培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌市公開(kāi)課一等獎(jiǎng)省賽課獲獎(jiǎng)?wù)n件

微生物基礎(chǔ)試驗(yàn)項(xiàng)目

1、培養(yǎng)基制備與滅菌；2、微生物分離培養(yǎng)與菌落觀察；3、水細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)；4、細(xì)菌染色檢驗(yàn)：簡(jiǎn)單染色、革蘭氏染色、芽孢與莢膜染色；5、放線菌、霉菌形態(tài)觀察；6、微生物生理、生化反應(yīng)；7、微生物直接計(jì)數(shù)與大小測(cè)定；8、環(huán)境原因?qū)ξ⑸镉绊憽?/p>

培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第1頁(yè)微生物基礎(chǔ)試驗(yàn)注意事項(xiàng)1、提升安全意識(shí)，正確操作儀器；2、培養(yǎng)無(wú)菌操作觀念；3、自覺(jué)清洗器皿；4、重視保持環(huán)境衛(wèi)生和試驗(yàn)室秩序；

培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第2頁(yè)培養(yǎng)基制備與滅菌

一、目標(biāo)：

1、學(xué)習(xí)普通培養(yǎng)基制備方法；

2、掌握高壓蒸汽滅菌技術(shù)，了解幾個(gè)慣用滅菌方法。培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第3頁(yè)

二、原理

1、培養(yǎng)基(culturemedium)：培養(yǎng)基是按照微生物生長(zhǎng)繁殖所需要各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成一個(gè)基質(zhì)。

培養(yǎng)基種類(lèi)：依據(jù)培養(yǎng)基成份可分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基；按物理性狀不一樣，可分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基；依據(jù)培養(yǎng)基特殊用途可分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基和判別培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第4頁(yè)

⑴天然培養(yǎng)基：主要成份是天然有機(jī)物質(zhì)，如馬鈴薯、玉米粉、豆餅粉、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等，其成份未完全了解，且各批次不均一。適合用于生產(chǎn)上大規(guī)模培養(yǎng)微生物。

⑵合成培養(yǎng)基：成份明確化學(xué)藥品配制而成培養(yǎng)基。如：高氏一號(hào)培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基等。普通適合用于在試驗(yàn)室范圍內(nèi)研究微生物形態(tài)、營(yíng)養(yǎng)代謝、分類(lèi)判定、生物測(cè)定、菌種選育和遺傳分析等工作。

⑶半合成培養(yǎng)基：在天然有機(jī)物基礎(chǔ)上，適當(dāng)補(bǔ)充一些成份已知化學(xué)藥品所配制培養(yǎng)基。含有廣泛應(yīng)用，如馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，適合很多霉菌生長(zhǎng)。培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第5頁(yè)

⑴液體培養(yǎng)基：配好后成為液體狀態(tài)培養(yǎng)基。如糖發(fā)酵液體培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基等。廣泛用于理論研究和大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵。

⑵固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑形成固態(tài)培養(yǎng)基。慣用凝固劑有瓊脂、明膠、硅膠。硅膠用于配制自養(yǎng)微生物固體培養(yǎng)基；對(duì)于其它多數(shù)微生物來(lái)講，瓊脂最為適當(dāng)，普通加入1.5-2.5%，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基等。此培養(yǎng)基可供微生物分離、判定、菌種保藏等。⑶半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入少許凝固劑即配成為半固體培養(yǎng)基，如，加入0.2-0.7%瓊脂作為凝固劑。用來(lái)觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)特征、判定菌種、菌種保藏和噬菌體效價(jià)滴定等。培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第6頁(yè)

依據(jù)培養(yǎng)基特殊用途分類(lèi)：

⑴基礎(chǔ)培養(yǎng)基：含有普通細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，慣用基礎(chǔ)培養(yǎng)基是牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，也是作為一些特殊培養(yǎng)基基礎(chǔ)成份。

⑵加富培養(yǎng)基：是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入血、血清、動(dòng)物組織提取液或植物組織提取液，主要用于培養(yǎng)一些對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較為苛刻微生物。培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第7頁(yè)

⑶選擇培養(yǎng)基：依據(jù)某一個(gè)或某一類(lèi)微生物特殊營(yíng)養(yǎng)要求或?qū)σ恍┪锢?、化學(xué)條件抗性而設(shè)計(jì)培養(yǎng)基。①依據(jù)一些微生物對(duì)碳、氮源特殊要求來(lái)設(shè)計(jì)選擇性培養(yǎng)基，能夠分離到能分解一些物質(zhì)微生物。②在培養(yǎng)基中加入一些化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要微生物生長(zhǎng)繁殖。如在分離放線菌時(shí)，在培養(yǎng)基中添加10%酚數(shù)滴可抑制細(xì)菌和霉菌生長(zhǎng)。

⑷判別培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某種化合物或化學(xué)試劑，使培養(yǎng)微生物產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物與該化合物或化學(xué)試劑發(fā)生顯著特征性反應(yīng)，依據(jù)這一特征性反應(yīng)能夠?qū)⒋朔N微生物與其它種微生物區(qū)分開(kāi)來(lái)，如伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第8頁(yè)2、滅菌：消毒與滅菌是兩個(gè)不一樣概念。

