色譜分析法概論課件

歡迎大家！歡迎大家！儀器分析第9章色譜分析法概論色譜法分類

色譜常用術(shù)語

色譜分離的基本理論

色譜定性和定量的方法儀器分析第9章色譜分析法概論色譜法分類色譜分析法（chromatography，由英文單詞chroma“色彩”和graphy“圖譜”復(fù)合而成），它利用試樣中共存組分之間的吸附、分配、交換、遷移速率以及其它性能上的差異，先將它們分離，而后通過檢測器按一定順序進(jìn)行分析測定。主要包括色譜分析法（氣相色譜、液相色譜、紙色譜、薄層色譜、超臨界流體色譜等）、高效毛細(xì)管電泳法及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和色譜-光譜、波譜聯(lián)用法等。具有高靈敏度、高選擇性、高效能、分析速度快及應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。色譜分析法（chromatography，由俄國植物學(xué)家Tswett茨維特在1906年使用的裝置：色譜原型裝置如圖。色譜法是一種分離技術(shù)。1)用石油醚浸取葉片中的色素，然后將浸取液倒入一根填充CaCO3的直立玻璃管的頂端；2)再加入純石油醚進(jìn)行淋洗；3)淋洗的結(jié)果使玻璃管內(nèi)植物色素被分離成具有不同顏色的譜帶。4)淋洗時(shí)間足夠長時(shí)，被分離的組分就會隨石油醚先后流出柱外。玻璃管稱為色譜柱，管內(nèi)填充物(CaCO3)是固定不動(dòng)的，稱為固定相，淋洗劑（石油醚）是攜帶混合物流過固定相的流體，稱為流動(dòng)相。

俄國植物學(xué)家Tswett茨維特在1906年使用的裝置：色譜原9.1色譜法分類9.1色譜法分類色譜分析法概論課件色譜分析法概論課件9.2色譜常用術(shù)語1.色譜過程：色譜過程是物質(zhì)分子在相對運(yùn)動(dòng)的兩相間分配“平衡”的過程?；旌衔镏?，若各個(gè)組分被流動(dòng)相攜帶移動(dòng)的速率不相等，則形成差速遷移而被分離。9.2色譜常用術(shù)語1.色譜過程：2.色譜圖：色譜分析時(shí)，混合物中各組分經(jīng)色譜柱分離后，隨流動(dòng)相依次流出色譜柱，經(jīng)檢測器把各組分的濃度信號轉(zhuǎn)變成電信號，然后用記錄儀將組分的信號記錄下來。色譜圖(chromatogram)就是組分在檢測器上產(chǎn)生的信號強(qiáng)度對時(shí)間t所作的圖，由于它記錄了各組分流出色譜柱的情況所以又叫色譜流出曲線。2.色譜圖：色譜圖(chromatogram)就是組分在檢1）基線在一定色譜條件下，僅有流動(dòng)相通過檢測器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的信號的曲線，稱為基線(baseline)。基線反映儀器（主要是檢測器）的噪聲隨時(shí)間的變化。2）峰高色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離為峰高（peakheight），以h表示。其大小可以用紙的高度(mm)，電信號的大小(mV或mA)表示。3）峰寬色譜峰的寬度直接和分離效率有關(guān)。描述色譜峰峰寬的方法有三種方法。

（1）標(biāo)準(zhǔn)偏差(σ)：為峰高0.607倍處的色譜峰寬度的一半。σ值的大小表示組分流出的分散程度。（2）峰底寬(peakwidth，W)：通過色譜峰兩側(cè)的拐點(diǎn)作切線，在基線上的截距稱為峰寬，或稱基線寬度，以W或Y表示。（3）半峰寬(peakwidthathalfheight，W1/2或Y1/2)：峰高一半處的峰寬稱為半峰寬。1）基線3）峰寬3.色譜保留值：色譜保留值是色譜定性分析的依據(jù)，它體現(xiàn)了各待測組分在色譜柱（或板）上的滯留情況。在固定相中溶解性能越好，或與固定相的吸附性越強(qiáng)的組分，在柱中的滯留時(shí)間越長，或者說將組分帶出色譜柱所需的流動(dòng)相體積越大。所以保留值可以用保留時(shí)間或相應(yīng)的保留體積來描述。

1)死時(shí)間(deadtime,to)2)保留時(shí)間(retentiontime,tR)3)調(diào)整保留時(shí)間(adjustedretentiontime,tR`)4.死體積(deadvolume,Vo)

5.保留體積(retentionvolume,VR)

6.調(diào)整保留體積(adjustedretentionvolume,VR`)3.色譜保留值：1)死時(shí)間(deadtime,to)9.3色譜分離的基本理論色譜分離中，決定相鄰組分分離好壞的因素有兩個(gè)：一是兩組分的保留值之差即組分在色譜柱內(nèi)遷移速率的差異，它決定于兩組分與固定相、流動(dòng)相之間相互作用的差異；二是兩組分的峰寬它反映了組分區(qū)帶在移動(dòng)過程中的擴(kuò)張程度，很大程度上取決于色譜的分離條件。

