植物組織培養(yǎng)-第一章課件

大家好1大家好1

第一章實驗室與基本操作

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第一章實驗室與基本操作

2第一節(jié)實驗室及其基本設備實驗室的大小取決于工作的目的和規(guī)模：

1.以工廠化生產為目的，實驗室規(guī)模太小，則會限制生產影響效率。

2.在設計組織培養(yǎng)實驗室時，應按組織培養(yǎng)程序來設計避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。植物組織培養(yǎng)是在嚴格無菌的條件下進行的。要做到無菌的條件，需要一定的設備、器材和用具，同時還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。3第一節(jié)實驗室及其基本設備實驗室的大小取決于工作的目的和規(guī)實驗室設計4實驗室設計4一、準備室作用：材料、培養(yǎng)器械的清洗、培養(yǎng)基準備、滅菌等的準備工作。普通化學實驗室：儀器及設備、化學藥品。

純水儀、冰箱、移液槍、過濾滅菌器、電爐、微波爐、磁力攪拌器、低速臺式離心機、電腦等

。

作用：配制培養(yǎng)基。洗滌室：清洗、貯存器皿設施、鼓風干燥箱等。

作用：玻璃器皿、用具和培養(yǎng)材料的洗滌。5一、準備室5自動雙重純水蒸餾器6自動雙重純水蒸餾器6滅菌室：高壓蒸氣滅菌裝置：如立式、臥式和手提式滅菌器。作用：培養(yǎng)基、器械、棉塞、無菌紙等滅菌消毒高壓滅菌設備USINGTHEAUTOCLAVETOSTERILIZEMEDIA,GLASSWAREOROTHERLABUTENSILS

7滅菌室：高壓滅菌設備USINGTHEAUTOCLAVE細菌過濾器細菌過濾器：用于液體培養(yǎng)基滅菌裝置。8細菌過濾器細菌過濾器：用于液體培養(yǎng)基滅菌裝置。8

二、無菌操作室

作用：進行植物材料分離接種的重要場所，需長時間的無菌操作，對組織培養(yǎng)成功起關鍵作用。試驗設施：

超凈工作臺

紫外燈固定式和移動式載物臺消毒器、廣口瓶、酒精燈、酒精棉、機械支架手術剪、解剖刀、解剖針、鑷子等9

二、無菌操作室

作用：9超凈工作臺(alaminarflowhood)

工作原理:

利用鼓風機驅動空氣遁過高效過濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內構成無菌環(huán)境。10超凈工作臺(alaminarflowhood)1111三、培養(yǎng)室

作用：進行材料的培養(yǎng)的場所。其大小、規(guī)?？筛鶕?jù)工作性質設定。以充分利用空間和節(jié)能為原則。設備：

可調控光、溫、濕度等設備。還有固定式培養(yǎng)架、轉床、搖床。適用于器官（芽、莖、花藥等）、愈傷組織、細胞和原生質體的固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)。12三、培養(yǎng)室作用：12培養(yǎng)細胞或組織的各種器皿13培養(yǎng)細胞或組織的各種器皿13123414123414四、細胞學實驗室：作用：細胞學和組織學觀察。需備有高倍顯微鏡、體視顯微鏡、倒置顯微鏡、各種相機、恒溫箱、切片機、恒溫水浴、滴瓶、染色缸、載玻片、蓋玻片等。15四、細胞學實驗室：15五、溫室：

作用：培育組織與細胞培養(yǎng)出來的材料，組培苗的移栽鍛煉。16五、溫室：

作用：培育組織與細胞培養(yǎng)出來的材料，組培苗的移第二節(jié)基本操作一、洗滌方法1、重鉻酸鉀洗液：飽和的重鉻酸鉀洗液：43克重鉻酸鉀溶于1000毫升蒸餾水中（飽和溶液）。按1：1體積比將濃硫酸緩慢地倒入飽和重鉻酸鉀水溶液中。

流程：

（12h）

水洗→晾干→重鉻酸鉀洗液→自來水沖凈、蒸餾水洗兩次→干燥2、洗滌劑：洗衣粉、洗液3、超聲波洗凈器：小型玻璃器皿，頑固性污漬。超聲波除污。（要加水）

新的玻璃器皿：0.1﹪HCl浸泡12小時，洗衣粉、自來水洗、蒸餾水沖。污染的玻璃器皿：要先高壓滅菌后，然后再刷洗。要避免交叉污染。17第二節(jié)基本操作一、洗滌方法17二、滅菌方法：干熱滅菌：利用鼓風干燥箱（烘箱）進行烘烤滅菌的方法。箱內溫度控制在150℃，120min。玻璃器皿.濕熱滅菌：利用高壓蒸汽滅菌的方法。一般溫度為121℃，壓力0.1MPa，消毒15～20min。培養(yǎng)基滅菌.熏蒸滅菌：利用藥物熏蒸以達到滅菌的目的。用甲醛內加入高錳酸鉀、百菌清、硫磺熏蒸。用3%來蘇爾溶液或1%漂白粉水溶液，或0.2%過氧乙酸溶液噴灑、拖擦地板。培養(yǎng)室、接種室滅菌.18二、滅菌方法：干熱滅菌：18過濾滅菌：使溶液通過夾有微孔濾膜的漏斗，濾膜孔徑需選用0.3～0.45μm。在無菌環(huán)境下，用真空泵抽濾，其濾液為無菌。液體培養(yǎng)（不耐高溫活性物質）藥劑滅菌：用70～75%酒精、0.1～0.2%升汞、10%的次氯酸鈉、新潔爾滅、Clorox等藥劑滅菌的方法。培養(yǎng)材料滅菌。燒灼滅菌：用酒精燈燒灼達到滅菌的目的。接種器具滅菌。射線滅菌：用紫外線照射的方法滅菌。照射時間一般為15～30min。接種時應關閉紫外燈。室內滅菌。19過濾滅菌：19三、無菌操作：1.接種室以及工作臺滅菌：紫外燈30分鐘，用時一定要關閉它。2.工作臺消毒：70%乙醇，用小型噴壺消毒或棉球擦拭。3.點燃酒精燈，開啟滅菌器,對使用器械進行燒烤滅菌。器械冷卻后方可使用。20三、無菌操作：20第三節(jié)培養(yǎng)基的配置一、培養(yǎng)基成分（culturemedium：維持離體細胞生存和生長的溶液）主要有：1、無機鹽(inorganicelements)：包括大量元素（N，P，K，Ca、S、Mg），微量元素（Fe、Mn、Zn、B、Mo、Cu、Cl、Co、I）。2、有機化合物（organiccompounds)

