蛋白質(zhì)工程制藥EPO1課件

蛋白質(zhì)工程制藥

：EPO的改造生物技術(shù)制藥上游主講人：Dr.張杰蛋白質(zhì)工程制藥

：EPO的改造生物技術(shù)制藥上游主講人：Dr.1蛋白質(zhì)工程簡介

(PROTEINENGINEERING)蛋白質(zhì)工程簡介

(PROTEINENGINEERING)2序論：蛋白質(zhì)工程簡介

蛋白質(zhì)工程的含義

蛋白質(zhì)工程的誕生

蛋白質(zhì)工程的主要內(nèi)容和基本目的

蛋白質(zhì)工程與基因工程的區(qū)別

主要參考書序論：蛋白質(zhì)工程簡介蛋白質(zhì)工程的含義3一蛋白質(zhì)工程的含義

蛋白質(zhì)工程根據(jù)蛋白質(zhì)的精細結(jié)構(gòu)和生物活力的作用機制之間的關(guān)系，利用基因工程的手段，按照人類自身的需要，定向地改造天然的蛋白質(zhì)或設(shè)計制造新的蛋白質(zhì)。

一蛋白質(zhì)工程的含義蛋白質(zhì)工程4二蛋白質(zhì)工程的誕生

一張藍圖上世紀70年代，特別是80年代初結(jié)構(gòu)生物學(xué)揭示了大量蛋白質(zhì)分子的精確立體結(jié)構(gòu)及其與復(fù)雜生物學(xué)功能的關(guān)系，為設(shè)計改造天然蛋白質(zhì)提供了藍圖一項工具分子遺傳學(xué)發(fā)展了以定點誘變?yōu)橹行牡幕虿僮骷夹g(shù)，為通過基因修飾改造蛋白質(zhì)提供了工具。二蛋白質(zhì)工程的誕生一張藍圖51983年，Ulmer在“Science”上發(fā)表以“ProteinEngineering‘’(蛋白質(zhì)工程)為題的專論，一般將此視為蛋白質(zhì)工程誕生的標志。蛋白質(zhì)工程的主要內(nèi)容和基本目的可以概括為：以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系為基礎(chǔ)，通過有控制的修飾和合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)加以定向改造，設(shè)計、構(gòu)建并最終生產(chǎn)出性能比自然界存在的蛋白質(zhì)更加優(yōu)良、更加符合人類社會需要的新型蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程的誕生的標志1983年，Ulmer在“Science”上發(fā)表以“Prot61983年，美國GENE公司的Ulmer在“Science”上發(fā)表以“ProteinEngineering‘’(蛋白質(zhì)工程)為題的專論，一般將此視為蛋白質(zhì)工程誕生的標志。(KevinM.Ulmer(Science219:666-671).).ABSTRCTTheprospectsforproteinengineering,includingtherolesofx-raycrystallography,chemicalsynthesisofDNA,andcomputermodellingofproteinstructureandfolding,arediscussed.Itisnowpossibletoattempttomodifymanydifferentpropertiesofproteinsbycombininginformationoncrystalstructureandproteinchemistrywithartificialgenesynthesis.Suchtechniquesofferthepotentialforalteringproteinstructureandfunctioninwaysnotpossiblebyanyothermethod

1983年，美國GENE公司的Ulmer在“Science”7三

蛋白質(zhì)工程的主要內(nèi)容和基本目的

以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能關(guān)系為基礎(chǔ)，通過有控制的基因修飾和基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)加以定向改造，設(shè)計，構(gòu)建并最終生產(chǎn)出性能比自然界存在的蛋白質(zhì)更加優(yōu)良，更符合人類需要的新型蛋白質(zhì)。

三蛋白質(zhì)工程的主要內(nèi)容和基本目的以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律8四

