分子生物學(xué)技術(shù)-第二章 分子克隆技術(shù)

2022/11/61分子克隆技術(shù)

MolecularCloning分子生物學(xué)技術(shù)?第二章

2022/11/62基因工程（geneengineering）：將基因進(jìn)行克隆，并利用克隆的基因表達(dá)、制備特定的蛋白質(zhì)或多肽產(chǎn)物，或定向改造細(xì)胞和生物個(gè)體的特性所用的方法及相關(guān)的工作。分子克隆（molecularcloning）:將某一特定DNA片段通過重組DNA技術(shù)插入到一個(gè)載體(如質(zhì)粒和病毒等)中，然后在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制所得到的大量完全相同的該DNA片段的“群體”。2022/11/63主要內(nèi)容第一節(jié)工具酶第二節(jié)載體第三節(jié)分子克隆的基本步驟第四節(jié)克隆基因的表達(dá)2022/11/64第一節(jié)工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶DNA連接酶堿性磷酸酶T4多核苷酸激酶核酸酶S12022/11/65限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease，簡稱限制酶）：是一類能識別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。第一節(jié)工具酶

一、限制性核酸內(nèi)切酶2022/11/66第一節(jié)工具酶

一、限制性核酸內(nèi)切酶（一）限制酶的命名與分類EcoR

I產(chǎn)生該酶的宿主菌屬名微生物的種名

宿主菌的株或型同一菌株中不同限制酶的編號（按發(fā)現(xiàn)先后順序）

大腸桿菌Escherichia屬、coli種、RY13株中分離到幾種限制酶，分別表示為:EcoR

I

、EcoR

Ⅱ

、EcoR

Ⅴ等。2022/11/67作用ⅠⅡⅢ表3-1三種限制性核酸內(nèi)切酶的作用

酶活性

核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶甲基化酶甲基化酶

ATP酶

DNA解旋酶DNA鏈上的

無有有特異識別位點(diǎn)DNA鏈上的

無識別序列內(nèi)識別序列外特異切割位點(diǎn)在分子克隆中

無有無的重要意義2022/11/68（二）Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的作用Ⅱ型限制酶能識別雙鏈DNA特異的46個(gè)堿基對，并在此序列內(nèi)特異切割DNA。限制酶功能：根據(jù)需要在特定的位點(diǎn)上精確切割雙鏈DNA分子。第一節(jié)工具酶

一、限制性核酸內(nèi)切酶回文結(jié)構(gòu)（palindromestructure）：指雙鏈DNA分子上按對稱軸排列的反向互補(bǔ)序列（常為限制酶所識別）。2022/11/695——GAATTC——3ATATGC5’3’EcoRⅠ的識別序列：對稱軸3——CTTAAG——52022/11/610第一節(jié)工具酶

一、限制性核酸內(nèi)切酶粘性末端（stickyend）：指限制酶錯(cuò)位切開兩條對稱軸互補(bǔ)DNA雙鏈所產(chǎn)生的末端。平末端（bluntend）：指限制酶平齊切開兩條對稱軸互補(bǔ)DNA雙鏈所產(chǎn)生的末端。—GAATTC——CTTAAG—EcoRⅠ—CCCGGG——GGGCCC—SmaⅠ112022/11/612第一節(jié)工具酶

一、限制性核酸內(nèi)切酶同工異源酶（isoschizomers）:來源不同，但能識別和切割同一位點(diǎn)的酶稱為。

同尾酶（isocaudarner）：指有些限制性內(nèi)切酶識別序列不同，可產(chǎn)生相同的粘性末端

如：BamHⅠ和BstⅠ（GGATCC）

XhoⅠ和

PaeR7（CTCGAG）如：

BamHⅠ（G

GATC

C）

Sau3AⅠ（N

GATC

N）。

由此產(chǎn)生的DNA片段可借粘性末端相互連接，在DNA重組時(shí)具有更大的靈活性。2022/11/613（一）DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（E.ColiDNApolymeraseⅠ）是單一多肽鏈的多功能酶，分子量為109kD，它具有3種酶活性：

①5→3DNA聚合酶活性。

②3→5

核酸外切酶活性。

③5→3

核酸外切酶活性。第一節(jié)工具酶

二、DNA聚合酶2022/11/614Klenow片段的主要用途：

①補(bǔ)齊雙鏈DNA的3末端，同時(shí)可使3末端DNA標(biāo)記上同位素。

②cDNA克隆中，合成cDNA第二鏈。

③DNA序列分析。第一節(jié)工具酶

二、DNA聚合酶5→3外切酶5→3聚合酶3→5外切酶

DNA聚合酶Ⅰ

(103kD)Klenow片段

NC

5→3聚合酶3→5外切酶(68kD)35kD(小)68kD(大)CN枯草桿菌蛋白酶

2022/11/615（二）TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶（簡稱Taq酶）是一種耐熱的DNA聚合酶，分子量為65Kd，最佳作用溫度是70~80℃，Taq酶具有5→3