：碳源（糖類），維生素類，有機含氮化合物。3、植物生長調節(jié)物質：生長素，細胞分裂素，赤霉素，脫落酸等。4、附加物類：瓊脂，活性炭，椰乳，硝酸銀等。21第三節(jié)培養(yǎng)基的配置一、培養(yǎng)基成分主要有：211、無機鹽(inorganicelements)——大量元素和微量元素大量元素N：用量最多。常用的有硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，KNO3、NH4NO3植物組織從培養(yǎng)基中吸收氮后形成蛋白質。P：在植物組織培養(yǎng)在的細胞增殖分化大量需要。主要從NaH2PO4、

KH2PO4供應。磷參與核酸、能量代謝。K：直接影響培養(yǎng)物中酶的活性。主要由KCl、KNO3或KH2PO4供應。Ca、S、Mg：CaCl2、Ca(NO3)2作為Ca來源，MgSO4作為S和Mg的來源。221、無機鹽(inorganicelements)——大量元微量元素主要包括Fe、Mn、Zn、B、Mo、Cu、Cl、Co、I等。植物對這些元素需要量甚微，稍多會發(fā)生毒害。Fe是用量較多的一種微量元素，對組織中葉綠素的合成和延伸生長起重要作用。鐵常以FeSO4和乙二胺四乙酸鈉(Na2-EDTA)的螯合物存在于培養(yǎng)基中。23微量元素232、有機化合物（organiccompounds)

有機碳源：即糖類。作用：維持培養(yǎng)基的合適滲透壓對初生細胞和原生質體的完整性有十分重要作用。另外，糖類也是合成有機物的碳源。最常用有：蔗糖、葡萄糖、果糖、多糖、可溶性淀粉和糊精。作為氮源，蔗糖一般濃度為2%～3%。糖的濃度影響組織分化類型：在高濃度（3%～4%）的蔗糖有利于韌皮組織分化；低糖濃度（1.5%～2.5%）時，僅生長出木質部；適中濃度時形成具有木質部和韌皮部。242、有機化合物（organiccompounds)有機維生素類作用：直接參與生物催化劑（酶）的形成、蛋白質、脂肪代謝等重要生命活動。VB1（Thiamine-HCl,鹽酸硫胺素）參與碳水化合物等有機物轉化，促進生長素誘導不定根的發(fā)育。用量10mg/L。VB5(NicotinicAcid，煙酸)，可促進培養(yǎng)物生長。煙酸是尼克酰胺的前體，尼克酰胺核苷酸是脫氫酶輔酶NAD+、NADP+的成分。用量1mg/L。VB6（Pyridoxine-HCl，鹽酸吡哆醇）參與植物氮代謝,促進愈傷組織生長、提高愈傷組織分化能力、促進培養(yǎng)物生長。用量1mg/L。葉酸（VB9）促進培養(yǎng)物生長，參與嘌呤、嘧啶合成。VB12（生物素VH）培養(yǎng)物也有促進作用。肌醇（Myo-insotol,環(huán)己六醇）：具有幫助活性物質發(fā)揮作用的效果，可提高VB1的效應。同時對促進培養(yǎng)物的生長，胚狀體及芽的形成有良好作用。用量：一般50～100mg/L。25維生素類作用：直接參與生物催化劑（酶）的形成、蛋白質、脂肪代③有機含氮化合物氨基酸：常用的為：甘氨酸及酰胺類物質。如谷氨酰胺（Glutamine），天冬酰胺和多種氨基酸混合物。水解乳蛋白（Lactalbuminhydrolysate,LH）、水解酪蛋白（Caseinhydrolysate，CH）。26③有機含氮化合物263、植物生長調節(jié)物質生長素：

吲哚乙酸（IAA）：在培養(yǎng)組織中有吲哚乙酸氧化酶，可使IAA解體，而且也可在光下分解，用量稍高。

吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA），人工合成化學物質，用量低（0.1～2mg/L）。

2，4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），作用比IBA和NAA強。細胞分裂素：激動素（Kinetin,KT）

6-芐基腺嘌呤（6-Benzyladenine,6-BA）玉米素（Zeatin,ZT）

2-異戊烯基腺嘌呤（2-Isopentenyladenine,2iP）噻重氮苯基脲（Thidiaznron,TDZ）（噻苯?。?/p>

273、植物生長調節(jié)物質27赤霉素（GA3）、脫落酸（ABA）和多效唑（PP333）等生長調節(jié)物質也在組織培養(yǎng)中應用。

GA3—主要用于促進試管苗的生長。

ABA—體胚的發(fā)育成熟。

PP333—促進壯苗。

在組織培養(yǎng)中，生長素的主要作用是誘導外植體脫分化產生愈傷組織及促進培養(yǎng)物生長，誘導根器官的分化。

細胞分裂素的主要作用是促進細胞的分裂和分化，誘導不定芽和胚狀體的分化和形成，延緩組織衰老，增加蛋白質合成。28赤霉素（GA3）、脫落酸（ABA）和多效唑（PP333）等生4、附加物類