蛋白質(zhì)工程與基因工程的區(qū)別

基因工程是通過基因操作把外源基因轉(zhuǎn)入適當?shù)纳矬w內(nèi)，并在其中進行表達，它的產(chǎn)品還是該基因編碼的天然存在的蛋白質(zhì)（第一代）。蛋白質(zhì)工程則更進一步根據(jù)分子設(shè)計的方案，通過對天然蛋白質(zhì)的基因進行改造，來實現(xiàn)對其所編碼的蛋白質(zhì)的改造，它的產(chǎn)品已不再是天然的蛋白質(zhì)，而是經(jīng)過改造的，具有了人類所需要的優(yōu)點的蛋白質(zhì)。天然蛋白質(zhì)都是通過漫長的進化過程自然選擇而來的，而蛋白質(zhì)工程對天然蛋白質(zhì)的改造，好比是在實驗室里加快了的進化過程，期望能更快、更有效地為人類的需要服務(wù)。四蛋白質(zhì)工程與基因工程的區(qū)別9思路不同：基因工程是遵循中心法則，從DNA→mRNA→蛋白質(zhì)→折疊產(chǎn)生功能，基本上是生產(chǎn)出自然界已有的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程是按照以下思路進行的：確定蛋白質(zhì)的功能→蛋白質(zhì)應(yīng)有的高級結(jié)構(gòu)→蛋白質(zhì)應(yīng)具備的折疊狀態(tài)→應(yīng)有的氨基酸序列→應(yīng)有的堿基排列，可以創(chuàng)造自然界不存在的蛋白質(zhì)。思路不同：基因工程是遵循中心法則，從DNA→mRNA→蛋白質(zhì)10五

主要參考書

兩本書，一個人1《蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測與分子設(shè)計》

來魯華著

北京大學(xué)出版社,19932《PROTEINSTRUCTURE》Section1.Primarystructure,secondarymotifs,tertiaryarchitecture,andquaternaryorganizationJannetteCareyandVanessaHanleyPrincetonUniversityPrinceton,NJ08544-1009五主要參考書兩本書，一個人11蛋白質(zhì)工程制藥--EPO1課件123來魯華教授，女，博士，北京大學(xué)化學(xué)學(xué)院長江特聘教授，北京大學(xué)理論生物學(xué)中心常務(wù)副主任，分子動態(tài)與穩(wěn)態(tài)國家重點實驗室主任，國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項目首席科學(xué)家，國家杰出青年基金獲得者。1984年本科畢業(yè)于北京大學(xué)化學(xué)系，1989年在北京大學(xué)化學(xué)系獲博士學(xué)位。1998-1999年期間為美國加州大學(xué)伯克萊分校伯克萊學(xué)者。承擔過國家自然科學(xué)青年基金，國家杰出青年基金，攀登計劃項目，八六三項目等。獲得過國家自然科學(xué)三等獎1次，求是基金會青年科學(xué)家獎勵，中國科協(xié)青年科技獎等。發(fā)表論文近百篇，其中SCI收錄論文80余篇。來魯華教授從1987年開始從事化學(xué)與生物學(xué)的交叉研究，特別是生物信息學(xué)研究，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測及分子設(shè)計方面做過大量工作，近年的主要工作方向為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究，發(fā)展了用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用定量研究的平均勢方法。

4該領(lǐng)域的其他著名學(xué)者：北大的顧孝誠,北方基因中心于軍、楊煥明;清華的李衍達、饒子和;軍科院賀福初、黃培堂、;協(xié)和的沈巖;瑞金醫(yī)院的陳竺、

生化所的丁達夫、

上海生物信息中心的趙國屏等3來魯華教授，女，博士，13六

小結(jié)

蛋白質(zhì)工程的主要內(nèi)涵及基本目的；

蛋白質(zhì)工程與基因工程的主要區(qū)別。六小結(jié)14思考題：酶工程與蛋白質(zhì)工程有什么區(qū)別？

提示：酶工程就是指將酶所具有的生物催化作用，借助工程學(xué)的手段，應(yīng)用于生產(chǎn)、生活、醫(yī)療診斷和環(huán)境保護等方面的一門科學(xué)技術(shù)。概括地說，酶工程是由酶制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用兩方面組成的。酶工程的應(yīng)用主要集中于食品工業(yè)、輕工業(yè)以及醫(yī)藥工業(yè)中。

思考題：酶工程與蛋白質(zhì)工程有什么區(qū)別？提示：15蛋白質(zhì)工程的主要內(nèi)容和基本目的可以概括為：以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系為基礎(chǔ)，通過有控制的修飾和合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)加以定向改造，設(shè)計、構(gòu)建并最終生產(chǎn)出性能比自然界存在的蛋白質(zhì)更加優(yōu)良、更加符合人類社會需要的新型蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程的主要內(nèi)容和基本目的可以概括為：162．兩個主要的哺乳動物細胞表達系統(tǒng)在哺乳動物細胞中有兩個基因表達系統(tǒng)可供選擇，一是瞬時表達系統(tǒng)，一是穩(wěn)定表達系統(tǒng)。瞬時基因表達系統(tǒng)是一個簡單、有效的外源蛋白表達手段，其表達水平最高可以達到穩(wěn)定細胞表達水平。蛋白質(zhì)是由未整合的、不復(fù)制的質(zhì)粒DNA產(chǎn)生的，這樣使得蛋白質(zhì)表達的時間相對短，只有48h到7天。穩(wěn)定表達系統(tǒng)需要得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細胞株，需要1～2個月的時間，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細胞中，DNA被整合到染色體中，這使得重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物可以一代接一代地產(chǎn)生。2．兩個主要的哺乳動物細胞表達系統(tǒng)在哺乳動物細胞中有兩個基17噬菌體顯示(Phagedisplay)對EPO分子片段的篩選關(guān)于噬菌體顯示的表達載體噬菌體顯示技術(shù)的操作EPO-EPOREMP-EBP