聚合酶活性和依賴于聚合作用的5→3外切酶活性。TaqDNA聚合酶可用于DNA測序及通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）對DNA分子的特定序列進(jìn)行體外擴(kuò)增。

第一節(jié)工具酶

二、DNA聚合酶2022/11/616（三）逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）是依賴RNA的DNA聚合酶，它以RNA為模板，4種dNTP為底物，催化合成DNA，此過程稱為逆轉(zhuǎn)錄過程。逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶。第一節(jié)工具酶

二、DNA聚合酶①RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性（RDDP）②核糖核酸酶H活性（RNaseH）③DNA聚合酶活性（DDDP）逆轉(zhuǎn)錄酶的作用：2022/11/6175335RNA(用表示)RNA-DNA

雜化分子35

RNase（核酸酶H活性)

DDDP（DNA聚合酶活性）

4種dNTP

RDDP（逆轉(zhuǎn)錄酶）引物、4種dNTP

病毒雙鏈DNA用

表示）（cDNA第二鏈(complementaryDNA，cDNA

)與病毒RNA互補(bǔ)的DNA(用表示)5335

535

32022/11/618（四）末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT，簡稱末端轉(zhuǎn)移酶）：分子量為60Kd，在二價(jià)陽離子存在下，催化脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈DNA分子的3末端-OH上。第一節(jié)工具酶

二、DNA聚合酶①在載體或目的基因3末端加上互補(bǔ)的同質(zhì)多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重組連接。

②用于DNA3末端的同位素探針標(biāo)記。末端轉(zhuǎn)移酶的功能主要有：2022/11/619(A、G、C、T)nOH5′3′5′3′OH5′3′5′3′(A、G、C、T)nMg2+dNTPnppiMg2+dNTPnppi5′3′OH5′3′OH

5′3′5′3′(A、G、C、T)nCo2+dNTPnppiCo2+dNTPnppi（1）底物是單鏈DNA或有3突出末端的雙鏈DNA，需要Mg2+。（2）底物是平端或3凹端的雙鏈DNA，需要Co2+。(A、G、C、T)n2022/11/620DNA連接酶（DNAligase）：稱為基因工程的縫紉針，它在DNA重組中的主要功能是催化兩個(gè)互補(bǔ)粘性末端或平末端雙鏈DNA分子的5磷酸基團(tuán)與3羥基形成磷酸二酯鍵，將具有相同粘性末端或平末端的DNA連接起來，實(shí)現(xiàn)DNA體外重組。DNA連接酶包括大腸桿菌DNA連接酶和T4DNA連接酶兩種類型。第一節(jié)工具酶

三、DNA連接酶2022/11/621第二節(jié)載體克隆載體表達(dá)載體穿梭載體2022/11/622載體（vector）：指能攜帶外源DNA片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的工具。載體的本質(zhì)為DNA。第二節(jié)載體

一、克隆載體制備的目的基因或外源性DNA片段必須與合適的載體連接形成重組體，才能進(jìn)入受體細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。常用的載體有：質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、酵母質(zhì)粒和病毒等?？寺≥d體：能將載體攜帶的外源基因（目的基因）在受體細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增并產(chǎn)生足夠量目的基因的載體。2022/11/623載體應(yīng)具備的特征：

①能自我復(fù)制并具較高的拷貝數(shù)。分子量一般<10Kb。

②帶有遺傳篩選標(biāo)記。

③有適當(dāng)?shù)南拗泼盖形稽c(diǎn)，便于外源基因的插入和篩選。第二節(jié)載體

一、克隆載體多克隆位點(diǎn)（multiplecloningsites，MCS）：載體上具有的多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)（在載體其它部位無這些酶的相同切點(diǎn)）2022/11/624（一）質(zhì)粒載體第二節(jié)載體

一、克隆載體質(zhì)粒（plasmid）：是指細(xì)菌染色體以外的小分子環(huán)狀雙鏈DNA，能自我復(fù)制和表達(dá)其攜帶的遺傳信息。2022/11/625能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。2022/11/626

