安醫(yī)大生殖醫(yī)學課件01轉(zhuǎn)基因技術(shù)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)

Geneticallymodifiedanimals

概念轉(zhuǎn)基因(transgene)是指以實驗方法導入的外源基因在其染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代。外源基因隨細胞分裂分配到所有子細胞中并遺傳給后代，這種動物叫轉(zhuǎn)基因動物。嚴格說，轉(zhuǎn)基因動物有別于嵌合體。

轉(zhuǎn)基因動物的意義進行功能基因組學研究，研究外源基因在動物整體水平的表達、調(diào)控及基因之間的相互作用建立動物疾病模型，進行發(fā)病學和治療性研究改變動物基因，使其表現(xiàn)型更適合人類需要生產(chǎn)人類所需的生物活性物質(zhì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)是動物基因工程在醫(yī)學生物學研究中的突出成果。近十年來，為分子遺傳學、發(fā)育生物學、醫(yī)學遺傳學、腫瘤研究及優(yōu)良經(jīng)濟動物的開發(fā)研究等多方面做出了很大的貢獻。與嵌合體的區(qū)別嵌合體只有部分組織細胞的基因組中整合有外源基因逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、胚胎干細胞介導法制備動物第一代均為嵌合體。雄原核顯微注射法制備的動物第一代中1-10%為嵌合體（延遲整合）發(fā)展簡史1972年，Gordon等人首次試驗轉(zhuǎn)基因小鼠，將含有HSV和SV40DNA片段的重組質(zhì)粒DNA以顯微注射法導入小鼠受精卵的雄原核1982年P(guān)almiter等運用此法得到的所謂“超級巨鼠”,曾引起整個生物學界的轟動相繼獲得轉(zhuǎn)基因魚、鼠、羊、豬、兔、牛等動物從轉(zhuǎn)基因動物所獲得的資料幾乎涉及醫(yī)學遺傳、腫瘤學、免疫學等的基因研究，還涉及生物藥物的研究，基因治療的開發(fā)研究

轉(zhuǎn)基因動物的制作方法受精卵雄原核顯微注射法胚胎干細胞（ES細胞）法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法體細胞核移植法精子載體法YAC法1、雄原核顯微注射法

以單細胞受精卵為靶細胞，利用顯微注射技術(shù)將構(gòu)建好的載體DNA直接注射入受精卵的原核，再將接受注射的受精卵移入假孕母體輸卵管繼續(xù)發(fā)育獲得轉(zhuǎn)基因動物個體。目前應用較廣泛,最早最經(jīng)典的方法技術(shù)序：準備假孕母鼠（養(yǎng)母）受精卵的準備基因?qū)肱咛ヒ浦矊τ资蟮蔫b定ExpressionofExogenousGenes整合率的高低主要取決于受精卵和胚胎發(fā)育的時間。基因的整合是隨機的，多數(shù)插入單一染色體位點中。外源基因的插入會引起宿主基因的DNA序列重排，缺失，重復或易位。外源基因也可不插入呈游離狀態(tài)，以質(zhì)粒形式存在表達功能并傳給子代。其詳細機理現(xiàn)在也不是很清楚。優(yōu)點：外源DNA大小基本不受限制(1-50kb)導入過程直觀整合率高缺點：設備昂貴、環(huán)節(jié)較多

