，污染供試品檢驗用具及操作環(huán)境。8.3為保證試驗方法的可靠性，對分離平板上的疑似菌落，應(yīng)多選取幾個菌落同時進(jìn)行試驗。挑取菌落時，不要在分離平板菌落密集部位挑取可疑菌落，而應(yīng)在菌落分布****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-30稀疏部位挑選。8.4生化試驗及血清學(xué)試驗的被鑒定培養(yǎng)物必須是純培養(yǎng)物,否則，不可能得到正確結(jié)果。如遇血清學(xué)凝集試驗陽性時而生化試驗不符合，應(yīng)首先檢查培養(yǎng)物的純度。對已污染的培養(yǎng)物，不應(yīng)丟棄，因為污染菌可能掩蓋沙門菌，故應(yīng)對被污染的培養(yǎng)重新分離，仔細(xì)選取單個菌落再進(jìn)行試驗。8.5所有生化反應(yīng)均需按照規(guī)定的試驗要求進(jìn)行，如觀察三糖鐵瓊脂斜面反應(yīng)的時間，應(yīng)在24±2h，時間過短過長，都可能出現(xiàn)錯誤結(jié)果判斷。又如氰化鉀試驗，試管口應(yīng)密塞，否則氰化鉀濃度降低，致使抑菌作用下降。8.6血清凝集試驗的影響因素甚多，除與電解質(zhì)、pH、溫度有關(guān)外，須特別注意抗原與抗體用量的比例恰當(dāng)，只有當(dāng)二者濃度適當(dāng)時,凝集反應(yīng)方明顯可見.由于本法試驗用多價血清,其凝集力相對較弱,試驗用菌液量切不能過大.測試前,應(yīng)用已知陽性菌測試以掌握適宜菌液濃度。8.7沙門菌為腸道重要致病菌，操作時應(yīng)特別注意防止分離待檢菌及陽性對照菌對操作環(huán)境及試驗的污染。所有用過的增菌、分離、生化試驗培養(yǎng)基、血清學(xué)凝集試驗及染色鏡檢后的玻片等，均需經(jīng)滅菌后方能洗滌。銅綠假單胞菌檢查法簡述銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）,習(xí)稱綠膿桿菌，為假單胞菌屬菌種，廣泛分布在土壤，水及空氣，人和動物的皮膚、腸道、呼吸道均有存在，故可通過環(huán)境和生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)污染藥品。本菌是常見的化膿性感染菌、在燒傷、燙傷，眼科及其他外科疾患中常引起繼發(fā)感染，由于本菌對許多抗菌的藥物具有天然的耐藥性，增加了治療的難度、國內(nèi)外藥****制藥廠操作標(biāo)準(zhǔn)----質(zhì)量管理文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-QC-107-00頁數(shù)34-31典均將銅綠假單胞菌檢查列為檢查項目之一。銅綠假單胞菌按增菌、分離、純培養(yǎng)、革蘭染色鏡檢及生化試驗等步驟進(jìn)行檢驗。儀器、設(shè)備和用具（見大腸桿菌檢驗法2）試液、指示液3.10.9%無菌氯化鈉溶液或磷酸鹽緩沖液[附錄3.1，3.3]3.21%鹽酸二甲基對苯二胺試液[附錄2.1]3.3鹽酸試液[附錄2.12]3.4氯仿[附錄1.57]4.培養(yǎng)基4.1營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基[附錄5.1]4.2膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基[附錄5.6]4.3營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[附錄5.2]4.4溴代十六烷基三甲胺[附錄5.14]4.5綠膿菌素測定用培養(yǎng)基（PDP瓊脂）[附錄