基因編輯技術(shù)CRISPR-dCas9靶向去甲基化的研究與應(yīng)用進(jìn)展

基因編輯技術(shù)CRISPR/dCas9

靶向去甲基化的研究與應(yīng)用進(jìn)展［摘要］CRISPR/Cas9是對(duì)靶向基因進(jìn)行特定DNA修飾的重要工具，Cas9的核酸酶剪切活性取決于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域RuvC和HNH,當(dāng)RuvC和HNH同時(shí)處于失活狀態(tài)時(shí)，Cas9將不具有核酸酶活性，成為dCas9,應(yīng)用CRISPR/dCas9系統(tǒng)使靶向調(diào)控DNA甲基化成為可能.多位研究者應(yīng)用CRIS-PR/dCas9系統(tǒng)中，dCas9能與DNA序列結(jié)合的能力，將dCas9通過與TET1或DNMT3a等其他蛋白的融合，使其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，促進(jìn)或抑制基因的表達(dá).本文綜述了證明CRISPR/dCas9系統(tǒng)是能夠編輯特定基因序列的DNA甲基化或DNA去甲基化的強(qiáng)大工具，可以應(yīng)用在去甲基化的各種研究中，為臨床治療表觀遺傳、腫瘤等疾病提供新的研究思路.［關(guān)鍵詞］CRISPR/Cas9系統(tǒng)；dCas9;去甲基化GeneeditingtechnologyCRISPR/dCas9

ResearchandApplicationProgressofTargetedDemethylationAbstract:CRISPR/Cas9systemisoneofgenomeeditingtechnologiesintargetedDNAmodification.EndonucleasesofCas9nucleaseshastwoactivefractionRuvCandHNH.TheengineereddCas9proteinbyinactivatingRuvCandHNHnucleasedomainsofCas9proteinplaysaroleingeneexpressionregulation.CRISPR/dCas9systemmaketargetedDNAdemethylationpossible.ResearchersmanipulatedthestructuresofdCas9thatcanattractDNAsequencebindingproteinswhichfusetodifferenttranscriptionfactorsforthepurposeofactivatingorinhibitinggenetranscrip-tion.AnddCas9fusedtotheepigeneticeffectorsTET1andDNMT3a,makingitplaytheroleoftranscriptionfactor,promotingorinhibitinggeneexpression.ThisreviewsummarizestheevidencethattheCRISPR/dCas9systemisapowerfultooltoeditDNAmethylationordemethylationofspecificgenomicsequences,andcanbeusedinvariousstudiesofdemethylationforclinicaltreatmentofepigeneticsandtumors.Keywords:CRISPR/dCas9system;dCas9;Demethylation表觀遺傳學(xué)是研究基因序列不發(fā)生改變的情況下，通過DNA甲基化、組蛋白修飾和空間結(jié)構(gòu)域的改變調(diào)節(jié)控制基因表達(dá)的的一門遺傳學(xué)的分支學(xué)科.在哺乳動(dòng)物基因組中，大約70%的胞嘧啶殘基在5'-CpG-3'都被甲基化，DNA甲基化操控著許多生物進(jìn)程，現(xiàn)已證明DNA甲基化與許多疾病有關(guān)，包括腫瘤、印記疾病DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，利用S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶環(huán)的五號(hào)碳原子上加上甲基的共價(jià)修飾過程.TET蛋白家族能轉(zhuǎn)化5-甲基胞嘧啶為5-羥甲基胞嘧啶，從而啟動(dòng)去甲基化的過程'DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，去甲基化則可誘導(dǎo)基因的重新活化和表達(dá).