9.3色譜分離的基本理論色譜分離中，決定相鄰組分分離好壞的組分的色譜保留特性是由組分在色譜系統(tǒng)中的熱力學(xué)性質(zhì)所決定的。對于分配色譜而言，該熱力學(xué)性質(zhì)即為分配系數(shù)和容量因子。1.分配系數(shù)（partitioncoefficient,K）在分配色譜中，固定相與流動(dòng)相中的溶質(zhì)分子處于動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，組分在兩相間達(dá)到分配平衡，該組分在固定相(S)中的濃度與在流動(dòng)相(m)中的濃度之比為一個(gè)常數(shù)，稱為分配系數(shù)，常表示為K，即9.3.1決定組分保留值的因素2.容量因子(capacityfactor，常寫作k`)又稱為分配比，即在平衡狀態(tài)下，組分在固定相與流動(dòng)相中的物質(zhì)的量之比。若用Vs和Vm分別表示色譜柱中固定相和流動(dòng)相的體積，則有組分的色譜保留特性是由組分在色譜系統(tǒng)中的熱力學(xué)性質(zhì)所決定的。3.相對保留值(relativeretentionvalue，r)又稱為選擇性因子（selectivityfactor,α），在相同操作條件下，后出峰的組分2與先出峰的組分1的調(diào)整保留值之比：β稱為兩相的相比。不能被固定相保留的組分，如GC中的空氣、甲烷等，ns=0，所以k`=0，它們實(shí)際測得的保留時(shí)間即為柱子的死時(shí)間to。k`值相當(dāng)于組分被固定相滯留的時(shí)間和流動(dòng)相通過系統(tǒng)所需時(shí)間的比值，即3.相對保留值(relativeretentionval【例9-1】一個(gè)氣相色譜柱，已知固定相的保留體積Vs=14.1mL，載氣流速為43.75mL/min。分離一個(gè)含有ABC三組分的樣品，測得組分的保留時(shí)間分別為A=1.41min，B=2.67min，C=4.18min，空氣為0.24min。試計(jì)算：（1）死體積（假定檢測器及柱接頭等體積忽略不計(jì)）；（2）各組分的調(diào)整保留時(shí)間和分配系數(shù)；（3）相鄰兩組分的相對保留值r。解（1）已知Fo=43.75mL/min，在忽略檢測器及柱接頭等體積的情況下,則死體積Vo=to×Fo=0.24×43.75=10.5mL。

(2)由可分別計(jì)算出三組分的調(diào)整保留時(shí)間：，，【例9-1】一個(gè)氣相色譜柱，已知固定相的保留體積Vs=14色譜分析法概論課件組分譜帶在色譜柱內(nèi)移動(dòng)時(shí)，不可避免地會逐步擴(kuò)張，對相鄰組分的分離帶來不利影響。組分譜帶的寬度反映了色譜柱作為一個(gè)分離器件的效能，即柱效（columnefficiency）。如何定量地描述柱效，柱效又與哪些因素有關(guān)，需要從色譜理論上解釋。通過色譜實(shí)驗(yàn)證明，在兩組分的分離過程中，分離效果和峰寬度及出峰時(shí)間相關(guān)。能夠解釋這一現(xiàn)象的理論首推塔板理論。9.3.2譜帶擴(kuò)張與柱效組分譜帶在色譜柱內(nèi)移動(dòng)時(shí)，不可避免地會逐步擴(kuò)1.塔板理論基本假設(shè)：（1）色譜柱是由一系列連續(xù)、等距的水平塔板組成。在柱子的每層塔板內(nèi)部，組分能夠在流動(dòng)相和固定相兩相中很快地達(dá)到平衡。（2）流動(dòng)相通過色譜柱時(shí)呈間歇式前進(jìn)運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，每次前進(jìn)一個(gè)塔板體積。（3）樣品和流動(dòng)相同時(shí)加在第1個(gè)塔板上，且樣品垂直于前進(jìn)方向的擴(kuò)散（即縱向擴(kuò)散）可以忽略。（4）分配系數(shù)在各塔板上是常數(shù)。這些假設(shè)實(shí)際上是把組分在兩相間的連續(xù)轉(zhuǎn)移過程，分解為間歇地在單個(gè)塔板中的分配平衡過程。也就是用分離過程的分解動(dòng)作來說明色譜過程。1.塔板理論理論塔板數(shù)n與色譜峰峰寬的實(shí)驗(yàn)參數(shù)有以下關(guān)系：塔板理論中，將每層塔板的高度稱為理論塔板高度(heightequivalenttoatheoreticalplate)，用H表示。若設(shè)色譜柱的柱長為L，理論塔板數(shù)（numberoftheoreticalplates）為n，則：在tR一定時(shí)，色譜峰越窄，即W或Wl/2越小，則理論塔板數(shù)n越大、理論塔板高度H越小，柱的分離效率也就越高。因此，一般把理論塔板數(shù)n和理論塔板高度H稱為柱效指標(biāo)。理論塔板數(shù)n與色譜峰峰寬的實(shí)驗(yàn)參數(shù)有以下關(guān)系：塔板理論中，將若扣除死時(shí)間的影響，用tR`代替tR計(jì)算出的理論塔板數(shù)稱為有效塔板數(shù)（n有效），所得的理論塔板高度稱為有效塔板高度（H有效）。若扣除死時(shí)間的影響，用tR`代替tR計(jì)算出的理論塔板數(shù)稱為有例9-2】已知?dú)庀嗌V柱長2.0m，固定相為白色硅藻土上涂漬的5%OV-17，柱溫125℃，載氣（N2）流速為30mL/min，記錄紙速為2.0cm/min。測定萘的保留時(shí)間為2.35min，半峰寬為0.20cm，求理論塔板數(shù)和理論塔板高度。若用甲烷測得死時(shí)間為0.20min，求有效塔板數(shù)和有效塔板高度。解：利用公式，將半峰寬單位換算成時(shí)間min，得扣除死時(shí)間的影響，例9-2】已知?dú)庀嗌V柱長2.0m，固定相為白色硅藻土上涂2.速率理論Martin最先指出，氣相色譜過程中溶質(zhì)分子的縱向擴(kuò)散是引起色譜區(qū)帶擴(kuò)張的主要因素。1956年，荷蘭學(xué)者VanDeemter等在塔板理論基礎(chǔ)上，研究了影響塔板高度H的因素，通過色譜實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在低流速時(shí)增加流速，峰變銳，即柱效增加；當(dāng)超過一定流速時(shí)峰變鈍，柱效降低。用塔板高度H對載氣流速u作圖為二次曲線，曲線最低點(diǎn)對應(yīng)的塔板高度最小，柱效最高，此時(shí)的流速稱為最佳流速（u最佳），由此導(dǎo)出了速率方程式（或稱范第姆特方程）：2.速率理論Martin最先指出，氣相色譜過程中溶質(zhì)分子的縱式中：H為塔板高度（cm）；A，B，C為與填充色譜柱有關(guān)的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。A、B/u和Cu三項(xiàng)是對塔板高度的具體影響因素，分別稱為渦流擴(kuò)散項(xiàng)、分子擴(kuò)散項(xiàng)和傳質(zhì)阻力項(xiàng)，由公式可知，只有這三項(xiàng)較小的情況下，H才可能小，峰形才可能變窄，柱效才會提高；u為載氣線速度。