常用附加物類有:瓊脂(Agar):組織培養(yǎng)支持物.本身并不提供任何營養(yǎng)，它是一種高分子的碳水化合物，從紅藻等海藻中提取，僅溶解于熱水，成為溶膠，冷后(40℃以下)即凝固為固體狀的凝膠。在固體培養(yǎng)方式中不可缺少。一般用量為0.5%～1.0%，有固體條狀和粉狀兩種。瓊脂糖(Agerose):可改善培養(yǎng)物的供氧狀況。聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、維生素C（Vc）以及硝酸銀等，可防止培養(yǎng)材料的褐變.活性碳(AC)：具有吸附能力，減少有害物質的影響，如可防止酚類物質污染而引起組織褐化死亡。也有利于某些植物生根.用量1-5%.294、附加物類

常用附加物類有:29⑤馬鈴薯萃取液：多用于壯苗的培養(yǎng)，在使用時可將馬鈴薯去皮、切碎、水煮20一30分鐘，然后將濾液加入培養(yǎng)基中，其用量通常為100—200g/L。當培養(yǎng)基中添加了馬鈴薯萃取液后，可以對pH產生緩沖作用，試管苗也生長得更為健壯。⑥香蕉：多用于蘭花的組織培養(yǎng)，將成熟香蕉果肉搗爛后，添加到培養(yǎng)基中，用量150—200g/L。香蕉果泥可緩沖培養(yǎng)基的pH，對外植體的分化有著較為明顯的促進作用。⑦椰乳：Coconutmilk,CM。用于較難培養(yǎng)的植物材料的培養(yǎng)基中?？蓪⒁拥囊簯B(tài)胚乳取出、或高壓滅菌，或無菌過濾。使用濃度100-200mL／L。

30⑤馬鈴薯萃取液：多用于壯苗的培養(yǎng)，在使用時可將馬鈴薯去皮、二、培養(yǎng)基的種類（一）常用的培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基無機鹽數(shù)量適宜，硝酸鹽、鉀和銨鹽的含量比其他培養(yǎng)基高。應用最廣泛。主要用于園藝植物、木本植物、花卉、蔬菜等的組織培養(yǎng)。B5培養(yǎng)基

銨的含量較低。在豆科植物上應用最多。培養(yǎng)大豆細胞和組織培養(yǎng)設計。White培養(yǎng)基成分比較簡單，無機鹽和糖的用量低。31二、培養(yǎng)基的種類（一）常用的培養(yǎng)基31（二）培養(yǎng)基按試驗目的分為：

誘導培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基。誘導培養(yǎng)基

（脫分化培養(yǎng)基）：

外植體誘導發(fā)生愈傷組織的培養(yǎng)基。

水稻誘導愈傷組織時加2.4-D；而煙草、胡蘿卜既需生長素，又需細胞分裂素。繼代培養(yǎng)基：誘導出愈傷組織后，使愈傷組織能不斷地生長下去的培養(yǎng)基。32（二）培養(yǎng)基按試驗目的分為：

誘導培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)基，分化分化培養(yǎng)：由愈傷組織誘導形成小苗（幼芽或胚狀體）的培養(yǎng)基。①不加任何激素的基本培養(yǎng)基，即可誘導分化。如水稻、珍珠粟、甘蔗等植物。②加較高濃度細胞分裂素和少量生長素培養(yǎng)基。如煙草、矮牽牛、四季海棠、天竺葵、菊花、倒掛金鐘等組織的分化。③只加細胞分裂素的培養(yǎng)基。如豌豆、油菜、小麥等。33分化培養(yǎng)：33生根培養(yǎng)基：誘導再生小苗生根的培養(yǎng)基。在無任何生長激素的基本培養(yǎng)基中就可生出良好的根系。如煙草、紅薯、草莓、枸杞等。有些需加入少量的NAA、IAA或IBA以誘導根。有些需要減低培養(yǎng)基中無機鹽的濃度。如用MS培養(yǎng)基中1/2或1/4的無機鹽誘導生根，常可獲得良好的效果。34生根培養(yǎng)基：34生長素和細胞分裂素對擬南芥愈傷組織器官分化的影響35生長素和細胞分裂素對擬南芥愈傷組織器官分化的影響35NAA0.5mg/L6-BA0.5mg/L生長素和細胞分裂素對褐斑伽藍葉片器官分化的影響36NAA0.5mg/L6-BA0.5mg/L生長素和細胞分（三）培養(yǎng)基按其物理性質劃分為：固體培養(yǎng)在培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑，使液體培養(yǎng)基固化,一般用于組織或器官培養(yǎng).優(yōu)點：使用方便，占地不大。缺點：培養(yǎng)外植體只能有部分組織與培養(yǎng)基接觸，培養(yǎng)物上下部因接受養(yǎng)分不均勻，引起組織生長的差異。液體培養(yǎng)培養(yǎng)物消毒后直接置于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),一般用于細胞培養(yǎng)。優(yōu)點：培養(yǎng)物吸收營養(yǎng)比較充分，容易獲得均勻一致的細胞群體。缺點：轉換培養(yǎng)基較麻煩。

37（三）培養(yǎng)基按其物理性質劃分為：37液體培養(yǎng)又分為靜止培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)兩種形式。

靜止培養(yǎng)

在液體培養(yǎng)中用濾紙做成紙橋，橋系緊貼培養(yǎng)液表面，四周插入溶液中，直至瓶底部，使營養(yǎng)液借助毛細管力滲入濾紙，培養(yǎng)物置于濾紙橋面，通過紙橋源源不斷地供給養(yǎng)分。38液體培養(yǎng)又分為靜止培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)兩種形式。

靜止培養(yǎng)38振蕩培養(yǎng)將裝有培養(yǎng)物和液體培養(yǎng)基的器皿置于轉床或搖床上進行培養(yǎng)，它既能使培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中均勻的接觸吸收培養(yǎng)基成分，又能保持良好的通氣條件.