消毒：普通是指毀滅病原菌和有害微生物營(yíng)養(yǎng)體而言，而不能殺死全部芽孢，所以，消毒對(duì)微生物殺滅是不徹底，而且往往只能作用到物體表面，只能作為普通衛(wèi)生辦法。如使用酒精、84消毒液浸泡或煮沸法對(duì)器械表面消毒處理，用紫外燈對(duì)房間進(jìn)行照射等。

滅菌：殺滅一切微生物營(yíng)養(yǎng)體、芽孢和孢子，所以，滅菌后物品不再帶有活體微生物。滅菌方法很多，如加熱(干熱或濕熱)、過(guò)濾等。培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第9頁(yè)⑴干熱法滅菌：a)

火焰燒灼：適合用于接種環(huán)、接種針、鑷子等金屬用具，無(wú)菌操作時(shí)試管口和瓶口也在火焰上短暫燒灼滅菌。

b)熱空氣滅菌：使用電熱干燥箱，借助熱空氣在160-1700C下保溫2小時(shí)進(jìn)行滅菌，此法適合用于玻璃器皿（如吸管和培養(yǎng)皿）等滅菌，對(duì)帶膠皮器物或培養(yǎng)基不適用。培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第10頁(yè)⑵濕熱滅菌：a)高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持15—30分鐘進(jìn)行滅菌。這種滅菌適合用于培養(yǎng)基等滅菌。b)間歇滅菌法少數(shù)培養(yǎng)基，比如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、含糖培養(yǎng)基等，高溫高壓滅菌易被破壞，適用間歇滅菌法。此法是用阿諾氏流動(dòng)蒸汽滅菌器進(jìn)行滅菌，將滅菌培養(yǎng)基放入滅菌器內(nèi)，天天加熱1000C，30分鐘，連續(xù)3天，第一天加熱后，其中營(yíng)養(yǎng)體被殺死，將培養(yǎng)物去出放室溫下18-二十四小時(shí)，使其中芽孢發(fā)育成營(yíng)養(yǎng)體，第二天再加熱1000C，30分鐘，發(fā)育營(yíng)養(yǎng)體又被殺死，但可能仍有芽孢，故再重復(fù)一次，使徹底滅菌。培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第11頁(yè)

三、材料：

1、藥品：NaCl蛋白胨牛肉膏可溶性淀粉K2HPO4HClNaOH瓊脂葡萄糖蔗糖Na2SO4

黃豆芽馬鈴薯伊紅美藍(lán)等。

2、器材：臺(tái)秤三角瓶試管漏斗電爐搪瓷杯（鋁鍋）試管架玻棒滴管稱量紙pH試紙棉花紗布牛皮紙棉線滅菌鍋干燥箱等。培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第12頁(yè)

四、方法及步驟：

1、培養(yǎng)基配制普通可分為稱量、溶化、pH調(diào)整、過(guò)濾和分裝等步驟

⑴稱量：按照培養(yǎng)基配方，稱取各種成份；⑵溶化：在容器中先加入所需蒸餾水水量一部分，依次將各成份加入，使全部溶解，最終補(bǔ)足水量。若用蛋白胨、牛肉膏等物質(zhì)配制培養(yǎng)基時(shí)，需加熱溶解，并補(bǔ)足水分。配制固體培養(yǎng)基時(shí)，先將上述配好液體培養(yǎng)基加熱到快沸時(shí)，再將稱好瓊脂加入，繼續(xù)加熱到瓊脂完全熔化，在加熱過(guò)程中要不停攪拌，以免瓊脂糊底，并控制火力，預(yù)防沸騰外溢。培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第13頁(yè)

⑶矯正pH值：初配制好培養(yǎng)基，往往不能符合所需求pH值，故必須矯正，用精密pH試紙，以1NHCl或1NNaOH調(diào)整至所需要pH值。

⑷過(guò)濾：用濾紙、棉花或雙層紗布過(guò)濾。

⑸分裝：將制成培養(yǎng)基分裝于三角瓶或試管內(nèi)。培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第14頁(yè)馬鈴薯糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)

成份：馬鈴薯200g

蔗糖20g

瓊脂25g

水補(bǔ)足1000ml

方法：將馬鈴薯洗凈去皮切塊，放入搪瓷杯中，摻適量水加熱煮沸30分鐘（注意不時(shí)用玻棒攪拌，防止糊底），用雙層紗布濾去薯塊，在薯汁中加入瓊脂，加熱熔化，再加入葡萄糖，完全溶化后，用水補(bǔ)足體積，趁熱分裝到三角瓶中，121℃滅菌20min。

注：無(wú)須調(diào)pH值，保持自然酸性。培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第15頁(yè)伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB)

成份1：蛋白胨10gNaCl5g

乳糖4g

瓊脂25g蒸餾水1000mlpH7.6

成份2：2%伊紅水溶液2ml，0.5%美藍(lán)水溶液1ml

方法：先配成份1，調(diào)好pH值后才可加入成份2，混勻，趁熱分裝到三角瓶中，115℃滅菌20min。培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第16頁(yè)3倍濃縮乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基