式中：H為塔板高度（cm）；A，B，C為與填充色譜柱有關(guān)的實(shí)1)渦流擴(kuò)散(eddydiffusion)項(xiàng)

－A

A=2λdp

dp：固定相的平均顆粒直徑；λ：固定相的填充不均勻因子固定相顆粒越小dp↓，填充的越均勻，A↓，H↓，柱效n↑。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。1)渦流擴(kuò)散(eddydiffusion)項(xiàng)－A2)分子擴(kuò)散

(longitudinaldiffusion)項(xiàng)—B/u

B=2

γ

Dγ

：彎曲因子，填充柱色譜，γ

<1。D：試樣組分分子在氣相中的擴(kuò)散系數(shù)（cm2·s-1）。由于柱中存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴(kuò)散：

a.擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬，H↑(n↓)，分離變差。

b.分子擴(kuò)散項(xiàng)與流速有關(guān)，流速↓，滯留時(shí)間↑，擴(kuò)散↑

c.擴(kuò)散系數(shù)：D∝；Mr↑，B值↓2)分子擴(kuò)散(longitudinaldiffusion3)傳質(zhì)阻力(masstransfer)項(xiàng)—Cu流動(dòng)相的流速越快，傳質(zhì)阻力項(xiàng)Cu就越大，C稱為傳質(zhì)阻力系數(shù)，為固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)(Cs)和流動(dòng)相傳質(zhì)阻力系數(shù)(Cm)之和，即C=Cs+Cm。Cm是指組分分子從流動(dòng)相移向固定相表面進(jìn)行兩相之間的質(zhì)量交換時(shí)所受到的阻力。Cs指組分分子由流動(dòng)相進(jìn)入固定相后，擴(kuò)散到固定相內(nèi)部，達(dá)到分配平衡后，又回到界面，再逸出，被流動(dòng)相帶走這一過程中所受到的阻力。3)傳質(zhì)阻力(masstransfer)項(xiàng)—Cu流動(dòng)相的4)載氣流速與柱效-最佳流速載氣流速高時(shí)：傳質(zhì)阻力項(xiàng)是影響柱效的主要因素，流速，柱效,右圖曲線的右邊。H-u曲線與最佳流速：

由于流速對這兩項(xiàng)完全相反的作用，流速對柱效的總影響使得存在著一個(gè)最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對流速的一階導(dǎo)數(shù)有一極小值。以塔板高度H對應(yīng)載氣流速u作圖，曲線最低點(diǎn)的流速即為最佳流速。載氣流速低時(shí)：

分子擴(kuò)散項(xiàng)成為影響柱效的主要因素，流速，柱效，右圖曲線的坐邊。4)載氣流速與柱效-最佳流速載氣流速高時(shí)：H-u曲線與最其中A、B、C的數(shù)值可以通過在一定色譜條件下測得三種不同流速對應(yīng)的H值，建立一個(gè)三元一次方程求得，進(jìn)而求出H最小和u最小其中A、B、C的數(shù)值可以通過在一定色譜條件下測得三種不同流速9.3.3分離度多組分物質(zhì)分離的好壞可以用分離度R來衡量。一般兩個(gè)組分在色譜圖上必須要分開有足夠的距離，兩色譜峰互不重疊（tR要有足夠差別），峰形較窄，才可以認(rèn)為是彼此分開。

1.分離度(resolution，R)是衡量兩個(gè)相鄰色譜峰的分離程度的指標(biāo)，定義為相鄰兩色譜峰的保留值之差與兩峰寬度平均值之比，即：式中：tR1、tR2為相鄰兩個(gè)組分的保留時(shí)間，Wl、W2為對應(yīng)的峰寬。通過測量保留時(shí)間和峰寬即可求算相鄰峰的分離度。9.3.3分離度多組分物質(zhì)分離的好壞可以用分離度R來衡量。一2.影響分離度的因素將分離度（R）與柱效、選擇性聯(lián)系起來，可推出色譜分離的基本方程式。對于難分離的物質(zhì)對，它們的保留值相差很小，可以認(rèn)為W1=W2=W，k1`≈k2`

≈k`，可推出:

2.影響分離度的因素將分離度（R）與柱效、選擇性聯(lián)系起來，可首先相對保留值r對于相鄰組分的分離度有重要的影響。例如，當(dāng)r由1.10下降到1.05或1.02時(shí)，要保證R=1.5的分離效果，n需要相應(yīng)增加3.64倍與21.5倍。由于兩組分的r值與固定相、流動(dòng)相的性質(zhì)直接相關(guān)，說明根據(jù)難分離物質(zhì)對的化學(xué)性質(zhì)，合理選擇固定相和流動(dòng)相，增大r值，對于提高難分離物質(zhì)對的分離度可起到事半功倍的作用。其次分離度R與理論塔板數(shù)n的平方成正比。增加柱長L固然能增加理論塔板數(shù)n，但柱子過長，分離時(shí)間延長，柱阻也增加，峰變寬，不利于分離。在不改變塔板高度(H)的條件下，可得到分離度與柱長的關(guān)系為:最后增大容量因子k`值能改善分離情況，但同時(shí)分離時(shí)間將增長。k`值超過10以后，再增大對分離度的影響不顯著，但對分離時(shí)間的影響依然明顯。所以，k`值一般取2~10。首先相對保留值r對于相鄰組分的分離度有重要的影響。例如，當(dāng)r【例9-5】在一定條件下，兩個(gè)組分的調(diào)整保留時(shí)間分別為85秒和100秒，要達(dá)到完全分離，即R=1.5。計(jì)算需要多少塊有效塔板。若填充柱的塔板高度為0.1cm，柱長是多少？解：由【例9-5】在一定條件下，兩個(gè)組分的調(diào)整保留時(shí)間分別為859.4色譜定性和定量的方法9.4.1色譜定性方法1.保留值對比定性1）已知物對照法

