DB34-T 3862-2021豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌2、7、12型多重PCR定型檢測技術(shù)-高清現(xiàn)行

ICS11.22034CCSB4134安 徽 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB34/T3862—20212、7、12PCRMultilexPCRdetectiontechnologyofActinobacilluspleuropneumoniaetype2,7,12MultilexPCRdetectiontechnologyofActinobacilluspleuropneumoniaetype2,7,122021-01-252021-02-25安徽省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB34/T3862DB34/T3862—2021前 言GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。本文件由安徽省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。（室醫(yī)局、望江申江養(yǎng)殖有限公司。王勇、徐前明。IIDB34/T3862DB34/T3862—2021DB34/T3862—2021DB34/T3862—20215.55.65.75.85.95.105.115.125.135.1417000g天平：量程2kg，0.1g。pH計。渦旋振蕩器。PCR擴增儀。電泳儀：電壓10-300V，電流4-400mA，功率最大75W。20×20-21×26cm302nm。超凈工作臺。微量移液器：0.5μL～10μL、5μL～50μL、20μL～200μL、100μL～1000μL。干熱滅菌器。豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌2、7、12型多重PCR定型檢測技術(shù)范圍本文件確定了豬胸膜肺炎放線桿菌2、7、12型多重PCR定型檢測技術(shù)，并規(guī)定了試劑和材料、儀器和設(shè)備、樣品的采集、運輸和保存、操作步驟、結(jié)果判定、生物安全及防污染措施。本文件適用于豬胸膜肺炎放線桿菌2、7、12型多重PCR定型檢測。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27401 SN/T1447豬傳染性胸膜肺炎檢疫技術(shù)規(guī)范DB34/T2997豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌檢驗操作規(guī)程3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。DB34/T2997豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌檢驗操作規(guī)程3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4試劑和材料除有特殊說明外，所有實驗用試劑均為分析純；實驗用水符合GB/T6682規(guī)定中一級水的要求。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。PCR：2×TaqPCRMasterMix。10×PCR1.0％瓊脂糖凝膠。5×TBEDNA：DNAmarkerLD2000。PCRB。5儀器和設(shè)備電熱壓力蒸汽滅菌器。電子天平：感量0.1g。恒溫震蕩培養(yǎng)箱。5.4冰箱：2℃～5℃，-20℃。1樣品的采集、運輸和保存采樣要求采樣應(yīng)符合SN/T1447的相關(guān)規(guī)定。采樣工具棉拭子、試管、剪刀、鑷子、注射器，經(jīng)濕熱滅菌30min。樣品的采集活體樣品活體樣品5～83～5管中冷藏，1～2組織樣品根據(jù)臨床癥狀的不同采集典型病料。在豬只死亡2h以內(nèi)，用剪刀、鑷子無菌采集肺臟、肺門淋巴結(jié)、扁桃體等器官和鼻腔分泌物。血液樣品用注射器無菌操作采集豬的血液，每頭不少于10mL。無菌分離血清，分裝，加蓋密封后4～8℃保存。樣品的運輸與保存采集的樣品應(yīng)置于低溫、密封的容器內(nèi)運輸。待檢樣品在2℃～8℃24h；若不能在規(guī)定時間內(nèi)送檢的，可保存于飽和30％甘油緩沖鹽水溶液中，但保存不應(yīng)超過72h。7操作步驟7.1細菌分離、培養(yǎng)及鑒定豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌分離、培養(yǎng)及鑒定按照DB34/T2997的規(guī)定執(zhí)行。2DNA（煮沸法）1mL1.5mL12000r/min5min；50μL雙蒸水混勻；10min，再冰浴5min；7.2.47.2.3，兩次；7.2.512000r/min5min，DNAPCRPCR50μL，其中含有12.5μL2×TaqPCRMasterMix，上、下游引物（10μmol/L）1μL，DNA5μL，去離子水補齊至50μL。PCR：95℃5min；95℃50s，63℃50s，721min，3572℃再延伸10min。PCR100mL1×TAE1.0％瓊脂糖凝膠，加入5μL10mg/mLEB。1×TAE7μLPCRDNA100V，100A30min。用凝膠成像儀觀察分析，并記錄、保存電泳結(jié)果。結(jié)果判定2、7、12500、396、559bp。27122、7、122、7、12PCRBB.1。8生物安全及防污染措施生物安全措施和防污染措施應(yīng)按照GB19489、GB/T27401和SN/T2025的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。3DB34/T3862DB34/T3862—2021DB34/T3862DB34/T3862—2021附錄A（規(guī)范性試劑配制試劑配制10×PCR緩沖液：200mmoI/LTris-HCl（pH8.4，室溫，200mmol/L氯化鉀，15mmol/L氯化鎂。1.0％0.5g50mL1×TAE35×TBE54gTris20mL5MH2.5g1L800mL1L44附錄B（規(guī)范性）豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌2、7、12型引物序列表B.1豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清型2、7、12引物序列血清型引物名稱片段大小/bp引物序列（5’→3’）2型Ap2F500ACTATGGCAATCAGTCGATTCATAp2RCCTAATCGGAAACGCCATTCTG7型Ap7F396GGTGACTGGCGTACGCCAAAAp7RGGGCTGCAGACTGACGTAA12型Ap12F559GGTTCTCCAGATGACTCTGAAAAp12RGCTATTGGATGAAGATGACTCAT55附錄C（資料性）2、7、12PCR

測結(jié)果電泳圖測M 1 2 3 4 －20001000750/r/