噬菌體顯示(Phagedisplay)對EPO分子片段的篩18GeorgeP.SmithValeryA.PetrenkoGeorgeP.SmithValeryA.Petre19GeorgeP.Smithb.in1941.Bsc.degreeinbiologyin1963,aPh.D.inbacteriologyandimmunologyfromHarvardUniversityin1970.AfterapostdoctoralfellowshipwithOliverSmithiesattheUniversityofWisconsin,hejoinedthefacultyoftheDivisionofBiologicalSciencesattheUniversityofMissouriinColumbiain1975asAssistantProfessorandsincehasbeenpromotedtoAssociateandFullProfessor.Hehaspublished35papersinareasincludingantibodystructureandevolution,theevolutionofrepeatedDNAsequences,genomics,andthebiologyofthefilamentousphage.Itisfromhisinterestinthefilamentousphagethattheideaofphagedisplayevolved.ValeryA.Petrenkob.In1949,haspublishedover70papersandhas13inventionsandpatents.GeorgeP.Smith20OverviewThepast10yearshasseenremarkableprogressinourunderstandingofthereplicationcycleoftheM13phageThelifecycleisverysophisticatedInitialinfectiontransfersgeneticmaterialintohostwithlittlemembranedisruption.LateinfectionstagesperturbhostmembraneforreleaseofvirionsM13isnon-lyticOverviewThepast10yearshas21M13StructureDimensions:6.5nmindiameterLengthdependantongenomebutwildtypeapproximately930nmMass16.3MDofwhich87%comprisedofproteinGenome:SinglestrandedcircularDNAmolecule,covalentlyclosedHousedinaflexibleproteincylinderM13StructureDimensions:22M13StructureGenomeorientation78NucleotidehairpinregioncalledthepackagingsignallocatedatpVII/pIXterminusM13StructureGenomeorientatio23M13StructureProteinsLengthofphagecylindercomprises2700copiesofthe50-amino-acidmajorcoatproteinpVIIIAtoneterminus:5copiesof33AAresiduepVII5copiesof32AAresiduepIXAtoneterminus:5copiesof406AAresiduepIII5copiesof112AAresiduepVIM13StructureProteins24M13GeneFunctionsM13GeneFunctions25PhageLifeCycleInfectionprocessMultistepRequiresbacterialFconjugativepilusandbacterialTolQ,R&Acytoplasmicmembraneproteins.InitiatedbybindingofFpilustophagepIIIN2domain.Pilusretracts(triggeredbyphage???)bringingpIIIterminustotheperiplasm.N2bindingreleasesN1forinteractionwithbacterialTolAPhageFPilusOMCMTolQTolATolRPeriplasmN1N2PhageLifeCycleInfectionproc26PhageLifeCycleInfectionprocesscontSubsequentstepsunclearpVIII,pVII&pIXdisassembleintocytoplasmicmembraneasphageDNAistranslocatedintocytoplasm?OnceinthemembranepVIIIjoinspoolofnewlysynthesisedpVIIIfornewparticleformation.PhageLifeCycleInfectionproc27PhageLifeCycleReplicationComplementary(-)DNAstrandtoviral(+)DNAsynthesisedbybacterialenzymesGyrase,atopoisomerase,catalysesformationofdsDNAsupercoilscalledthereplicativeform(RF)The(-)strandoftheRFistranscribedandtranslatedintothephageproteinsThepIIproteinnicksthe(+)strandRFintheintergenicregiontoproduceaprimerforsynthesisofanewviralstrandpIIcircularisesthedisplaced(+)strandandconvertsittoasupercoileddsDNA;apoolofprogenydsDNAisthusformedAtacriticalconcentrationofpV,dimersofpVbindtothedsDNApreventingfurtherdsDNAproductionbutallowingsynthesisof(+)DNAPhageLifeCycleReplication28PhageLifeCycleReplicationpVdimersbindtothe(+)strandandwrapsitupA78nucleotidehairpinregionoftheDNAremainspVfreeandactsasapackagingsignalinitiatingthephageassemblyreactionpXisalsocytoplasmicallylocatedandisrequiredforreplicationbutitsroleisunclearAlloftheotherphageproteinsaresynthesisedandinsertedintothebacterialmembranePhageLifeCycleReplication29PhageLifeCycleAssemblyOccursatbacterialadhesionzonelikesitespVdimersareremovedandthecapsidproteinsareassembledaroundtheDNAasitisextruded.TheprocessisinitiatedbyinteractionofpVII,pIXandpVIIIwiththeDNApackagingsignalUnknownhowpVIandpIIIareaddedatendofvirionPhageLifeCycleAssembly30PhageReplicationSchematicDNAReplicationProteinsCapsid&Assembly