同一種物質(zhì)在同一根色譜柱上，在相同的操作條件下保留值相同。適用于有對照品的已知組分的鑒定。先將試樣注入色譜柱，記錄色譜圖。再將適量的已知對照物質(zhì)加入試樣中，按相同方法測定。對比加入對照物前后的色譜圖，若加入后某色譜峰相對增高，則該色譜組分與對照物質(zhì)可能為同一物質(zhì)。9.4色譜定性和定量的方法9.4.1色譜定性方法1.保留值2)利用保留指數(shù)定性

又稱Kovats指數(shù)（Ⅰ），是一種重現(xiàn)性較好的定性參數(shù)。測定方法：將正構(gòu)烷烴作為標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定其保留指數(shù)為分子中碳原子個(gè)數(shù)乘以100（如正己烷的保留指數(shù)為600）。其它物質(zhì)的保留指數(shù)（IX）是通過選定兩個(gè)相鄰的正構(gòu)烷烴，其分別具有Z和Z＋1個(gè)碳原子。被測物質(zhì)X的調(diào)整保留時(shí)間應(yīng)在相鄰兩個(gè)正構(gòu)烷烴的調(diào)整保留值之間如圖所示：2)利用保留指數(shù)定性又稱Kovats指數(shù)（Ⅰ），是一種重現(xiàn)保留指數(shù)計(jì)算方法保留指數(shù)計(jì)算方法【例9-7】乙酸正定酯在阿匹松L柱上，柱溫100℃時(shí)，以記錄紙長度代表調(diào)整保留時(shí)間。正庚烷的調(diào)整保留時(shí)間為174.0s，正辛烷的調(diào)整保留時(shí)間為373.4s，乙酸丁酯的調(diào)整保留時(shí)間為310.0s，求乙酸丁酯的保留指數(shù)I。解：依題意可知，XZ=174.0mm，XZ+1=373.4mm，Xi=310.0mm【例9-7】乙酸正定酯在阿匹松L柱上，柱溫100℃時(shí)，以記2.利用化學(xué)反應(yīng)定性

把由色譜柱流出的待鑒定組分通入官能團(tuán)分類試劑中，觀察是否發(fā)生反應(yīng)（顯色或產(chǎn)生沉淀），可判斷該組分的官能團(tuán)或類別。例如，要鑒定組分是否為醛、酮，可將該色譜餾分通入2,4-二硝基苯肼試劑中，如產(chǎn)生橙色沉淀，則說明組分為1~8碳原子的醛或酮。3.與其他儀器聯(lián)用定性目前常用“在線”(on-line)聯(lián)用方式，用毛細(xì)管色譜柱與傅里葉紅外儀聯(lián)用(GC-FTIR)或與質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)。這些聯(lián)用儀器和技術(shù)已完全成熟，成為現(xiàn)代儀器分析的重要工具。其中毛細(xì)管氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用已成為藥物分析的重要手段，如揮發(fā)油的成分分析、部分治療藥物的鑒別和定量、違禁藥物的檢測、藥物代謝動(dòng)力學(xué)的研究等。2.利用化學(xué)反應(yīng)定性

把由色譜柱流出的待鑒定組分通入官能團(tuán)分SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIdentificationBACDSampleSample58901.0DEG/MI9.4.2定量分析法被測組分的色譜峰面積或峰高與待測組分的濃度成正比是色譜法定量的依據(jù)。現(xiàn)今的色譜儀色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)在記錄色譜圖的同時(shí)，可存儲、打印出各種參數(shù)和數(shù)據(jù)處理的結(jié)果，如峰高、峰面積、保留時(shí)間等。

1.定量校正因子相同量的不同組分在同一檢測器中的響應(yīng)值并不同，即相同量的不同組分產(chǎn)生不同值的峰高或峰面積，而且同一組分在不同的檢測器上也會有不同的響應(yīng)值。為使色譜峰的峰面積或峰高與組分含量間建立起確定的數(shù)量關(guān)系，就需要知道二者之間的比例系數(shù)，該比例系數(shù)就是定量校正因子f`。在相同色譜條件下，某一組分產(chǎn)生的色譜響應(yīng)值（峰面積A或峰高h(yuǎn)），與這一組分的質(zhì)量m成正比：f`為該組分在檢測器上的響應(yīng)斜率，是一個(gè)比例常數(shù)，稱為該組分的絕對校正因子。其物理含義是單位峰面積或單位峰高所代表的組分的量（質(zhì)量、物質(zhì)的量或體積）。9.4.2定量分析法1.定量校正因子f`為該由于各化合物的絕對校正因子不易測定，它隨實(shí)驗(yàn)條件而變化，不同實(shí)驗(yàn)室之間所測得的絕對校正因子往往不具有可比性，因而很少使用。實(shí)際工作中普遍采用相對校正因子，它定義為某組分i與所選定的基準(zhǔn)物質(zhì)s的絕對校正因子之比，以f表示，即:在實(shí)踐中，相對校正因子往往簡稱為校正因子。由于各化合物的絕對校正因子不易測定，它隨實(shí)驗(yàn)條件而變化，不同【例9-8】測定以苯為基準(zhǔn)物質(zhì)的甲苯、乙苯、鄰二甲苯的峰高的校正因子，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下：苯甲苯乙苯鄰二甲苯質(zhì)量/g0.59670.54780.61200.6680峰高/mm180.184.445.249.0【例9-8】測定以苯為基準(zhǔn)物質(zhì)的甲苯、乙苯、鄰二甲苯的峰高2.定量計(jì)算方法色譜定量計(jì)算方法常用的有三種：歸一化法、外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法。下面只以峰面積、校正因子為定量參數(shù)進(jìn)行討論，其他的可以類推。