對操作人員有較高的技術(shù)要求

低效率（尤其是大家畜）

對卵子傷害大，胚胎存活率低基因整合隨機性轉(zhuǎn)基因沉默2、胚胎干細胞（ES細胞）法將攜帶有外源基因的ES細胞注入到動物的早期胚胎內(nèi)，可產(chǎn)生嵌合體及轉(zhuǎn)基因動物。在ES細胞上的基因操作：可以通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、脂質(zhì)體介導、電穿孔、磷酸鈣共沉淀等方法將外源基因?qū)隕S細胞。借用ES細胞系可將人們企望的某種不完整的、無功能基因直接引入到ES細胞中，通過細胞增殖、篩選可得到喪失了某種基因功能的動物后代。InjectionofEScellsintoblastocysts優(yōu)點：外源基因整合情況的可控性高。可預先在細胞水平檢測外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達的水平及插入的穩(wěn)定性。外源基因?qū)隕S細胞的方法多樣，細胞鑒定及篩選方便。缺點：ES細胞系建立及培養(yǎng)困難維持ES細胞的未分化及多向分化潛能不易所得個體為嵌合體目前，胚胎干細胞介導法在小鼠上應用比較成熟，在大動物上應用較晚。3、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法

將目的基因重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，制成高滴度病毒顆粒，人為感染著床前后的胚胎（也可直接將胚胎與能釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒的單層培養(yǎng)細胞共同培養(yǎng)以達到感染目的),獲得轉(zhuǎn)基因動物的方法。優(yōu)點：受精卵攜帶外源基因的陽性率高外源基因多單拷貝整合操作簡單，避免注射法對卵子的損害宿主范圍廣可同時感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高缺點：潛在的致癌性載體構(gòu)建較復雜容納大小有限整合率不高重組逆轉(zhuǎn)錄病毒不穩(wěn)定，可能干擾外源基因的表達胚胎的自我保護機制對其有抗性

方式顯微注射法逆轉(zhuǎn)錄病毒法DNA長度＜50kb＜10-15kb時相

單細胞卵4-6細胞卵移卵部位輸卵管子宮整合方式隨機，多拷貝隨機，單拷貝表達受宿主旁側(cè)DNA影響受LTR影響易缺失傳代可以有時不，子代嵌合體機率高4、體細胞核移植法

將外源基因?qū)氲襟w細胞中，再將該細胞進行培養(yǎng)，選擇其中帶有外源基因的細胞進行擴增，用這種細胞的細胞核進行核移植，克隆轉(zhuǎn)基因動物。在理論上應該全部為陽性轉(zhuǎn)基因動物，而且外源基因的表達穩(wěn)定，外源基因的整合率可達100%1997年，英國克隆羊Dolly1999年,中國陳大元利用兔的卵母細胞獲得種間核移植的大熊貓胚胎2000年，美國轉(zhuǎn)基因牛優(yōu)點：對體細胞進行基因改造后，用于核移植可以提高轉(zhuǎn)基因的效率，不僅具有“ES細胞途徑”的全部優(yōu)點，且物種適用面廣，無需經(jīng)過嵌合體育種就可獲得純合個體，周期短，效率高。缺點：技術(shù)上難度，成功率極低，胚胎死亡率高，非一般實驗室可以開展。5、精子載體法直接以精子為載體的轉(zhuǎn)基因方法。將成熟精子與外源ＤＮＡ共培養(yǎng)，將成熟的精子與外源DNA進行預培養(yǎng)之后，使精子有能力攜帶外源DNA進入卵子中，使之受精，并使外源DNA整合到染色體中。優(yōu)點：注射針口徑大100倍能處理兆及亞兆堿基級的基因構(gòu)建提高外源基因的整合及表達水平大型動物合子不透明，原核注射差，單精子注射可避免缺點：實驗結(jié)果不穩(wěn)定重復性差6YAC法利用酵母人工染色體(YAC)作為載體制作轉(zhuǎn)基因動物的方法。YAC載體是近年來發(fā)展起來的新型載體,能克隆百萬對堿基的大片段DNA。優(yōu)點：保證大片段ＤＮＡ的完整性。