盡管DNA甲基化在許多生物進(jìn)程中起重要作用，但由于缺乏廣泛可行的技術(shù)在特定的靶點(diǎn)添加或移除甲基化，其在許多疾病中的致病影響并不清楚.在原理上，基因編輯技術(shù)可以應(yīng)用在靶向表觀遺傳學(xué)治療，但沒有特異性的方法能移除甲基化.像5-aza-2'脫氧胞苷能抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶，常被用來研究甲基化的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)'3'.然而5-aza-2'脫氧胞苷是作用于整個(gè)基因組的去甲基化，很難針對(duì)特定的DNA甲基化區(qū)域進(jìn)行去甲基化，如果使用其進(jìn)行治療性的應(yīng)用會(huì)面對(duì)很多無法預(yù)料的問題.近年來，CRISPR/Cas9'4?這種基因編輯技術(shù)可以通過融合非催化活性核酸內(nèi)切酶來補(bǔ)充特異位點(diǎn)的催化活性.CRISPR/dCas9系統(tǒng)應(yīng)用dCas9能與DNA序列結(jié)合的能力，使其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，融合TET結(jié)構(gòu)蛋白家族在細(xì)胞中能羥化特定的位點(diǎn)，可以激活去甲基化.這樣看來，CRIS-PR/dCas9技術(shù)的出現(xiàn)為DNA靶向去甲基化提供了條件.1CRISPR/dCas9系統(tǒng)的作用機(jī)制CRISPR/Cas9是對(duì)靶向基因進(jìn)行特定DNA修飾的重要工具，其具有效率高、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn).CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以特異性的識(shí)別出外源DNA，并將它們切斷，沉默外源基因的表達(dá).CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌針對(duì)噬菌體和質(zhì)粒DNA入侵進(jìn)化形成的一種獲得性免疫系統(tǒng).大約40%的細(xì)菌和90%的古細(xì)菌擁有CRISPR/Cas位點(diǎn)「7-9'.CRISPR/Cas系統(tǒng)按照其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可以分為3大類型(I型、II型和III型系統(tǒng))，它們的共同特點(diǎn)是RNA介導(dǎo)的核酸酶能夠特異性地切割外源入侵的DNA，包括噬菌體和質(zhì)粒DNA'5'.II型CRISPR/Cas系統(tǒng)鑒于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，目前被廣泛應(yīng)用于真核細(xì)胞的基因組編輯中.CRISPR位點(diǎn)由一系列短的重復(fù)序列(Repeats)構(gòu)成，這些重復(fù)序列被具有相同長(zhǎng)度的“間隔序列”隔開.間隔序列可與噬菌體基因組配對(duì)結(jié)合并使入侵細(xì)菌和古細(xì)菌的外源遺傳物質(zhì)降解.當(dāng)外源噬菌體或質(zhì)粒入侵宿主菌時(shí)，“重復(fù)一間隔”陣列被轉(zhuǎn)錄成長(zhǎng)的crRNA前體.crRNA前體可被CRISPR-associate(Cas)核酸酶或者細(xì)菌內(nèi)源RNA酶III在重復(fù)序列處切割，并釋放出小的crRNA.然后crRNA與輔助小片段RNA(Trans-activatingcrRNA，tracrRNA)通過部分序列互補(bǔ)形成RNA二聚體，該二聚體能夠被Cas9蛋白特異識(shí)別并形成RNA蛋白復(fù)合體，通過crRNA序列中的間隔序列介導(dǎo)Cas9核酸酶發(fā)現(xiàn)靶序列并降解侵入物的基因組.