1)面積歸一化法(areanormalizationmethod)

試樣中的各組分均能流出色譜柱，并在檢測器上出現(xiàn)相應(yīng)的色譜峰，可采用歸一化法定量。即是將試樣中所有組分含量之和定為100%，來計(jì)算被測組分的含量。假設(shè)試樣中有n個(gè)組分，每個(gè)組分的質(zhì)量分別為m1，m2，m3，…，mn，各組分質(zhì)量總和為m，則組分i的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.定量計(jì)算方法2)外標(biāo)法(externalstandardmethod)

用待測組分的純品作標(biāo)準(zhǔn)品（也稱為對照品），比較在相同條件下對照品與樣品中待測組分的峰面積或峰高，來進(jìn)行定量的方法稱為外標(biāo)法。外標(biāo)法中最常用的是標(biāo)準(zhǔn)曲線法(calibrationbystandards)，即將被測組分的標(biāo)準(zhǔn)品配制不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時(shí)配制一個(gè)樣品溶液。在完全相同條件下，以相同體積準(zhǔn)確進(jìn)樣得到各自的色譜圖。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度對其峰面積（或峰高）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，或按最小二乘法進(jìn)行線性回歸得出線性回歸方程，最后根據(jù)待測組分的信號，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得或從線性回歸方程計(jì)算出濃度。2)外標(biāo)法(externalstandardmethod3)內(nèi)標(biāo)法(internalstandardmethod)

內(nèi)標(biāo)法是在樣品中加入一種純物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)物，根據(jù)內(nèi)標(biāo)物與待測組分的定量校正因子、內(nèi)標(biāo)物與樣品的質(zhì)量和相應(yīng)的峰面積，求出樣品中待測組分的含量的一種方法。精密稱取質(zhì)量為m的樣品，再加入質(zhì)量為ms的內(nèi)標(biāo)物，溶解、混勻、進(jìn)樣。測得待測組分i的峰面積Ai、內(nèi)標(biāo)物的峰面積As，則樣品中所含組分i的質(zhì)量mi與內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量ms有下述關(guān)系：則待測組分在樣品中的含量wi(%)為:3)內(nèi)標(biāo)法(internalstandardmethod歡迎大家！歡迎大家！儀器分析第9章色譜分析法概論色譜法分類

色譜常用術(shù)語

色譜分離的基本理論

色譜定性和定量的方法儀器分析第9章色譜分析法概論色譜法分類色譜分析法（chromatography，由英文單詞chroma“色彩”和graphy“圖譜”復(fù)合而成），它利用試樣中共存組分之間的吸附、分配、交換、遷移速率以及其它性能上的差異，先將它們分離，而后通過檢測器按一定順序進(jìn)行分析測定。主要包括色譜分析法（氣相色譜、液相色譜、紙色譜、薄層色譜、超臨界流體色譜等）、高效毛細(xì)管電泳法及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和色譜-光譜、波譜聯(lián)用法等。具有高靈敏度、高選擇性、高效能、分析速度快及應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。色譜分析法（chromatography，由俄國植物學(xué)家Tswett茨維特在1906年使用的裝置：色譜原型裝置如圖。色譜法是一種分離技術(shù)。1)用石油醚浸取葉片中的色素，然后將浸取液倒入一根填充CaCO3的直立玻璃管的頂端；2)再加入純石油醚進(jìn)行淋洗；3)淋洗的結(jié)果使玻璃管內(nèi)植物色素被分離成具有不同顏色的譜帶。4)淋洗時(shí)間足夠長時(shí)，被分離的組分就會隨石油醚先后流出柱外。玻璃管稱為色譜柱，管內(nèi)填充物(CaCO3)是固定不動(dòng)的，稱為固定相，淋洗劑（石油醚）是攜帶混合物流過固定相的流體，稱為流動(dòng)相。

俄國植物學(xué)家Tswett茨維特在1906年使用的裝置：色譜原9.1色譜法分類9.1色譜法分類色譜分析法概論課件色譜分析法概論課件9.2色譜常用術(shù)語1.色譜過程：色譜過程是物質(zhì)分子在相對運(yùn)動(dòng)的兩相間分配“平衡”的過程?；旌衔镏?，若各個(gè)組分被流動(dòng)相攜帶移動(dòng)的速率不相等，則形成差速遷移而被分離。9.2色譜常用術(shù)語1.色譜過程：2.色譜圖：色譜分析時(shí)，混合物中各組分經(jīng)色譜柱分離后，隨流動(dòng)相依次流出色譜柱，經(jīng)檢測器把各組分的濃度信號轉(zhuǎn)變成電信號，然后用記錄儀將組分的信號記錄下來。色譜圖(chromatogram)就是組分在檢測器上產(chǎn)生的信號強(qiáng)度對時(shí)間t所作的圖，由于它記錄了各組分流出色譜柱的情況所以又叫色譜流出曲線。2.色譜圖：色譜圖(chromatogram)就是組分在檢1）基線在一定色譜條件下，僅有流動(dòng)相通過檢測器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的信號的曲線，稱為基線(baseline)?；€反映儀器（主要是檢測器）的噪聲隨時(shí)間的變化。2）峰高色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離為峰高（peakheight），以h表示。其大小可以用紙的高度(mm)，電信號的大小(mV或mA)表示。3）峰寬色譜峰的寬度直接和分離效率有關(guān)。描述色譜峰峰寬的方法有三種方法。