成份1：蛋白胨30g

牛肉膏9g

乳糖15gNaCl

15g蒸餾水

補(bǔ)足1000mlpH7.2

成份2：1.6%溴鉀酚紫乙醇溶液3ml

方法：先配成份1，調(diào)好pH值后才可加入成份2，混勻，分裝到三角瓶及大試管中，并加入倒置事先充滿該培養(yǎng)液杜氏管（勿留氣泡），封口后115℃滅菌20min。培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第17頁(yè)相關(guān)操作棉塞制作：封管口或瓶口棉塞要做形狀、大小、松緊完全適當(dāng)，緊貼管壁不留縫隙，正常棉塞，頭稍大些，約有2/5在外，3/5在管(瓶)內(nèi)。

培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第18頁(yè)培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第19頁(yè)

2、滅菌：⑴干熱滅菌步驟：

①將要滅菌器皿（培養(yǎng)皿、吸管等）包扎好，放入恒溫干燥箱內(nèi)。②接通電源，打開(kāi)開(kāi)關(guān)；旋動(dòng)恒溫調(diào)整器至1400C，當(dāng)?shù)竭_(dá)此溫度時(shí)，借助恒溫調(diào)整器自動(dòng)控制，保持恒溫兩小時(shí)。③兩小時(shí)后，關(guān)掉電源，當(dāng)溫度降至600C以下后，才可打開(kāi)箱門(mén)，取出滅菌物品。培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第20頁(yè)（2）高壓蒸汽滅菌

原理：在密閉容器中加熱形成蒸汽不停堆積，使蒸汽壓力升高，溫度也對(duì)應(yīng)升高，超出水沸點(diǎn)。利用過(guò)熱蒸汽來(lái)使細(xì)菌及其耐熱芽孢蛋白質(zhì)凝固變性，以致失去生命力，從而到達(dá)徹底滅菌效果。高壓蒸汽滅菌是最有效滅菌方法。普通在1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持15~30分鐘進(jìn)行滅菌，就可殺死一切微生物細(xì)胞及其芽孢或孢子。滅菌對(duì)象是培養(yǎng)基、玻璃器皿和各種不因高溫處理而變質(zhì)物品材料。但對(duì)不耐高溫、高壓溶液或培養(yǎng)基不宜用此種方法。培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第21頁(yè)手提式蒸汽滅菌鍋立式蒸汽滅菌鍋（電加熱、自動(dòng)或半自動(dòng)）臥式蒸汽滅菌鍋培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第22頁(yè)高壓蒸汽滅菌鍋使用：

①鍋內(nèi)加入適量水，使水面與三腳擱架相平為宜。②把要滅菌材料裝入鍋內(nèi)，注意不要放得太擠，防礙蒸汽流通，影響滅菌效果。③蓋好滅菌鍋鍋蓋，按對(duì)角線形式均勻擰緊鍋蓋上螺栓，螺栓松緊一致，以免漏氣。④打開(kāi)電源，開(kāi)啟排汽閥，以排除鍋內(nèi)冷空氣。⑤待冷空氣完全排盡后，關(guān)閉排汽開(kāi)關(guān)。讓鍋內(nèi)溫度隨蒸汽壓力增加而逐步上升，當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)。控制熱源，維持壓力至所需時(shí)間。本試驗(yàn)依據(jù)培養(yǎng)基不一樣，分別采取：1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持20分鐘；0.7kg/cm2（10磅/英寸2），115.60C保持20分鐘。培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第23頁(yè)

⑥滅菌所需時(shí)間到后，關(guān)閉熱源。⑦讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力降至“0”時(shí)，打開(kāi)排汽閥。⑧打開(kāi)滅菌鍋蓋，取出已滅菌物品及培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第24頁(yè)五、培養(yǎng)基配制及器材準(zhǔn)備：

1組：配牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基ml，分裝于16個(gè)250ml三角瓶；2組：配牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1000ml，分裝于200支試管；3組：高氏1號(hào)固體培養(yǎng)基ml,分裝于16個(gè)250ml三角瓶；4組：高氏1號(hào)固體培養(yǎng)基1000ml,分裝于4個(gè)250ml三角瓶和20支試管；5組：馬鈴薯固體培養(yǎng)基ml，分裝于16個(gè)250ml三角瓶；6組：馬鈴薯固體培養(yǎng)基1000ml,分裝于6個(gè)250ml三角瓶；7組：豆芽汁培養(yǎng)基ml,分裝于16個(gè)250ml三角瓶；8組：無(wú)氮培養(yǎng)基500ml,分裝于30支試管

培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第25頁(yè)五、培養(yǎng)基配制及器材準(zhǔn)備：

9、10組：分別配葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基1000ml,分裝于50支試管（7ml）；11組：伊紅美藍(lán)固體培養(yǎng)基1000ml，分裝于8個(gè)250ml三角瓶；12組：3