搖床有旋轉式、半旋轉式和往復式三種。速度比轉床快。

39振蕩培養(yǎng)39（三）培養(yǎng)基的篩選篩選：在多種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)物的生長情況，確定較適宜的培養(yǎng)基。調整：根據(jù)培養(yǎng)物的生長情況或培養(yǎng)目的的不同，對培養(yǎng)基進行調整，探索新的培養(yǎng)基。如：改良MS、改良B5培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基等。40（三）培養(yǎng)基的篩選篩選：在多種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)物的生長三、培養(yǎng)基的制備

（一）母液的配制大量元素母液：配制原溶液的10～50X，依次溶解，混合定容。微量元素母液：一般配制100X，定容。稱量時最好用萬分之一的電子天平。鐵鹽母液：亦配制100X，硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸鈉（Na2-EDTA）分別溶解后，混合后再螯合30分鐘，最后定容。有機物母液：100X，定容。生長調節(jié)物母液：濃度0.5～1mg/ml。

生長素類：IAA、2.4-D、NAA、IBA為有機酸，制備時用堿液溶解。

IAA溶液配置：一般稱25mg，加0.1mol/LNaOH2～3ml，溶解后，加水定容25ml，即為IAA1mg/ml，也可用無水乙醇溶解后定容。

細胞分裂素類，KT、BA等，一般用0.1mol/LHCl溶解后加水定容。41三、培養(yǎng)基的制備（一）母液的配制41配制母液注意幾點：配制倍數(shù)不宜過高，可避免浪費；也可避免倍數(shù)過高，吸取量相對少而影響準確性。母液配制好后應放在2～4℃冰箱內保存。母液貯備時間不宜過長。過長時宜出現(xiàn)沉淀和微生物污染。42配制母液注意幾點：配制倍數(shù)不宜過高，可避免浪費；也可避免倍數(shù)幾種培養(yǎng)基成分表(mg/L)培養(yǎng)基成分Murashige&Skoog(MS,1962)Gamborg(B5,1968)White(W-63,1963)N6朱至清，1975）（NH4）SO4NH4NO3KNO3Ca(NO3)2.4H2OCaCl2.2H2OMgSO4.7H2OKH2PO4NaH2PO4.H2ONa2-EDTAFe-EDTANaFe-EDTAFeSO4.7H2OKClNa2SO4Fe2SO4)3MnSO4.4H2OZnSO4.7H2OH3BO3KIMoO3Na2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl.6H2O鹽酸硫胺素VB1煙酸鹽酸吡哆醇VB6肌醇甘氨酸蔗糖瓊脂pH

16501900

440370170

37.3

27.8

22.38.66.20.83

0.250.0250.0250.10.50.51002.030(g)10(g)5.8

134

2500

150250

15037.3

27.8

102.03.00.75

0.250.0250.025101.01.0100

20(g)10(g)5.5

80200

720

17

2002.55.03.01.50.750.001

0.10.30.1

3.020(g)10(g)5.6463

2830

166185400

37.3

27.8

4.43.81.60.8

1.00.50.5

2.050(g)10(g)5.8

大量元素微量元素有機物鐵鹽溶液43幾種培養(yǎng)基成分表(mg/L)培養(yǎng)基成分Murashig

（二）培養(yǎng)基配制

按培養(yǎng)基配方濃度將母液實際用量依次加入大量筒中。然后將蔗糖溶解加入，用蒸餾水定容至所需要的體積。調整pH值（0.1～1mol/LNaOH或0.1～1mol/LHCl)。另外,瓊脂溶解后的總體積計算在培養(yǎng)基體積中，溶解后，分裝培養(yǎng)器皿中，加塞，準備消毒。

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（二）培養(yǎng)基配制

按培養(yǎng)基配方濃度將母液實際用量依次加入大第四節(jié)離體培養(yǎng)體系的建立

一、建立離體培養(yǎng)體系的基本程序

1.無菌外植體的獲得

2.初代培養(yǎng)物的建立

3.形態(tài)發(fā)生和植株再生

外植體（離體的植物器官、組織、細胞）脫分化愈傷組織再分化器官發(fā)生：不定根或不定芽胚胎發(fā)生：胚狀體植物體45第四節(jié)離體培養(yǎng)體系的建立一、建立離體培養(yǎng)體系的基本程序外二、外植體選擇的基本原則

1.再生能力強：

基因型；分化程度；發(fā)育年齡；器官和組織的類型、部位等。

2.遺傳穩(wěn)定性好；

3.外植體來源豐富；

4.外植體容易滅菌：地上比地下、一年生比多年生、幼嫩比老齡、健康比受傷組織滅菌容易。

5.外植體大小適宜：46二、外植體選擇的基本原則465.外植體大小對分化的影響475.外植體大小對分化的影響47三、培養(yǎng)材料的滅菌（一）滅菌的要求①消滅病菌②減少對材料的損傷（二）常用消毒劑48三、培養(yǎng)材料的滅菌（一）滅菌的要求①消滅病菌②減少對材料的損（三）材料滅菌過程1、材料前處理：自來水沖洗。此過程在準備室內完成。2、消毒液處理：用酒精、升汞、次氯酸鈣等配制好的溶液進行消毒。程序:首先75%酒精30S,0.1%升汞消毒5～30min。3、無菌水沖洗：