（1）標(biāo)準(zhǔn)偏差(σ)：為峰高0.607倍處的色譜峰寬度的一半。σ值的大小表示組分流出的分散程度。（2）峰底寬(peakwidth，W)：通過色譜峰兩側(cè)的拐點(diǎn)作切線，在基線上的截距稱為峰寬，或稱基線寬度，以W或Y表示。（3）半峰寬(peakwidthathalfheight，W1/2或Y1/2)：峰高一半處的峰寬稱為半峰寬。1）基線3）峰寬3.色譜保留值：色譜保留值是色譜定性分析的依據(jù)，它體現(xiàn)了各待測組分在色譜柱（或板）上的滯留情況。在固定相中溶解性能越好，或與固定相的吸附性越強(qiáng)的組分，在柱中的滯留時(shí)間越長，或者說將組分帶出色譜柱所需的流動(dòng)相體積越大。所以保留值可以用保留時(shí)間或相應(yīng)的保留體積來描述。

1)死時(shí)間(deadtime,to)2)保留時(shí)間(retentiontime,tR)3)調(diào)整保留時(shí)間(adjustedretentiontime,tR`)4.死體積(deadvolume,Vo)

5.保留體積(retentionvolume,VR)

6.調(diào)整保留體積(adjustedretentionvolume,VR`)3.色譜保留值：1)死時(shí)間(deadtime,to)9.3色譜分離的基本理論色譜分離中，決定相鄰組分分離好壞的因素有兩個(gè)：一是兩組分的保留值之差即組分在色譜柱內(nèi)遷移速率的差異，它決定于兩組分與固定相、流動(dòng)相之間相互作用的差異；二是兩組分的峰寬它反映了組分區(qū)帶在移動(dòng)過程中的擴(kuò)張程度，很大程度上取決于色譜的分離條件。

9.3色譜分離的基本理論色譜分離中，決定相鄰組分分離好壞的組分的色譜保留特性是由組分在色譜系統(tǒng)中的熱力學(xué)性質(zhì)所決定的。對于分配色譜而言，該熱力學(xué)性質(zhì)即為分配系數(shù)和容量因子。1.分配系數(shù)（partitioncoefficient,K）在分配色譜中，固定相與流動(dòng)相中的溶質(zhì)分子處于動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，組分在兩相間達(dá)到分配平衡，該組分在固定相(S)中的濃度與在流動(dòng)相(m)中的濃度之比為一個(gè)常數(shù)，稱為分配系數(shù)，常表示為K，即9.3.1決定組分保留值的因素2.容量因子(capacityfactor，常寫作k`)又稱為分配比，即在平衡狀態(tài)下，組分在固定相與流動(dòng)相中的物質(zhì)的量之比。若用Vs和Vm分別表示色譜柱中固定相和流動(dòng)相的體積，則有組分的色譜保留特性是由組分在色譜系統(tǒng)中的熱力學(xué)性質(zhì)所決定的。3.相對保留值(relativeretentionvalue，r)又稱為選擇性因子（selectivityfactor,α），在相同操作條件下，后出峰的組分2與先出峰的組分1的調(diào)整保留值之比：β稱為兩相的相比。不能被固定相保留的組分，如GC中的空氣、甲烷等，ns=0，所以k`=0，它們實(shí)際測得的保留時(shí)間即為柱子的死時(shí)間to。k`值相當(dāng)于組分被固定相滯留的時(shí)間和流動(dòng)相通過系統(tǒng)所需時(shí)間的比值，即3.相對保留值(relativeretentionval【例9-1】一個(gè)氣相色譜柱，已知固定相的保留體積Vs=14.1mL，載氣流速為43.75mL/min。分離一個(gè)含有ABC三組分的樣品，測得組分的保留時(shí)間分別為A=1.41min，B=2.67min，C=4.18min，空氣為0.24min。試計(jì)算：（1）死體積（假定檢測器及柱接頭等體積忽略不計(jì)）；（2）各組分的調(diào)整保留時(shí)間和分配系數(shù)；（3）相鄰兩組分的相對保留值r。解（1）已知Fo=43.75mL/min，在忽略檢測器及柱接頭等體積的情況下,則死體積Vo=to×Fo=0.24×43.75=10.5mL。