復(fù)制起始點(diǎn)抗藥基因抗藥基因圖4-5pBR322質(zhì)粒的物理圖譜pBR322質(zhì)粒載體2022/11/627pBR322質(zhì)粒是由一系列大腸桿菌質(zhì)粒DNA通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建而成的雙鏈克隆載體，長為4.36Kb。它含有一個(gè)能保證高拷貝自我復(fù)制的復(fù)制起始點(diǎn)（Ori），并裝有四環(huán)素抗性（Tetr）基因和氨芐青霉素抗性（Ampr）基因供菌落篩選。在這兩個(gè)抗性基因中分別含有BamHI和PstI等限制酶的單一酶切位點(diǎn)，用于插入外源DNA片段。如有外源基因的插入，會導(dǎo)致這些標(biāo)志性基因的失活。2022/11/628圖4-6pUC質(zhì)粒物理圖譜

pUC18、pUC19質(zhì)粒載體2022/11/629pUC系列載體是由pBR322質(zhì)粒和M13噬菌體重組構(gòu)建而成的雙鏈DNA質(zhì)粒載體。pUC18和pUC19質(zhì)粒長約2.69Kb，除多克隆位點(diǎn)互為相反方向排列外，其它序列均相同。pUC質(zhì)粒含Ampr，可供菌落篩選。載體中裝入一個(gè)來自大腸桿菌乳糖操縱子的DNA片段（lacZ基因），該基因編碼-半乳糖苷酶氨基端的一個(gè)片段，IPTG可誘導(dǎo)此片段合成，而此片段能與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型-半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)（-互補(bǔ)），形成完整的-半乳糖苷酶2022/11/630第二節(jié)載體

一、克隆載體（二）噬菌體載體（三）粘性質(zhì)粒(cosmid)（四）酵母人工染色體（五）動(dòng)物細(xì)胞基因克隆的載體

猿猴空泡病毒40（SV40）載體、腺病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體2022/11/631外源目的基因在新宿主細(xì)胞中是否克隆成功，是通過鑒定克隆是否表達(dá)的方法來證實(shí)，即產(chǎn)生克隆基因所編碼的蛋白質(zhì)，其每個(gè)環(huán)節(jié)都至關(guān)重要。真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)需要有效轉(zhuǎn)錄及一系列調(diào)控元件，必須保證外源基因－－插入方向的正確性；受原核啟動(dòng)子的控制；必須能在大腸桿菌中有效轉(zhuǎn)錄和有效翻譯。基因表達(dá)、合成有功能的蛋白質(zhì)依賴于基因的有效轉(zhuǎn)錄、mRNA正確的翻譯和翻譯后加工。第二節(jié)載體

二、表達(dá)載體表達(dá)載體是指能將外源基因在受體細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄和正確翻譯的載體，帶有表達(dá)所需的各種元件。2022/11/632（一）原核細(xì)胞表達(dá)載體原核細(xì)胞的表達(dá)載體主要是大腸桿菌表達(dá)載體。外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)需要重要調(diào)控元件。大腸桿菌表達(dá)載體是在克隆載體的基礎(chǔ)上導(dǎo)入表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控元件：啟動(dòng)子—核糖體結(jié)合位點(diǎn)—克隆位點(diǎn)—轉(zhuǎn)錄終止信號。第二節(jié)載體

二、表達(dá)載體2022/11/633第二節(jié)載體

二、表達(dá)載體5—TTGACA——TATAAT———//——3-35區(qū)-10區(qū)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)PribnowboxDNA

如乳糖啟動(dòng)子（Lac）、色氨酸啟動(dòng)子（Trp）、Tac啟動(dòng)子（Trp-Lac）以及PL和PR啟動(dòng)子等。原核細(xì)胞啟動(dòng)子示意圖（一）原核細(xì)胞表達(dá)載體1.啟動(dòng)子（promoter）：2022/11/634（一）原核細(xì)胞表達(dá)載體

2.SD序列第二節(jié)載體

二、表達(dá)載體mRNA2022/11/635（一）原核細(xì)胞表達(dá)載體

終止子：一個(gè)基因的3末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶識別并停止轉(zhuǎn)錄的功能。該序列含有一段富含A/T和富含G/C的回文對稱結(jié)構(gòu)，終止子轉(zhuǎn)錄后形成的RNA具有莖環(huán)狀局部二級結(jié)構(gòu)。第二節(jié)載體

二、表達(dá)載體2022/11/636（二）哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體真核表達(dá)載體的真核表達(dá)元件有：啟動(dòng)子/增強(qiáng)子—克隆位點(diǎn)—終止位點(diǎn)和加polyA信號。