Proteins(+)+++/-pVPhageAssemblySiteFPilusPhageDNAPhageReplicationSchematicDNA31PhageDisplayLibrariesPhagedisplayisapowerfultoolthatextendstherangeofmoderncombinatorialscreeningtechniques,allowingthediscoveryandcharacterisationofproteinsthatinteractwithadesiredtarget.Phagedisplayisasysteminwhichaproteinisdisplayedonthesurfaceofaphageasafusionwithoneofthecoatproteinsofthevirus.TheDNAthatencodesthisproteinishousedwithinthevirion.BycloninglargenumbersofDNAsequencesintothephage,displaylibrariesareproducedwitharepertoireofmanybillionsofuniquedisplayedproteins.PhageDisplayLibrariesPhaged32PhageDisplayLibrariesUsingaprocessofbiopanning,onecanrescuephagethatdisplayaproteinthatspecificallybindstoatargetofinterest.Briefly,asimplemethodforbiopanninginvolvescoatingaplatewiththetargetandincubatingthelibraryontheplatetoallowphagedisplayingacomplementaryproteintothetargettobind.Non-bindingphagearethenwashedawayandthosethatareboundareeluted.Infectionofbacteriawiththebindingphageresultsinphageamplification.Successiveroundsofbiopanningenrichthepoolofphage,withclonesthatspecificallybindthetarget.PhageDisplayLibrariesUsinga33PeptidePhageDisplaypVIIIPeptideDisplayDisplayoneverycopyofpVIIIlimitedto6-8aminoacidsbutarepotentiallyimmunogenicandsusceptibletoproteasesHybridvirionsinwhich80%ofpVIIIarewild-typeallowlargepeptidesandproteinstobedisplayedpIIIPeptideDisplayOnlyfivemoleculescanbedisplayedperphageLargeinsertspackagewellbutreduceinfectivityOvercomebydisplayingpeptideononlyonepIIImolecule=phagemidsystem;pIIIwildtypeencodedbyhelperphage,displayedpeptideencodedbyphagemidPeptidePhageDisplaypVIIIPep34Phagedisplaymethod(1)M13(afilamentousphagecontainingss-DNAencasedinaproteincoat):containsfivecoatproteins,twoofwhicharegVIIIp(geneVIIIprotein)andgIIIp(geneIIIprotein).Phagedisplaymethod(1)M13(a35Phagedisplaymethod(2)Phagedisplaymethod(2)36Phagedisplaymethod(2):(contd.)Phagedisplaymethod(2):(con37Phagedisplaymethod(2):(contd.)Phagedisplaymethod(2):(con38PhagedisplayofrandompeptidelibrariesidentifiedagonsitsoferythropoietinreceptorAgonists:whichmimicthefunctionofahormonebybindingtoitsreceptorandcausingthenormalresponse.Antagonists:whichbindtothereceptorbutdonotactivatehormone-inducedeffectsPhagedisplayofrandompeptid39Phagedisplayofrandompeptidelibrariesidentifiedagonsitsoferythropoietinreceptor(contd.)Toidentifypeptidesorsmallmoleculeswhicheitherinhibitorstimulatehormonefunction.Thehot-spotprinciple:asmallnumberofresiduesatabindinginterfacecontributemostofthebindingenergy.Erythropoietin(EPO):acytokinehormonewhichstimulatesformationofredbloodcells.EPOR:erythropoietinreceptorEBP:extra-cellulardomainofEPORPhagedisplayofrandompeptid40Phagedisplayofrandompeptidelibrariesidentifiedagonsitsoferythropoietinreceptor(contd.)NicholasWrightonandcoworkersusedthephagedisplaymethodstoisolatea20residuepeptide,calledEMP1,whichmimicstheactivityofEPObypromotingdimerizationandactivationofEPOR.EMPIwasselectedbytwocyclesofphagedisplay.Phagedisplayofrandompeptid41Phagedisplayofrandompeptidelibrariesidentifiedagonsitsoferythropoietinreceptor(contd.)First,randompeptidelibrariesofthesequenceCX8CweredisplayedasgVIIIpfusions.MultivalentgVIIIproteinfusiondisplaypermittedselectionofweakbindersbyavidity(multiple)bindingtoimmobilizeddimersofEBP.TheseweaklybindingpeptideswereexpandedtotheformofX5CX8CX3andparticularlyrandomizedintheX8residues.FusionofthisnewlibrarytogIIIpyieldedalowervalency化合價ofdisplayandallowedselectionoftightbinders.Phagedisplayofrandompeptid42EMP1,isolatedfromthislibrary,boundtoEBPwithaKdof0.2MandstimulatedEPORactivityinvivoEachpeptidemonomerformsahairpin,stabilizedbyanintramoleculardisulfidebondEMP1,isolatedfromthislibra43蛋白質(zhì)工程制藥--EPO1課件44ConclusionPhagedisplayisarapidandeffectivetoolforthediscoveryofbiologicalmoleculesthatmayprovideopportunitiesfortherapeutics,diagnosticsandtargetingagents.Currentlyweareexploitingtheuseofphagedisplaylibrariestotargetthemicrovasculatureoftheblood-brainbarrierandthelungepitheliumusingarangeofprimaryandimmortalisedcelllinestodiscovernoveltargetingagents.Toaccomplishthisweareutilising: ApeptidestrategywiththeNEBPhD-C7Cpeptidekit AmonoclonalantibodystrategywiththeMRCTomlinson scFVLibraryConclusionPhagedisplayisar45蛋白質(zhì)工程制藥