(2)由可分別計(jì)算出三組分的調(diào)整保留時(shí)間：，，【例9-1】一個(gè)氣相色譜柱，已知固定相的保留體積Vs=14色譜分析法概論課件組分譜帶在色譜柱內(nèi)移動(dòng)時(shí)，不可避免地會逐步擴(kuò)張，對相鄰組分的分離帶來不利影響。組分譜帶的寬度反映了色譜柱作為一個(gè)分離器件的效能，即柱效（columnefficiency）。如何定量地描述柱效，柱效又與哪些因素有關(guān)，需要從色譜理論上解釋。通過色譜實(shí)驗(yàn)證明，在兩組分的分離過程中，分離效果和峰寬度及出峰時(shí)間相關(guān)。能夠解釋這一現(xiàn)象的理論首推塔板理論。9.3.2譜帶擴(kuò)張與柱效組分譜帶在色譜柱內(nèi)移動(dòng)時(shí)，不可避免地會逐步擴(kuò)1.塔板理論基本假設(shè)：（1）色譜柱是由一系列連續(xù)、等距的水平塔板組成。在柱子的每層塔板內(nèi)部，組分能夠在流動(dòng)相和固定相兩相中很快地達(dá)到平衡。（2）流動(dòng)相通過色譜柱時(shí)呈間歇式前進(jìn)運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，每次前進(jìn)一個(gè)塔板體積。（3）樣品和流動(dòng)相同時(shí)加在第1個(gè)塔板上，且樣品垂直于前進(jìn)方向的擴(kuò)散（即縱向擴(kuò)散）可以忽略。（4）分配系數(shù)在各塔板上是常數(shù)。這些假設(shè)實(shí)際上是把組分在兩相間的連續(xù)轉(zhuǎn)移過程，分解為間歇地在單個(gè)塔板中的分配平衡過程。也就是用分離過程的分解動(dòng)作來說明色譜過程。1.塔板理論理論塔板數(shù)n與色譜峰峰寬的實(shí)驗(yàn)參數(shù)有以下關(guān)系：塔板理論中，將每層塔板的高度稱為理論塔板高度(heightequivalenttoatheoreticalplate)，用H表示。若設(shè)色譜柱的柱長為L，理論塔板數(shù)（numberoftheoreticalplates）為n，則：在tR一定時(shí)，色譜峰越窄，即W或Wl/2越小，則理論塔板數(shù)n越大、理論塔板高度H越小，柱的分離效率也就越高。因此，一般把理論塔板數(shù)n和理論塔板高度H稱為柱效指標(biāo)。理論塔板數(shù)n與色譜峰峰寬的實(shí)驗(yàn)參數(shù)有以下關(guān)系：塔板理論中，將若扣除死時(shí)間的影響，用tR`代替tR計(jì)算出的理論塔板數(shù)稱為有效塔板數(shù)（n有效），所得的理論塔板高度稱為有效塔板高度（H有效）。若扣除死時(shí)間的影響，用tR`代替tR計(jì)算出的理論塔板數(shù)稱為有例9-2】已知?dú)庀嗌V柱長2.0m，固定相為白色硅藻土上涂漬的5%OV-17，柱溫125℃，載氣（N2）流速為30mL/min，記錄紙速為2.0cm/min。測定萘的保留時(shí)間為2.35min，半峰寬為0.20cm，求理論塔板數(shù)和理論塔板高度。若用甲烷測得死時(shí)間為0.20min，求有效塔板數(shù)和有效塔板高度。解：利用公式，將半峰寬單位換算成時(shí)間min，得扣除死時(shí)間的影響，例9-2】已知?dú)庀嗌V柱長2.0m，固定相為白色硅藻土上涂2.速率理論Martin最先指出，氣相色譜過程中溶質(zhì)分子的縱向擴(kuò)散是引起色譜區(qū)帶擴(kuò)張的主要因素。1956年，荷蘭學(xué)者VanDeemter等在塔板理論基礎(chǔ)上，研究了影響塔板高度H的因素，通過色譜實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在低流速時(shí)增加流速，峰變銳，即柱效增加；當(dāng)超過一定流速時(shí)峰變鈍，柱效降低。用塔板高度H對載氣流速u作圖為二次曲線，曲線最低點(diǎn)對應(yīng)的塔板高度最小，柱效最高，此時(shí)的流速稱為最佳流速（u最佳），由此導(dǎo)出了速率方程式（或稱范第姆特方程）：2.速率理論Martin最先指出，氣相色譜過程中溶質(zhì)分子的縱式中：H為塔板高度（cm）；A，B，C為與填充色譜柱有關(guān)的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。A、B/u和Cu三項(xiàng)是對塔板高度的具體影響因素，分別稱為渦流擴(kuò)散項(xiàng)、分子擴(kuò)散項(xiàng)和傳質(zhì)阻力項(xiàng)，由公式可知，只有這三項(xiàng)較小的情況下，H才可能小，峰形才可能變窄，柱效才會提高；u為載氣線速度。

式中：H為塔板高度（cm）；A，B，C為與填充色譜柱有關(guān)的實(shí)1)渦流擴(kuò)散(eddydiffusion)項(xiàng)

－A

A=2λdp

dp：固定相的平均顆粒直徑；λ：固定相的填充不均勻因子固定相顆粒越小dp↓，填充的越均勻，A↓，H↓，柱效n↑。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。1)渦流擴(kuò)散(eddydiffusion)項(xiàng)－A2)分子擴(kuò)散

(longitudinaldiffusion)項(xiàng)—B/u

B=2

γ

Dγ

：彎曲因子，填充柱色譜，γ

<1。D：試樣組分分子在氣相中的擴(kuò)散系數(shù)（cm2·s-1）。由于柱中存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴(kuò)散：

a.擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬，H↑(n↓)，分離變差。

b.分子擴(kuò)散項(xiàng)與流速有關(guān)，流速↓，滯留時(shí)間↑，擴(kuò)散↑

c.擴(kuò)散系數(shù)：D∝；Mr↑，B值↓2)分子擴(kuò)散(longitudinaldiffusion3)傳質(zhì)阻力(masstransfer)項(xiàng)—Cu流動(dòng)相的流速越快，傳質(zhì)阻力項(xiàng)Cu就越大，C稱為傳質(zhì)阻力系數(shù)，為固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)(Cs)和流動(dòng)相傳質(zhì)阻力系數(shù)(Cm)之和，即C=Cs+Cm。Cm是指組分分子從流動(dòng)相移向固定相表面進(jìn)行兩相之間的質(zhì)量交換時(shí)所受到的阻力。Cs指組分分子由流動(dòng)相進(jìn)入固定相后，擴(kuò)散到固定相內(nèi)部，達(dá)到分配平衡后，又回到界面，再逸出，被流動(dòng)相帶走這一過程中所受到的阻力。3)傳質(zhì)阻力(masstransfer)項(xiàng)—Cu流動(dòng)相的4)載氣流速與柱效-最佳流速載氣流速高時(shí)：傳質(zhì)阻力項(xiàng)是影響柱效的主要因素，流速，柱效,右圖曲線的右邊。H-u曲線與最佳流速：

由于流速對這兩項(xiàng)完全相反的作用，流速對柱效的總影響使得存在著一個(gè)最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對流速的一階導(dǎo)數(shù)有一極小值。以塔板高度H對應(yīng)載氣流速u作圖，曲線最低點(diǎn)的流速即為最佳流速。載氣流速低時(shí)：

分子擴(kuò)散項(xiàng)成為影響柱效的主要因素，流速，柱效，右圖曲線的坐邊。4)載氣流速與柱效-最佳流速載氣流速高時(shí)：H-u曲線與最其中A、B、C的數(shù)值可以通過在一定色譜條件下測得三種不同流速對應(yīng)的H值，建立一個(gè)三元一次方程求得，進(jìn)而求出H最小和u最小其中A、B、C的數(shù)值可以通過在一定色譜條件下測得三種不同流速9.3.3分離度多組分物質(zhì)分離的好壞可以用分離度R來衡量。一般兩個(gè)組分在色譜圖上必須要分開有足夠的距離，兩色譜峰互不重疊（tR要有足夠差別），峰形較窄，才可以認(rèn)為是彼此分開。