3-5次，每次要把鑷子、刀片等器械，進行酒精燈燒灼消毒。

2-3步驟操作在超凈工作臺中進行。49（三）材料滅菌過程1、材料前處理：49四、污染主要類型及特征

1、細菌：菌斑粘液狀，在材料基部挨著培養(yǎng)基的部位，一般短時間內可以觀察到。1-3天。

2、真菌：有顏色的霉菌。時間較長才能看到。10-30天之后出現(xiàn)。50四、污染主要類型及特征50五、污染的控制1、操作環(huán)節(jié)：防止污染的主要措施是：①改善環(huán)境條件。②嚴格執(zhí)行無菌操作。③嚴查接種材料。④經常檢查滅菌設備的質量。⑤檢查培養(yǎng)容器是否存在問題。51五、污染的控制1、操作環(huán)節(jié)：512、內源細菌⑴培養(yǎng)基中加入殺菌劑：

添加抗菌素（200mg/Ｌ的青霉素）、鏈霉素、慶大霉素和頭孢唑林鈉、苯甲酸鈉。⑵反復莖尖培養(yǎng)：

致病菌在植物體內通過維管束傳播，通過反復的莖尖培養(yǎng)既可脫除內生菌，又可脫病毒。⑶降低PH值：

大多數(shù)細菌在介質PH小于4.5時不能生長。培養(yǎng)基的PH值由5.8調至3.9～4.3，可防止大量的細菌污染。522、內源細菌⑴培養(yǎng)基中加入殺菌劑：52小結

1.組織培養(yǎng)的實驗室及基本設備準備室、無菌操作室、培養(yǎng)室、細胞學實驗室、溫室

2.無菌操作：洗滌、滅菌、無菌操作

3.培養(yǎng)基的制備：培養(yǎng)基的成分、種類、制備程序

4.離體培養(yǎng)體系的建立

培養(yǎng)材料的選擇、確定原則，影響取材部位的因素、材料的滅菌、污染的控制等。第一章實驗室與基本操作53小結第一章實驗室與基本操作53大家好54大家好1

第一章實驗室與基本操作

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第一章實驗室與基本操作

2第一節(jié)實驗室及其基本設備實驗室的大小取決于工作的目的和規(guī)模：

1.以工廠化生產為目的，實驗室規(guī)模太小，則會限制生產影響效率。

2.在設計組織培養(yǎng)實驗室時，應按組織培養(yǎng)程序來設計避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。植物組織培養(yǎng)是在嚴格無菌的條件下進行的。要做到無菌的條件，需要一定的設備、器材和用具，同時還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。56第一節(jié)實驗室及其基本設備實驗室的大小取決于工作的目的和規(guī)實驗室設計57實驗室設計4一、準備室作用：材料、培養(yǎng)器械的清洗、培養(yǎng)基準備、滅菌等的準備工作。普通化學實驗室：儀器及設備、化學藥品。

純水儀、冰箱、移液槍、過濾滅菌器、電爐、微波爐、磁力攪拌器、低速臺式離心機、電腦等

。

作用：配制培養(yǎng)基。洗滌室：清洗、貯存器皿設施、鼓風干燥箱等。

作用：玻璃器皿、用具和培養(yǎng)材料的洗滌。58一、準備室5自動雙重純水蒸餾器59自動雙重純水蒸餾器6滅菌室：高壓蒸氣滅菌裝置：如立式、臥式和手提式滅菌器。作用：培養(yǎng)基、器械、棉塞、無菌紙等滅菌消毒高壓滅菌設備USINGTHEAUTOCLAVETOSTERILIZEMEDIA,GLASSWAREOROTHERLABUTENSILS

60滅菌室：高壓滅菌設備USINGTHEAUTOCLAVE細菌過濾器細菌過濾器：用于液體培養(yǎng)基滅菌裝置。61細菌過濾器細菌過濾器：用于液體培養(yǎng)基滅菌裝置。8

二、無菌操作室

作用：進行植物材料分離接種的重要場所，需長時間的無菌操作，對組織培養(yǎng)成功起關鍵作用。試驗設施：

超凈工作臺

紫外燈固定式和移動式載物臺消毒器、廣口瓶、酒精燈、酒精棉、機械支架手術剪、解剖刀、解剖針、鑷子等62

二、無菌操作室

作用：9超凈工作臺(alaminarflowhood)

工作原理:

利用鼓風機驅動空氣遁過高效過濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內構成無菌環(huán)境。63超凈工作臺(alaminarflowhood)6411三、培養(yǎng)室

作用：進行材料的培養(yǎng)的場所。其大小、規(guī)模可根據(jù)工作性質設定。以充分利用空間和節(jié)能為原則。設備：

可調控光、溫、濕度等設備。還有固定式培養(yǎng)架、轉床、搖床。適用于器官（芽、莖、花藥等）、愈傷組織、細胞和原生質體的固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)。65三、培養(yǎng)室作用：12培養(yǎng)細胞或組織的各種器皿66培養(yǎng)細胞或組織的各種器皿13123467123414四、細胞學實驗室：作用：細胞學和組織學觀察。需備有高倍顯微鏡、體視顯微鏡、倒置顯微鏡、各種相機、恒溫箱、切片機、恒溫水浴、滴瓶、染色缸、載玻片、蓋玻片等。68四、細胞學實驗室：15五、溫室：