：EPO的改造生物技術(shù)制藥上游主講人：Dr.張杰蛋白質(zhì)工程制藥

：EPO的改造生物技術(shù)制藥上游主講人：Dr.46蛋白質(zhì)工程簡介

(PROTEINENGINEERING)蛋白質(zhì)工程簡介

(PROTEINENGINEERING)47序論：蛋白質(zhì)工程簡介

蛋白質(zhì)工程的含義

蛋白質(zhì)工程的誕生

蛋白質(zhì)工程的主要內(nèi)容和基本目的

蛋白質(zhì)工程與基因工程的區(qū)別

主要參考書序論：蛋白質(zhì)工程簡介蛋白質(zhì)工程的含義48一蛋白質(zhì)工程的含義

蛋白質(zhì)工程根據(jù)蛋白質(zhì)的精細結(jié)構(gòu)和生物活力的作用機制之間的關(guān)系，利用基因工程的手段，按照人類自身的需要，定向地改造天然的蛋白質(zhì)或設(shè)計制造新的蛋白質(zhì)。

一蛋白質(zhì)工程的含義蛋白質(zhì)工程49二蛋白質(zhì)工程的誕生

一張藍圖上世紀70年代，特別是80年代初結(jié)構(gòu)生物學(xué)揭示了大量蛋白質(zhì)分子的精確立體結(jié)構(gòu)及其與復(fù)雜生物學(xué)功能的關(guān)系，為設(shè)計改造天然蛋白質(zhì)提供了藍圖一項工具分子遺傳學(xué)發(fā)展了以定點誘變?yōu)橹行牡幕虿僮骷夹g(shù)，為通過基因修飾改造蛋白質(zhì)提供了工具。二蛋白質(zhì)工程的誕生一張藍圖501983年，Ulmer在“Science”上發(fā)表以“ProteinEngineering‘’(蛋白質(zhì)工程)為題的專論，一般將此視為蛋白質(zhì)工程誕生的標志。蛋白質(zhì)工程的主要內(nèi)容和基本目的可以概括為：以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系為基礎(chǔ)，通過有控制的修飾和合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)加以定向改造，設(shè)計、構(gòu)建并最終生產(chǎn)出性能比自然界存在的蛋白質(zhì)更加優(yōu)良、更加符合人類社會需要的新型蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程的誕生的標志1983年，Ulmer在“Science”上發(fā)表以“Prot511983年，美國GENE公司的Ulmer在“Science”上發(fā)表以“ProteinEngineering‘’(蛋白質(zhì)工程)為題的專論，一般將此視為蛋白質(zhì)工程誕生的標志。(KevinM.Ulmer(Science219:666-671).).ABSTRCTTheprospectsforproteinengineering,includingtherolesofx-raycrystallography,chemicalsynthesisofDNA,andcomputermodellingofproteinstructureandfolding,arediscussed.Itisnowpossibletoattempttomodifymanydifferentpropertiesofproteinsbycombininginformationoncrystalstructureandproteinchemistrywithartificialgenesynthesis.Suchtechniquesofferthepotentialforalteringproteinstructureandfunctioninwaysnotpossiblebyanyothermethod