1.分離度(resolution，R)是衡量兩個(gè)相鄰色譜峰的分離程度的指標(biāo)，定義為相鄰兩色譜峰的保留值之差與兩峰寬度平均值之比，即：式中：tR1、tR2為相鄰兩個(gè)組分的保留時(shí)間，Wl、W2為對應(yīng)的峰寬。通過測量保留時(shí)間和峰寬即可求算相鄰峰的分離度。9.3.3分離度多組分物質(zhì)分離的好壞可以用分離度R來衡量。一2.影響分離度的因素將分離度（R）與柱效、選擇性聯(lián)系起來，可推出色譜分離的基本方程式。對于難分離的物質(zhì)對，它們的保留值相差很小，可以認(rèn)為W1=W2=W，k1`≈k2`

≈k`，可推出:

2.影響分離度的因素將分離度（R）與柱效、選擇性聯(lián)系起來，可首先相對保留值r對于相鄰組分的分離度有重要的影響。例如，當(dāng)r由1.10下降到1.05或1.02時(shí)，要保證R=1.5的分離效果，n需要相應(yīng)增加3.64倍與21.5倍。由于兩組分的r值與固定相、流動(dòng)相的性質(zhì)直接相關(guān)，說明根據(jù)難分離物質(zhì)對的化學(xué)性質(zhì)，合理選擇固定相和流動(dòng)相，增大r值，對于提高難分離物質(zhì)對的分離度可起到事半功倍的作用。其次分離度R與理論塔板數(shù)n的平方成正比。增加柱長L固然能增加理論塔板數(shù)n，但柱子過長，分離時(shí)間延長，柱阻也增加，峰變寬，不利于分離。在不改變塔板高度(H)的條件下，可得到分離度與柱長的關(guān)系為:最后增大容量因子k`值能改善分離情況，但同時(shí)分離時(shí)間將增長。k`值超過10以后，再增大對分離度的影響不顯著，但對分離時(shí)間的影響依然明顯。所以，k`值一般取2~10。首先相對保留值r對于相鄰組分的分離度有重要的影響。例如，當(dāng)r【例9-5】在一定條件下，兩個(gè)組分的調(diào)整保留時(shí)間分別為85秒和100秒，要達(dá)到完全分離，即R=1.5。計(jì)算需要多少塊有效塔板。若填充柱的塔板高度為0.1cm，柱長是多少？解：由【例9-5】在一定條件下，兩個(gè)組分的調(diào)整保留時(shí)間分別為859.4色譜定性和定量的方法9.4.1色譜定性方法1.保留值對比定性1）已知物對照法

同一種物質(zhì)在同一根色譜柱上，在相同的操作條件下保留值相同。適用于有對照品的已知組分的鑒定。先將試樣注入色譜柱，記錄色譜圖。再將適量的已知對照物質(zhì)加入試樣中，按相同方法測定。對比加入對照物前后的色譜圖，若加入后某色譜峰相對增高，則該色譜組分與對照物質(zhì)可能為同一物質(zhì)。9.4色譜定性和定量的方法9.4.1色譜定性方法1.保留值2)利用保留指數(shù)定性

又稱Kovats指數(shù)（Ⅰ），是一種重現(xiàn)性較好的定性參數(shù)。測定方法：將正構(gòu)烷烴作為標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定其保留指數(shù)為分子中碳原子個(gè)數(shù)乘以100（如正己烷的保留指數(shù)為600）。其它物質(zhì)的保留指數(shù)（IX）是通過選定兩個(gè)相鄰的正構(gòu)烷烴，其分別具有Z和Z＋1個(gè)碳原子。被測物質(zhì)X的調(diào)整保留時(shí)間應(yīng)在相鄰兩個(gè)正構(gòu)烷烴的調(diào)整保留值之間如圖所示：2)利用保留指數(shù)定性又稱Kovats指數(shù)（Ⅰ），是一種重現(xiàn)保留指數(shù)計(jì)算方法保留指數(shù)計(jì)算方法【例9-7】乙酸正定酯在阿匹松L柱上，柱溫100℃時(shí)，以記錄紙長度代表調(diào)整保留時(shí)間。正庚烷的調(diào)整保留時(shí)間為174.0s，正辛烷的調(diào)整保留時(shí)間為373.4s，乙酸丁酯的調(diào)整保留時(shí)間為310.0s，求乙酸丁酯的保留指數(shù)I。解：依題意可知，XZ=174.0mm，XZ+1=373.4mm，Xi=310.0mm【例9-7】乙酸正定酯在阿匹松L柱上，柱溫100℃時(shí)，以記2.利用化學(xué)反應(yīng)定性

把由色譜柱流出的待鑒定組分通入官能團(tuán)分類試劑中，觀察是否發(fā)生反應(yīng)（顯色或產(chǎn)生沉淀），可判斷該組分的官能團(tuán)或類別。例如，要鑒定組分是否為醛、酮，可將該色譜餾分通入2,4-二硝基苯肼試劑中，如產(chǎn)生橙色沉淀，則說明組分為1~8碳原子的醛或酮。3.與其他儀器聯(lián)用定性目前常用“在線”(on-line)聯(lián)用方式，用毛細(xì)管色譜柱與傅里葉紅外儀聯(lián)用(GC-FTIR)或與質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)。這些聯(lián)用儀器和技術(shù)已完全成熟，成為現(xiàn)代儀器分析的重要工具。其中毛細(xì)管氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用已成為藥物分析的重要手段，如揮發(fā)油的成分分析、部分治療藥物的鑒別和定量、違禁藥物的檢測、藥物代謝動(dòng)力學(xué)的研