作用：培育組織與細胞培養(yǎng)出來的材料，組培苗的移栽鍛煉。69五、溫室：

作用：培育組織與細胞培養(yǎng)出來的材料，組培苗的移第二節(jié)基本操作一、洗滌方法1、重鉻酸鉀洗液：飽和的重鉻酸鉀洗液：43克重鉻酸鉀溶于1000毫升蒸餾水中（飽和溶液）。按1：1體積比將濃硫酸緩慢地倒入飽和重鉻酸鉀水溶液中。

流程：

（12h）

水洗→晾干→重鉻酸鉀洗液→自來水沖凈、蒸餾水洗兩次→干燥2、洗滌劑：洗衣粉、洗液3、超聲波洗凈器：小型玻璃器皿，頑固性污漬。超聲波除污。（要加水）

新的玻璃器皿：0.1﹪HCl浸泡12小時，洗衣粉、自來水洗、蒸餾水沖。污染的玻璃器皿：要先高壓滅菌后，然后再刷洗。要避免交叉污染。70第二節(jié)基本操作一、洗滌方法17二、滅菌方法：干熱滅菌：利用鼓風干燥箱（烘箱）進行烘烤滅菌的方法。箱內溫度控制在150℃，120min。玻璃器皿.濕熱滅菌：利用高壓蒸汽滅菌的方法。一般溫度為121℃，壓力0.1MPa，消毒15～20min。培養(yǎng)基滅菌.熏蒸滅菌：利用藥物熏蒸以達到滅菌的目的。用甲醛內加入高錳酸鉀、百菌清、硫磺熏蒸。用3%來蘇爾溶液或1%漂白粉水溶液，或0.2%過氧乙酸溶液噴灑、拖擦地板。培養(yǎng)室、接種室滅菌.71二、滅菌方法：干熱滅菌：18過濾滅菌：使溶液通過夾有微孔濾膜的漏斗，濾膜孔徑需選用0.3～0.45μm。在無菌環(huán)境下，用真空泵抽濾，其濾液為無菌。液體培養(yǎng)（不耐高溫活性物質）藥劑滅菌：用70～75%酒精、0.1～0.2%升汞、10%的次氯酸鈉、新潔爾滅、Clorox等藥劑滅菌的方法。培養(yǎng)材料滅菌。燒灼滅菌：用酒精燈燒灼達到滅菌的目的。接種器具滅菌。射線滅菌：用紫外線照射的方法滅菌。照射時間一般為15～30min。接種時應關閉紫外燈。室內滅菌。72過濾滅菌：19三、無菌操作：1.接種室以及工作臺滅菌：紫外燈30分鐘，用時一定要關閉它。2.工作臺消毒：70%乙醇，用小型噴壺消毒或棉球擦拭。3.點燃酒精燈，開啟滅菌器,對使用器械進行燒烤滅菌。器械冷卻后方可使用。73三、無菌操作：20第三節(jié)培養(yǎng)基的配置一、培養(yǎng)基成分（culturemedium：維持離體細胞生存和生長的溶液）主要有：1、無機鹽(inorganicelements)：包括大量元素（N，P，K，Ca、S、Mg），微量元素（Fe、Mn、Zn、B、Mo、Cu、Cl、Co、I）。2、有機化合物（organiccompounds)

：碳源（糖類），維生素類，有機含氮化合物。3、植物生長調節(jié)物質：生長素，細胞分裂素，赤霉素，脫落酸等。4、附加物類：瓊脂，活性炭，椰乳，硝酸銀等。74第三節(jié)培養(yǎng)基的配置一、培養(yǎng)基成分主要有：211、無機鹽(inorganicelements)——大量元素和微量元素大量元素N：用量最多。常用的有硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，KNO3、NH4NO3植物組織從培養(yǎng)基中吸收氮后形成蛋白質。P：在植物組織培養(yǎng)在的細胞增殖分化大量需要。主要從NaH2PO4、

KH2PO4供應。磷參與核酸、能量代謝。K：直接影響培養(yǎng)物中酶的活性。主要由KCl、KNO3或KH2PO4供應。Ca、S、Mg：CaCl2、Ca(NO3)2作為Ca來源，MgSO4作為S和Mg的來源。751、無機鹽(inorganicelements)——大量元微量元素主要包括Fe、Mn、Zn、B、Mo、Cu、Cl、Co、I等。植物對這些元素需要量甚微，稍多會發(fā)生毒害。Fe是用量較多的一種微量元素，對組織中葉綠素的合成和延伸生長起重要作用。鐵常以FeSO4和乙二胺四乙酸鈉(Na2-EDTA)的螯合物存在于培養(yǎng)基中。76微量元素232、有機化合物（organiccompounds)