1983年，美國GENE公司的Ulmer在“Science”52三

蛋白質(zhì)工程的主要內(nèi)容和基本目的

以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能關(guān)系為基礎(chǔ)，通過有控制的基因修飾和基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)加以定向改造，設(shè)計，構(gòu)建并最終生產(chǎn)出性能比自然界存在的蛋白質(zhì)更加優(yōu)良，更符合人類需要的新型蛋白質(zhì)。

三蛋白質(zhì)工程的主要內(nèi)容和基本目的以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律53四

蛋白質(zhì)工程與基因工程的區(qū)別

基因工程是通過基因操作把外源基因轉(zhuǎn)入適當?shù)纳矬w內(nèi)，并在其中進行表達，它的產(chǎn)品還是該基因編碼的天然存在的蛋白質(zhì)（第一代）。蛋白質(zhì)工程則更進一步根據(jù)分子設(shè)計的方案，通過對天然蛋白質(zhì)的基因進行改造，來實現(xiàn)對其所編碼的蛋白質(zhì)的改造，它的產(chǎn)品已不再是天然的蛋白質(zhì)，而是經(jīng)過改造的，具有了人類所需要的優(yōu)點的蛋白質(zhì)。天然蛋白質(zhì)都是通過漫長的進化過程自然選擇而來的，而蛋白質(zhì)工程對天然蛋白質(zhì)的改造，好比是在實驗室里加快了的進化過程，期望能更快、更有效地為人類的需要服務(wù)。四蛋白質(zhì)工程與基因工程的區(qū)別54思路不同：基因工程是遵循中心法則，從DNA→mRNA→蛋白質(zhì)→折疊產(chǎn)生功能，基本上是生產(chǎn)出自然界已有的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程是按照以下思路進行的：確定蛋白質(zhì)的功能→蛋白質(zhì)應(yīng)有的高級結(jié)構(gòu)→蛋白質(zhì)應(yīng)具備的折疊狀態(tài)→應(yīng)有的氨基酸序列→應(yīng)有的堿基排列，可以創(chuàng)造自然界不存在的蛋白質(zhì)。思路不同：基因工程是遵循中心法則，從DNA→mRNA→蛋白質(zhì)55五

主要參考書

兩本書，一個人1《蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測與分子設(shè)計》

來魯華著

北京大學(xué)出版社,19932《PROTEINSTRUCTURE》Section1.Primarystructure,secondarymotifs,tertiaryarchitecture,andquaternaryorganizationJannetteCareyandVanessaHanleyPrincetonUniversityPrinceton,NJ08544-1009五主要參考書兩本書，一個人56蛋白質(zhì)工程制藥--EPO1課件573來魯華教授，女，博士，北京大學(xué)化學(xué)學(xué)院長江特聘教授，北京大學(xué)理論生物學(xué)中心常務(wù)副主任，分子動態(tài)與穩(wěn)態(tài)國家重點實驗室主任，國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項目首席科學(xué)家，國家杰出青年基金獲得者。1984年本科畢業(yè)于北京大學(xué)化學(xué)系，1989年在北京大學(xué)化學(xué)系獲博士學(xué)位。1998-1999年期間為美國加州大學(xué)伯克萊分校伯克萊學(xué)者。承擔過國家自然科學(xué)青年基金，國家杰出青年基金，攀登計劃項目，八六三項目等。獲得過國家自然科學(xué)三等獎1次，求是基金會青年科學(xué)家獎勵，中國科協(xié)青年科技獎等。發(fā)表論文近百篇，其中SCI收錄論文80余篇。來魯華教授從1987年開始從事化學(xué)與生物學(xué)的交叉研究，特別是生物信息學(xué)研究，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測及分子設(shè)計方面做過大量工作，近年的主要工作方向為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究，發(fā)展了用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用定量研究的平均勢方法。

4該領(lǐng)域的其他著名學(xué)者：北大的顧孝誠,北方基因中心于軍、楊煥明;清華的李衍達、饒子和;軍科院賀福初、黃培堂、;協(xié)和的沈巖;瑞金醫(yī)院的陳竺、

生化所的丁達夫、

上海生物信息中心的趙國屏等3來魯華教授，女，博士，58六

小結(jié)

蛋白質(zhì)工程的主要內(nèi)涵及基本目的；

蛋白質(zhì)工程與基因工程的主要區(qū)別。六小結(jié)59思考題：酶工程與蛋白質(zhì)工程有什么區(qū)別？

提示：酶工程就是指將酶所具有的生物催化作用，借助工程學(xué)的手段，應(yīng)用于生產(chǎn)、生活、醫(yī)療診斷和環(huán)境保護等方面的一門科學(xué)技術(shù)。概括地說，酶工程是由酶制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用兩方面組成的。酶工程的應(yīng)用主要集中于食品工業(yè)、輕工業(yè)以及醫(yī)藥工業(yè)中。