在自然狀態(tài)下，Cas9由tracrRNA和crRNA前體介導(dǎo)至其靶點(diǎn)，在人工合成的系統(tǒng)中這2個(gè)短的RNA可以被融合成一個(gè)嵌合的導(dǎo)向RNA(guideRNA)"0，'「.CRISPR/Cas9系統(tǒng)由單鏈的guideRNA和有核酸內(nèi)切酶活性的Cas9蛋白構(gòu)成，能特異性識(shí)別靶基因序列，并在靶定位點(diǎn)剪切雙鏈DNA，細(xì)胞的非同源末端連接修復(fù)機(jī)制重新連接斷裂處的基因組，并引入插入或缺失突變，也可提供一個(gè)外源雙鏈供體DNA片段通過同源重組整合進(jìn)斷裂處的基因組，從而達(dá)到對(duì)DNA修飾的目的「5，氣CRISPR/Cas9系統(tǒng)能在293T、K562、iPS等多種細(xì)胞中，進(jìn)行有效的靶向酶切，非同源重組、同源重組效率在3%~25%之間，并能在多個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行靶向酶切.Cas9的核酸酶剪切活性取決于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域:RuvC和HNH.這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別負(fù)責(zé)切割DNA的兩條鏈，并且這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域能夠單獨(dú)地被人工點(diǎn)突變失活.化膿性鏈球菌中存在一種Cas9D10A突變體，這種鏈球菌Cas9的RuvC失活(RuvC-)，HNH仍有活性(HNH+)；另一種Cas9H840A的突變體的Cas9蛋白則呈現(xiàn)RuvC激活(RuvC+)和HNH失活(HNH-)的狀態(tài)，但這兩種突變體的Cas9仍然具有核酸酶活性，可對(duì)靶向序列進(jìn)行剪切作用.當(dāng)RuvC和HNH同時(shí)處于失活狀態(tài)時(shí)（D10A&H840A；RuvC-&HNH-）,Cas9將不具有核酸酶活性，成為dCas9（deadCas9）.dCas9與靶向特定基因gRNA在細(xì)胞中共表達(dá)，則gRNA可以介導(dǎo)dCas9蛋白與DNA結(jié)合.如果dCas9結(jié)合到靶基因的閱讀框內(nèi)，可以阻斷RNA聚合酶的延伸作用，如果dCas9結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，則可以阻止基因轉(zhuǎn)錄的起始.研究者利用dCas9與DNA序列結(jié)合的能力，將dCas9與其他蛋白的融合，使其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，促進(jìn)或抑制基因的表達(dá).2CRISPR/dCas9系統(tǒng)靶向去甲基化的研究DNA去甲基化催化酶在表觀遺傳調(diào)控中很重要，但尚不清楚這些胞嘧啶修飾如何被逆轉(zhuǎn).TET1是一種a-酮戊二酸和Fe2+依賴的雙加氧酶，催化5-甲基胞嘧啶（5mC）轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）,還可以從5mC以酶促活性依賴性的方式生成5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）「14'.He等”研究表明，TET1雙加氧酶將DNA中的5mC和5hmC氧化為5caC后，被修飾的5caC被胸腺嘧啶-DNA糖基化酶（TDG）特異性識(shí)別和切除，再通過堿基切除修復(fù)途徑使該位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為胞嘧啶，構(gòu)成了活性DNA去甲基化的途徑.來自中科院上海生化細(xì)胞所的胡榮貴研究員課題組的研究員Xu等用dCas9和gRNAs插入雙拷貝的噬菌體MS2RNA元件，構(gòu)建了修改的單導(dǎo)向RNAs（sgRNAs）（sgRNA2.0），從而有利于TET1催化結(jié)構(gòu)域（TET1-CD）與dCas9或MS2外殼蛋白融合，進(jìn)而結(jié)合到特定基因位點(diǎn)行駛DNA去甲基化功能.這個(gè)系統(tǒng)能顯著上調(diào)的轉(zhuǎn)錄目標(biāo)基因，并且dCas9/sgRNA2.0-directed去甲基化能高效針對(duì)目標(biāo)基因，其脫靶率低.日本科學(xué)家SumiyoMorita等17更完整的應(yīng)用dCas9融合TET1進(jìn)行靶向去甲基化.失去剪切活性的dCas9融合具有催化活性的TET1（TET1CD），羥化特異性的位點(diǎn)以激活該位點(diǎn)的去甲基化.