有機碳源：即糖類。作用：維持培養(yǎng)基的合適滲透壓對初生細胞和原生質體的完整性有十分重要作用。另外，糖類也是合成有機物的碳源。最常用有：蔗糖、葡萄糖、果糖、多糖、可溶性淀粉和糊精。作為氮源，蔗糖一般濃度為2%～3%。糖的濃度影響組織分化類型：在高濃度（3%～4%）的蔗糖有利于韌皮組織分化；低糖濃度（1.5%～2.5%）時，僅生長出木質部；適中濃度時形成具有木質部和韌皮部。772、有機化合物（organiccompounds)有機維生素類作用：直接參與生物催化劑（酶）的形成、蛋白質、脂肪代謝等重要生命活動。VB1（Thiamine-HCl,鹽酸硫胺素）參與碳水化合物等有機物轉化，促進生長素誘導不定根的發(fā)育。用量10mg/L。VB5(NicotinicAcid，煙酸)，可促進培養(yǎng)物生長。煙酸是尼克酰胺的前體，尼克酰胺核苷酸是脫氫酶輔酶NAD+、NADP+的成分。用量1mg/L。VB6（Pyridoxine-HCl，鹽酸吡哆醇）參與植物氮代謝,促進愈傷組織生長、提高愈傷組織分化能力、促進培養(yǎng)物生長。用量1mg/L。葉酸（VB9）促進培養(yǎng)物生長，參與嘌呤、嘧啶合成。VB12（生物素VH）培養(yǎng)物也有促進作用。肌醇（Myo-insotol,環(huán)己六醇）：具有幫助活性物質發(fā)揮作用的效果，可提高VB1的效應。同時對促進培養(yǎng)物的生長，胚狀體及芽的形成有良好作用。用量：一般50～100mg/L。78維生素類作用：直接參與生物催化劑（酶）的形成、蛋白質、脂肪代③有機含氮化合物氨基酸：常用的為：甘氨酸及酰胺類物質。如谷氨酰胺（Glutamine），天冬酰胺和多種氨基酸混合物。水解乳蛋白（Lactalbuminhydrolysate,LH）、水解酪蛋白（Caseinhydrolysate，CH）。79③有機含氮化合物263、植物生長調節(jié)物質生長素：

吲哚乙酸（IAA）：在培養(yǎng)組織中有吲哚乙酸氧化酶，可使IAA解體，而且也可在光下分解，用量稍高。

吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA），人工合成化學物質，用量低（0.1～2mg/L）。

2，4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），作用比IBA和NAA強。細胞分裂素：激動素（Kinetin,KT）

6-芐基腺嘌呤（6-Benzyladenine,6-BA）玉米素（Zeatin,ZT）

2-異戊烯基腺嘌呤（2-Isopentenyladenine,2iP）噻重氮苯基脲（Thidiaznron,TDZ）（噻苯?。?/p>

803、植物生長調節(jié)物質27赤霉素（GA3）、脫落酸（ABA）和多效唑（PP333）等生長調節(jié)物質也在組織培養(yǎng)中應用。

GA3—主要用于促進試管苗的生長。

ABA—體胚的發(fā)育成熟。

PP333—促進壯苗。

在組織培養(yǎng)中，生長素的主要作用是誘導外植體脫分化產生愈傷組織及促進培養(yǎng)物生長，誘導根器官的分化。

細胞分裂素的主要作用是促進細胞的分裂和分化，誘導不定芽和胚狀體的分化和形成，延緩組織衰老，增加蛋白質合成。81赤霉素（GA3）、脫落酸（ABA）和多效唑（PP333）等生4、附加物類

常用附加物類有:瓊脂(Agar):組織培養(yǎng)支持物.本身并不提供任何營養(yǎng)，它是一種高分子的碳水化合物，從紅藻等海藻中提取，僅溶解于熱水，成為溶膠，冷后(40℃以下)即凝固為固體狀的凝膠。在固體培養(yǎng)方式中不可缺少。一般用量為0.5%～1.0%，有固體條狀和粉狀兩種。瓊脂糖(Agerose):可改善培養(yǎng)物的供氧狀況。聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、維生素C（Vc）以及硝酸銀等，可防止培養(yǎng)材料的褐變.活性碳(AC)：具有吸附能力，減少有害物質的影響，如可防止酚類物質污染而引起組織褐化死亡。也有利于某些植物生根.用量1-5%.824、附加物類

常用附加物類有:29⑤馬鈴薯萃取液：多用于壯苗的培養(yǎng)，在使用時可將馬鈴薯去皮、切碎、水煮20一30分鐘，然后將濾液加入培養(yǎng)基中，其用量通常為100—200g/L。當培養(yǎng)基中添加了馬鈴薯萃取液后，可以對pH產生緩沖作用，試管苗也生長得更為健壯。⑥香蕉：多用于蘭花的組織培養(yǎng)，將成熟香蕉果肉搗爛后，添加到培養(yǎng)基中，用量150—200g/L。香蕉果泥可緩沖培養(yǎng)基的pH，對外植體的分化有著較為明顯的促進作用。⑦椰乳：Coconutmilk,CM。用于較難培養(yǎng)的植物材料的培養(yǎng)基中?？蓪⒁拥囊簯B(tài)胚乳取出、或高壓滅菌，或無菌過濾。使用濃度100-200mL／L。

83⑤馬鈴薯萃取液：多用于壯苗的培養(yǎng)，在使用時可將馬鈴薯去皮、二、培養(yǎng)基的種類（一）常用的培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基無機鹽數(shù)量適宜，硝酸鹽、鉀和銨鹽的含量比其他培養(yǎng)基高。應用最廣泛。主要用于園藝植物、木本植物、花卉、蔬菜等的組織培養(yǎng)。B5培養(yǎng)基

銨的含量較低。在豆科植物上應用最多。培養(yǎng)大豆細胞和組織培養(yǎng)設計。White培養(yǎng)基成分比較簡單，無機鹽和糖的用量低。84二、培養(yǎng)基的種類（一）常用的培養(yǎng)基31（二）培養(yǎng)基按試驗目的分為：

誘導培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基。誘導培養(yǎng)基

（脫分化培養(yǎng)基）：

外植體誘導發(fā)生愈傷組織的培養(yǎng)基。

水稻誘導愈傷組織時加2.4-D；而煙草、胡蘿卜既需生長素，又需細胞分裂素。繼代培養(yǎng)基：誘導出愈傷組織后，使愈傷組織能不斷地生長下去的培養(yǎng)基。85（二）培養(yǎng)基按試驗目的分為：