思考題：酶工程與蛋白質(zhì)工程有什么區(qū)別？提示：60蛋白質(zhì)工程的主要內(nèi)容和基本目的可以概括為：以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系為基礎(chǔ)，通過有控制的修飾和合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)加以定向改造，設(shè)計、構(gòu)建并最終生產(chǎn)出性能比自然界存在的蛋白質(zhì)更加優(yōu)良、更加符合人類社會需要的新型蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程的主要內(nèi)容和基本目的可以概括為：612．兩個主要的哺乳動物細胞表達系統(tǒng)在哺乳動物細胞中有兩個基因表達系統(tǒng)可供選擇，一是瞬時表達系統(tǒng)，一是穩(wěn)定表達系統(tǒng)。瞬時基因表達系統(tǒng)是一個簡單、有效的外源蛋白表達手段，其表達水平最高可以達到穩(wěn)定細胞表達水平。蛋白質(zhì)是由未整合的、不復(fù)制的質(zhì)粒DNA產(chǎn)生的，這樣使得蛋白質(zhì)表達的時間相對短，只有48h到7天。穩(wěn)定表達系統(tǒng)需要得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細胞株，需要1～2個月的時間，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細胞中，DNA被整合到染色體中，這使得重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物可以一代接一代地產(chǎn)生。2．兩個主要的哺乳動物細胞表達系統(tǒng)在哺乳動物細胞中有兩個基62噬菌體顯示(Phagedisplay)對EPO分子片段的篩選關(guān)于噬菌體顯示的表達載體噬菌體顯示技術(shù)的操作EPO-EPOREMP-EBP

噬菌體顯示(Phagedisplay)對EPO分子片段的篩63GeorgeP.SmithValeryA.PetrenkoGeorgeP.SmithValeryA.Petre64GeorgeP.Smithb.in1941.Bsc.degreeinbiologyin1963,aPh.D.inbacteriologyandimmunologyfromHarvardUniversityin1970.AfterapostdoctoralfellowshipwithOliverSmithiesattheUniversityofWisconsin,hejoinedthefacultyoftheDivisionofBiologicalSciencesattheUniversityofMissouriinColumbiain1975asAssistantProfessorandsincehasbeenpromotedtoAssociateandFullProfessor.Hehaspublished35papersinareasincludingantibodystructureandevolution,theevolutionofrepeatedDNAsequences,genomics,andthebiologyofthefilamentousphage.Itisfromhisinterestinthefilamentousphagethattheideaofphagedisplayevolved.ValeryA.Petrenkob.In1949,haspublishedover70papersandhas13inventionsandpatents.GeorgeP.Smith65OverviewThepast10yearshasseenremarkableprogressinourunderstandingofthereplicationcycleoftheM13phageThelifecycleisverysophisticatedInitialinfectiontransfersgeneticmaterialintohostwithlittlemembranedisruption.LateinfectionstagesperturbhostmembraneforreleaseofvirionsM13isnon-lyticOverviewThepast10yearshas66M13StructureDimensions:6.5nmindiameterLengthdependantongenomebutwildtypeapproximately930nmMass16.3MDofwhich87%comprisedofproteinGenome:SinglestrandedcircularDNAmolecule,covalentlyclosedHousedinaflexibleproteincylinderM13StructureDimensions:67M13StructureGenomeorientation78NucleotidehairpinregioncalledthepackagingsignallocatedatpVII/pIXterminusM13StructureGenomeorientatio68M13StructureProteinsLengthofphagecylindercomprises2700copiesofthe50-amino-acidmajorcoatproteinpVIIIAtoneterminus:5copiesof33AAresiduepVII5copiesof32AAresiduepIXAtoneterminus:5copiesof406AAresiduepIII5copiesof112AAresiduepVIM13StructureProteins69M13GeneFunctionsM13GeneFunctions70PhageLifeCycleInfectionprocessMultistepRequiresbacterialFconjugativepilusandbacterialTolQ,R&Acytoplasmicmembraneproteins.InitiatedbybindingofFpilustophagepIIIN2domain.Pilusretracts(triggeredbyphage???)bringingpIIIterminustotheperiplasm.N2bindingreleasesN1forinteractionwithbacterialTolAPhageFPilusOMCMTolQTolATolRPeriplasmN1N2PhageLifeCycleInfectionproc71PhageLifeCycleInfectionprocesscontSubsequentstepsunclearpVIII,pVII&pIXdisassembleintocytoplasmicmembraneasphageDNAistranslocatedintocytoplasm?OnceinthemembranepVIIIjoinspoolofnewlysynthesisedpVIIIfornewparticleformation.PhageLifeCycleInfectionproc72PhageLifeCycleReplicationComplementary(-)DNAstrandtoviral(+)DNAsynthesisedbybacterialenzymesGyrase,atopoisomerase,catalysesformationofdsDNAsupercoilscalledthereplicativeform(RF)The(-)strandoftheRFistranscribedandtranslatedintothephageproteinsThepIIproteinnicksthe(+)strandRFintheintergenicregiontoproduceaprimerforsynthesisofanewviralstrandpIIcircularisesthedisplaced(+)strandandconvertsittoasupercoileddsDNA;apoolofprogenydsDNAisthusformedAtacriticalconcentrationofpV,dimersofpVbindtothedsDNApreventingfurtherdsDNAproductionbutallowingsynthesisof(+)DNAPhageLifeCycleReplication73PhageLifeCycleReplicationpVdimersbindtothe(+)strandandwrapsitupA78nucleotidehairpinregionoftheDNAremainspVfreeandactsasapackagingsignalinitiatingthephageassemblyreactionpXisalsocytoplasmicallylocatedandisrequiredforreplicationbutitsroleisunclearAlloftheotherphageproteinsaresynthesisedandinsertedintothebacterialmembranePhageLifeCycleReplication74PhageLifeCycleAssemblyOccursatbacterialadhesionzonelikesitespVdimersareremovedandthecapsidproteinsareassembledaroundtheDNAasitisextruded.TheprocessisinitiatedbyinteractionofpVII,pIXandpVIIIwiththeDNApackagingsignalUnknownhowpVIandpIIIareaddedatendofvirionPhageLifeCycleAssembly75PhageReplicationSchematicDNAReplicationProteinsCapsid&Assembly