保證較長外源片段在轉(zhuǎn)基因動物研究中的整合率提高

保證了目的基因上下游的側(cè)翼序列的完整性，因而可以消除或減弱基因整合后的位置效應。因此ＹＡＣ介導法制備轉(zhuǎn)基因動物具有廣闊的應用前景。除上述幾種常用的轉(zhuǎn)基因方法外，人們?yōu)榱诉m應于一些特殊需要也探索了一些其他的方法。如畸胎瘤細胞介導法，高效微彈法等，但這些方法都不太成熟，應用也較少。轉(zhuǎn)基因動物的特性整合拷貝數(shù)1-100左右，多拷貝常以首尾相連接的形式存在整合是隨機的整合是穩(wěn)定的，可以傳給子代外源基因可以在一種組織或多種組織中表達少數(shù)外源基因兩側(cè)序列有重排現(xiàn)象基因表達強弱與拷貝數(shù)無關(guān)，與“位置效應”有關(guān)1、制作轉(zhuǎn)基因動物效率低這是制約這項技術(shù)廣泛應用的關(guān)鍵。以顯微注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物為例，小鼠、大鼠、兔、牛、豬、綿羊轉(zhuǎn)基因陽性率分別為26%、44%、15%、0.7%、0.9%、0.9%。2、基因在宿主基因組中的行為難以控制轉(zhuǎn)基因隨機整合于動物的基因組中，很有可能引起宿主細胞染色體的插入突變，還可造成插入位點的基因片段的丟失及插入位點的基因的位移，同時也可能激活正常情況下處于關(guān)閉的基因。其結(jié)果導致轉(zhuǎn)基因陽性個體出現(xiàn)不育、胚胎死亡、流產(chǎn)、畸形等異?，F(xiàn)象。3、轉(zhuǎn)基因表達水平低許多轉(zhuǎn)基因的表達水平受到宿主染色體上整合位點的影響，往往出現(xiàn)異位表達，影響轉(zhuǎn)基因的表達能力，從而使大部分轉(zhuǎn)基因表達水平較低,極少部分表達水平過高。轉(zhuǎn)基因動物研究出現(xiàn)的問題轉(zhuǎn)基因動物的應用

人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型

轉(zhuǎn)基因哺乳動物表達系統(tǒng)

轉(zhuǎn)基因哺乳動物表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因動物生物反應器生產(chǎn)藥用蛋白有2種技術(shù)路線：將目的基因在同源組織中表達蛋白質(zhì)將目的的基因構(gòu)建成雜合基因，轉(zhuǎn)入動物胚胎，通過轉(zhuǎn)基因動物的分泌器官收集并提純藥用蛋白1．乳腺生物反應器將所需目的基因構(gòu)建入載體，加上適當?shù)恼{(diào)控序列，轉(zhuǎn)入動物胚胎細胞，使轉(zhuǎn)基因動物分泌的乳汁中含有所需藥用蛋白。牛、羊是理想動物：對蛋白進行后加工，使之具有較高的生物活性產(chǎn)奶量大，易于大規(guī)模生產(chǎn)從出生到第一次泌乳，豬、羊、牛各需12、14、16個月只有雌性動物泌乳泌乳不連續(xù)，豬、羊、牛一般可持續(xù)2、6、10個月（1）轉(zhuǎn)基因奶牛轉(zhuǎn)基因奶?？梢猿蔀樯a(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)的經(jīng)濟有效的“工廠”：每只奶牛每年能產(chǎn)1000L以上的牛奶，平均每千克牛奶含35g蛋白質(zhì)（2）轉(zhuǎn)基因羊?qū)d羊、山羊所進行的轉(zhuǎn)基因研究大多集中于利用乳腺作為生物反應器生產(chǎn)藥用蛋白。（3）轉(zhuǎn)基因鼠早期的動物生物反應器研究以小鼠為主乳清酸性蛋白啟動子也由小鼠分離得到用轉(zhuǎn)基因小鼠將囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)蛋白（CFTR）表達于其分泌的乳汁中，CFTR對囊性纖維化疾病具有治療價值這為以后其他的乳腺反應器發(fā)展奠定了基礎小鼠乳汁收集極為困難，該反應器目前并無大的生產(chǎn)價值（4）轉(zhuǎn)基因家兔家兔作為乳腺生物反應器比小鼠更具實際意義。不但家兔的乳汁較易收集，而且家兔移植妊娠率和產(chǎn)仔率均高于小鼠。3．血液表達系統(tǒng)在豬的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炛?，以轉(zhuǎn)化人的血紅蛋白基因最為成功。檢測表明，它們與天然的人α珠蛋白性質(zhì)完全相同。