另外，加入SunTag補(bǔ)充TET1-CD，可以使TET1-CD的活性明顯改善17.SunTag實(shí)質(zhì)上是一套分子掛鉤，其能夠?qū)⒍鄠€(gè)拷貝的生物活性分子掛到可用來靶向一些基因或其他的分子的蛋白質(zhì)支架上.相比于沒有這些掛鉤的組裝分子，整合了SunTag的分子生物活性顯著放大"8,多重復(fù)拷貝的TET1羥化酶和dCas9的融合極大地增強(qiáng)去甲基化的活性.SumiyoMorita等還證明，dCas9融合TET1的系統(tǒng)適用于在胚胎干細(xì)胞，癌細(xì)胞系，原代神經(jīng)前體細(xì)胞和小鼠胎兒體內(nèi)的操縱特定位點(diǎn)的甲基化，使體內(nèi)治療表觀疾病成為可能.Liu等「20'早期研究表明，dCas9和TET1或DN-MT3a融合可以精確編輯CpG甲基化區(qū)域，可以使甲基化或去甲基化啟動(dòng)子序列激活或者沉默，無論在體外還是體內(nèi).腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子W（BDNF2）或肌分化轉(zhuǎn)錄激活因子MyoD的靶向去甲基化作用可以通過融合dCas9-TET1加強(qiáng)，從而誘導(dǎo)BDNF在有絲分裂后的神經(jīng)元中表達(dá)或激活MyoD促進(jìn)成纖維細(xì)胞重編程為成肌細(xì)胞.新創(chuàng)靶向重新甲基化的CTCF環(huán)的位點(diǎn)，通過dCas9-DNMT3a融合蛋白阻斷基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子CTCF綁定和干擾DNA循環(huán)，導(dǎo)致鄰近基因環(huán)的表達(dá)改變.他們?cè)僖淮巫C實(shí)了dCas9可以在體內(nèi)應(yīng)用于DNA甲基化.3CRISPR/dCas9系統(tǒng)靶向去甲基化的應(yīng)用CRISPR/dCas9系統(tǒng)靶向去甲基化中的研究結(jié)果表明，TET1、DNMT3a和dCas9融合，代表了一個(gè)強(qiáng)大的能夠編輯特定基因序列的DNA甲基化工具箱.Vojta等「2「研究表明，dCas9融合DNMT3a可用于兩個(gè)人類基因啟動(dòng)子，Xu等和Choud-hury等f人研究表明，dCas9融合TET1可用于基因啟動(dòng)子去甲基化.應(yīng)用CRISPR/dCas9系統(tǒng)可以使甲基化的編輯比以往更精準(zhǔn)高效.Liu等冒利用其研究的DNA甲基化編輯工具來逆轉(zhuǎn)超甲基化事件，證明了可以通過CRISPR介導(dǎo)的FMR1基因的DNA甲基化編輯來治療脆性X綜合征（FXS）.脆性X綜合征（FXS）是男性最常見的智力殘疾遺傳形式，是由于FXS患者FMR1基因的沉默與FMR1的5,UTR中CGG擴(kuò)展突變的超甲基化有關(guān)京.該研究設(shè)計(jì)了一個(gè)單一的sgRNA，以指導(dǎo)dCas9-TET1有效地使病理基因座中的CGG重復(fù)序列脫甲基.CGG擴(kuò)展完全的去甲基化會(huì)導(dǎo)致CpG島的甲基化不足，在啟動(dòng)子處增加H3K27乙酰化和H3K4三甲基化，減少H3K9三甲基化，并解鎖基因的表觀遺傳沉默，從而恢復(fù)FXSiPSC和神經(jīng)元中的FMRP表達(dá)，且無明顯關(guān)閉定位效果.FMR1的表達(dá)噬菌體蛋白AcrIIA4抑制dCas9-TET1后，在編輯過的FXS細(xì) 學(xué)的發(fā)展提供了新的方法，為表觀疾病的治療提胞中其啟動(dòng)子的去甲基化作用恢復(fù)了突變神經(jīng)元 供了可能.的野生型表型.并且在移植到小鼠腦部后，體內(nèi)的編輯神經(jīng)元中FMR1的重新激活得以維持.研究還證明有絲分裂后FXS神經(jīng)元中CGG重復(fù)的去甲基化會(huì)重新激活FMR1,并逆轉(zhuǎn)與FXS神經(jīng)元相關(guān)的自發(fā)性過度活躍，即通過表觀基因組編輯逆轉(zhuǎn)基因失活可能是涉及表觀遺傳沉默的疾病的有效治療策略.Wu等使用dCas9-DNMT3a系統(tǒng)來精確修飾SAMRCA2啟動(dòng)子的CpG島，評(píng)估SMARCA2啟動(dòng)子甲基化在SMARCA2轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用和其在肺癌發(fā)展中的抑癌作用.發(fā)現(xiàn)SMARCA2在肺癌中的表達(dá)下