Proteins(+)+++/-pVPhageAssemblySiteFPilusPhageDNAPhageReplicationSchematicDNA76PhageDisplayLibrariesPhagedisplayisapowerfultoolthatextendstherangeofmoderncombinatorialscreeningtechniques,allowingthediscoveryandcharacterisationofproteinsthatinteractwithadesiredtarget.Phagedisplayisasysteminwhichaproteinisdisplayedonthesurfaceofaphageasafusionwithoneofthecoatproteinsofthevirus.TheDNAthatencodesthisproteinishousedwithinthevirion.BycloninglargenumbersofDNAsequencesintothephage,displaylibrariesareproducedwitharepertoireofmanybillionsofuniquedisplayedproteins.PhageDisplayLibrariesPhaged77PhageDisplayLibrariesUsingaprocessofbiopanning,onecanrescuephagethatdisplayaproteinthatspecificallybindstoatargetofinterest.Briefly,asimplemethodforbiopanninginvolvescoatingaplatewiththetargetandincubatingthelibraryontheplatetoallowphagedisplayingacomplementaryproteintothetargettobind.Non-bindingphagearethenwashedawayandthosethatareboundareeluted.Infectionofbacteriawiththebindingphageresultsinphageamplification.Successiveroundsofbiopanningenrichthepoolofphage,withclonesthatspecificallybindthetarget.PhageDisplayLibrariesUsinga78PeptidePhageDisplaypVIIIPeptideDisplayDisplayoneverycopyofpVIIIlimitedto6-8aminoacidsbutarepotentiallyimmunogenicandsusceptibletoproteasesHybridvirionsinwhich80%ofpVIIIarewild-typeallowlargepeptidesandproteinstobedisplayedpIIIPeptideDisplayOnlyfivemoleculescanbedisplayedperphageLargeinsertspackagewellbutreduceinfectivityOvercomebydisplayingpeptideononlyonepIIImolecule=phagemidsystem;pIIIwildtypeencodedbyhelperphage,displayedpeptideencodedbyphagemidPeptidePhageDisplaypVIIIPep79Phagedisplaymethod(1)M13(afilamentousphagecontainingss-DNAencasedinaproteincoat):containsfivecoatproteins,twoofwhicharegVIIIp(geneVIIIprotein)andgIIIp(geneIIIprotein).Phagedisplaymethod(1)M13(a80Phagedisplaymethod(2)Phagedisplaymethod(2)81Phagedisplaymethod(2):(contd.)Phagedisplaymethod(2):(con82Phagedisplaymethod(2):(contd.)Phagedisplaymethod(2):(con83Phagedisplayofrandompeptidelibrariesidentifiedag