4．動物反應器利用轉(zhuǎn)基因動物反應器已生產(chǎn)出許多種藥用蛋白：

抗凝血酶Ⅲ：第一個進入臨床試驗的轉(zhuǎn)基因蛋白產(chǎn)物。將半乳糖β酪蛋白的啟動子和含抗凝血酶Ⅲ基因序列相連，轉(zhuǎn)入綿羊胚胎細胞，在轉(zhuǎn)基因綿羊的乳液中得到有生物活性的蛋白，產(chǎn)量可達7g/L。β乳球蛋白紅細胞生成素（EPO）α1抗胰蛋白酶（AAT）因子IX因子Ⅷ（FⅧ）單克隆抗體C蛋白

動物乳腺生產(chǎn)醫(yī)用蛋白實例基因名稱受體動物表達水平(g/L)開發(fā)現(xiàn)狀抗凝血酶(AT-III)山羊6III期臨床抗胰蛋白酶(AAT)綿羊35III期臨床葡萄糖苷酶家兔10III期臨床蛋白C豬1III期臨床tPA(組織型纖溶酶原激活劑)山羊6II期臨床乳轉(zhuǎn)鐵蛋白奶牛3.5II期臨床第八因子(F-VIII)豬3?

5．移植器官利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改造異種來源器官的遺傳性狀，使之能適應于人體器官或組織的移植。Xenotransplantation美1997年開始重組移植體臨床試驗，利用遺傳改良的豬肝作為嚴重肝臟病患者的離體生命支持物。轉(zhuǎn)基因動物的安全問題作者:

來源:香港中通社

發(fā)布者:亦云

類別:新聞掃描

日期:2006-04-22

今日/總瀏覽:21/232006年12月26日，東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院劉忠華，綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因”的克隆豬抑制基因“老”鼠換“童顏”2007年11月29日，美國斯坦福大學皮膚學副教授霍華德.張博士一只轉(zhuǎn)基因老鼠的NF-eB基因被抑制活動兩周后，老鼠的衰老皮膚變得宛若新生。12月15日美國《基因與發(fā)育》。傳統(tǒng)方法：極端，如絕食；把一個年輕動物與一個年老動物的血液循環(huán)系統(tǒng)相連2007年11月23日，美國俄亥俄州凱斯西儲大學生物化學教授理查德·汗森造出轉(zhuǎn)基因“超級老鼠”可不吃喝跑4小時轉(zhuǎn)改基因動物明星貝茲維爾豬：將人生長激素基因注入豬，出現(xiàn)了嚴重的骨骼和關(guān)節(jié)問題蜘蛛絲山羊：將蜘蛛絲蛋白基因注入山羊體內(nèi)，從羊奶中提取蛋白質(zhì)抽成絲后堅如鋼鐵菠菜豬：有菠菜基因的豬，稱這種豬肥肉更少，食用健康改基因牛：把人類基因移植到牛身上，以從牛奶中提煉藥用蛋白環(huán)保豬：將一種細菌基因注入豬體內(nèi)，降低它們糞便的污染2007年10月10日美國賓夕法尼亞大學醫(yī)學院《人類分子遺傳學》，培育出轉(zhuǎn)基因鼠動物模型，可以用于研究老年人中常見的眼疾——老年性黃斑變性。黃斑變性是由于視網(wǎng)膜色素上皮和基底膜之間出現(xiàn)沉積物造成的。沉積物從初始形態(tài)開始慢慢演變成為細胞外的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)堆積物，最終會