1．原核DNA序列包括能在大腸桿菌中自身復(fù)制的復(fù)制子和抗藥基因的篩選標(biāo)記。

2．啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游25~30bp有富含AT的TATA框，TATA框的上游約100~200bp處為上游啟動(dòng)子元件。

3．增強(qiáng)子（enhancer）是一類顯著提高基因轉(zhuǎn)錄效率的順式作用元件。

4．終止子和加polyA信號。第二節(jié)載體

二、表達(dá)載體2022/11/637第二節(jié)載體

三、穿梭載體穿梭載體（shuttlevector）：人工構(gòu)建的既帶有原核細(xì)胞的復(fù)制元件、又帶有真核細(xì)胞的復(fù)制元件，既能在原核細(xì)胞中復(fù)制、又能在真核細(xì)胞中復(fù)制，能夠在兩類不同宿主中復(fù)制、擴(kuò)增和選擇的載體。2022/11/638目的基因的制備載體的選擇和制備目的基因和載體連接重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞目的基因的篩選和鑒定第三節(jié)分子克隆的基本步驟2022/11/639連接含重組子的陽性克隆載體+目的基因轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定陽性克隆DNA重組體+受體細(xì)胞圖3-10DNA分子克隆的基本步驟——分、切、接、轉(zhuǎn)、篩2022/11/640

（一）從基因文庫中獲?。ǘ┠孓D(zhuǎn)錄法（三）人工合成DNA片段（四）直接從染色體DNA中分離目的基因第三節(jié)分子克隆的基本步驟

一、目的基因的獲取2022/11/641制備的目的基因或外源性DNA片段必須與合適的載體連接，才能進(jìn)入受體細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。載體大都經(jīng)過改造，攜帶有某些選擇性標(biāo)記和克隆位點(diǎn)的遺傳信息等。在常用的克隆載體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件（DNA序列）即成為表達(dá)載體，這些載體不僅可以攜帶外源基因片段進(jìn)入宿主細(xì)胞，而且還可以使外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)。常用的宿主細(xì)胞是大腸桿菌。

第三節(jié)分子克隆的基本步驟

二、載體的選擇2022/11/642(一)粘性末端連接第二節(jié)載體

三、目的基因和載體的連接本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上有相同單或雙酶切位點(diǎn)2022/11/643圖3-11粘性末端DNA重組體的構(gòu)建3

HO-G━━━━━CTTAA-p5

5p-AATTC━━━━━G-OH

3

3HO-G━━━━━CTTAA-p5

5p-AATTC━━━━━

G-OH3

質(zhì)粒目的基因

━━━━━━━━━━━━━━━━

目的基因和載體連接EcoRⅠEcoRⅠ

堿性磷酸酶3HO-G━━━━━CTTAA-OH5

5HO-AATTC━━━━━G-OH

3

退火DNA連接酶

3HO-G━━━━━CTTAAG━━━━━CTTAA-p55p–AATTC━━━━━GAATTC━━━━━

G-OH3

2022/11/644第二節(jié)載體

三、目的基因和載體酶切與連接(二)平末端連接T4DNA連接酶、人工接頭、同聚尾連接2022/11/645第二節(jié)載體

四、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞

目的基因與載體在體外連接成重組體后，需先導(dǎo)入受體細(xì)胞，常用的受體細(xì)胞是大腸桿菌。制備感受態(tài)細(xì)胞的基本方法有兩種：

1.CaCl2處理，增加大腸桿菌細(xì)胞膜通透性。

2.體外包裝DNA重組體，再轉(zhuǎn)染噬菌體。感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)：細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變、通透性增加并具有攝取外源DNA能力的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化（transformation）：將重組的DNA分子引入細(xì)菌(原核細(xì)胞),使其在細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增及表達(dá)的過程。2022/11/646（一）根據(jù)載體的性狀變化進(jìn)行篩選

1．根據(jù)載體的抗藥性標(biāo)志篩選

大多數(shù)質(zhì)粒載體帶有抗生素抗性標(biāo)記的特征（如Ampr

、Tetr等）當(dāng)帶有完整抗性基因的載體轉(zhuǎn)化無抗性細(xì)菌后，被轉(zhuǎn)化的陽性菌獲得抗生素抗性基因而存活并形成噬菌斑，未轉(zhuǎn)化菌不能存活，但應(yīng)排除未重組的空載體。第二節(jié)載體

五、重組體的篩選和鑒定2022/11/6472．根據(jù)載體抗藥性標(biāo)志插入失活選擇

某些質(zhì)粒載體如p