誘導培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)基，分化分化培養(yǎng)：由愈傷組織誘導形成小苗（幼芽或胚狀體）的培養(yǎng)基。①不加任何激素的基本培養(yǎng)基，即可誘導分化。如水稻、珍珠粟、甘蔗等植物。②加較高濃度細胞分裂素和少量生長素培養(yǎng)基。如煙草、矮牽牛、四季海棠、天竺葵、菊花、倒掛金鐘等組織的分化。③只加細胞分裂素的培養(yǎng)基。如豌豆、油菜、小麥等。86分化培養(yǎng)：33生根培養(yǎng)基：誘導再生小苗生根的培養(yǎng)基。在無任何生長激素的基本培養(yǎng)基中就可生出良好的根系。如煙草、紅薯、草莓、枸杞等。有些需加入少量的NAA、IAA或IBA以誘導根。有些需要減低培養(yǎng)基中無機鹽的濃度。如用MS培養(yǎng)基中1/2或1/4的無機鹽誘導生根，?？色@得良好的效果。87生根培養(yǎng)基：34生長素和細胞分裂素對擬南芥愈傷組織器官分化的影響88生長素和細胞分裂素對擬南芥愈傷組織器官分化的影響35NAA0.5mg/L6-BA0.5mg/L生長素和細胞分裂素對褐斑伽藍葉片器官分化的影響89NAA0.5mg/L6-BA0.5mg/L生長素和細胞分（三）培養(yǎng)基按其物理性質劃分為：固體培養(yǎng)在培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑，使液體培養(yǎng)基固化,一般用于組織或器官培養(yǎng).優(yōu)點：使用方便，占地不大。缺點：培養(yǎng)外植體只能有部分組織與培養(yǎng)基接觸，培養(yǎng)物上下部因接受養(yǎng)分不均勻，引起組織生長的差異。液體培養(yǎng)培養(yǎng)物消毒后直接置于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),一般用于細胞培養(yǎng)。優(yōu)點：培養(yǎng)物吸收營養(yǎng)比較充分，容易獲得均勻一致的細胞群體。缺點：轉換培養(yǎng)基較麻煩。

90（三）培養(yǎng)基按其物理性質劃分為：37液體培養(yǎng)又分為靜止培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)兩種形式。

靜止培養(yǎng)

在液體培養(yǎng)中用濾紙做成紙橋，橋系緊貼培養(yǎng)液表面，四周插入溶液中，直至瓶底部，使營養(yǎng)液借助毛細管力滲入濾紙，培養(yǎng)物置于濾紙橋面，通過紙橋源源不斷地供給養(yǎng)分。91液體培養(yǎng)又分為靜止培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)兩種形式。

靜止培養(yǎng)38振蕩培養(yǎng)將裝有培養(yǎng)物和液體培養(yǎng)基的器皿置于轉床或搖床上進行培養(yǎng)，它既能使培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中均勻的接觸吸收培養(yǎng)基成分，又能保持良好的通氣條件.

搖床有旋轉式、半旋轉式和往復式三種。速度比轉床快。

92振蕩培養(yǎng)39（三）培養(yǎng)基的篩選篩選：在多種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)物的生長情況，確定較適宜的培養(yǎng)基。調整：根據(jù)培養(yǎng)物的生長情況或培養(yǎng)目的的不同，對培養(yǎng)基進行調整，探索新的培養(yǎng)基。如：改良MS、改良B5培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基等。93（三）培養(yǎng)基的篩選篩選：在多種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)物的生長三、培養(yǎng)基的制備

（一）母液的配制大量元素母液：配制原溶液的10～50X，依次溶解，混合定容。微量元素母液：一般配制100X，定容。稱量時最好用萬分之一的電子天平。鐵鹽母液：亦配制100X，硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸鈉（Na2-EDTA）分別溶解后，混合后再螯合30分鐘，最后定容。有機物母液：100X，定容。生長調節(jié)物母液：濃度0.5～1mg/ml。

生長素類：IAA、2.4-D、NAA、IBA為有機酸，制備時用堿液溶解。

IAA溶液配置：一般稱25mg，加0.1mol/LNaOH2～3ml，溶解后，加水定容25ml，即為IAA1mg/ml，也可用無水乙醇溶解后定容。

細胞分裂素類，KT、BA等，一般用0.1mol/LHCl溶解后加水定容。94三、培養(yǎng)基的制備（一）母液的配制41配制母液注意幾點：配制倍數(shù)不宜過高，可避免浪費；也可避免倍數(shù)過高，吸取量相對少而影響準確性。母液配制好后應放在2～4℃冰箱內保存。母液貯備時間不宜過長。過長時宜出現(xiàn)沉淀和微生物污染。95配制母液注意幾點：配制倍數(shù)不宜過高，可避免浪費；也可避免倍數(shù)幾種培養(yǎng)基成分表(mg/L)培養(yǎng)基成分Murashige&Skoog(MS,1962)Gamborg(B5,1968)White(W-63,1963)N6朱至清，1975）（NH4）SO4NH4NO3KNO3Ca(NO3)2.4H2OCaCl2.2H2OMgSO4.7H2OKH2PO4NaH2PO4.H2ONa2-EDTAFe-EDTANaFe-EDTAFeSO4.7H2OKClNa2SO4Fe2SO4)3MnSO4.4H2OZnSO4.7H2OH3BO3KIMoO3Na2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl.6H2O鹽酸硫胺素VB1煙酸鹽酸吡哆醇VB6肌醇甘氨酸蔗糖瓊脂pH

16501900

440370170

37.3

27.8

22.38.66.20.83

0.250.0250.0250.10