DB37-T 4049-2020 種雞雞毒支原體和滑液囊支原體病凈化技術(shù)規(guī)范-（高清版）

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DB37山 東 省 地 方 標 準DB37/T4049—2020TechnicalcriterionforeradicationofmycoplasmagallisepticumandmycoplasmaTechnicalcriterionforeradicationofmycoplasmagallisepticumandmycoplasmasynoviaeinbreederflock2020070920200809山東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布前言本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織實施。本標準由山東省畜牧業(yè)標準化技術(shù)委員會歸口。種雞雞毒支原體和滑液囊支原體病凈化技術(shù)規(guī)范范圍本標準規(guī)定了種雞群雞毒支原體和滑液囊支原體病凈化技術(shù)規(guī)范。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T17999.4SPF雞微生物學監(jiān)測第4部分：SPF雞血清平板凝集試驗NY/T553禽支原體PCR檢測方法NY/T1168畜禽糞便無害化處理技術(shù)規(guī)范NY/T5030無公害農(nóng)產(chǎn)品獸藥使用準則DB34/T2160雞毒支原體感染防治技術(shù)DB63/T1652病害動物及病害動物產(chǎn)品無害化處理技術(shù)規(guī)程T/CVMA1禽白血病凈化技術(shù)規(guī)范世界動物衛(wèi)生組織（OIE）陸生動物診斷試驗和疫苗標準手冊下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1種雞breedingchicken3.2家禽疫病凈化poultrydiseaseeradication診斷參照DB34/T2160的臨床癥狀和病理變化。感染通常見于4周～16周齡的雞。雞群的患病率一般為5%～10%，病死率不超過10%。對種雞群雞毒支原體和滑液囊支原體凝集抗體的檢測，參照GB/T17999.4進行，在2min內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽性；2min內(nèi)不凝集者為陰性；介于上述兩者之間為可疑，進行復核試驗，如仍為可疑，判為陽性（見附錄B）。聚合酶鏈式反應（PCR）和環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）方法可任選其一。試劑除非另有說明，僅使用分析純試劑。GB/T66822×TaqPCRMasterMix10×LAMPAmplificationBuffer，-2010mmol/LBetaineA.1，-20BstDNAPolymerase（6U/μL），-204.4.1.6MgSO4(100mmol/L)A.2，-20dNTP(10mmol/L)，-20SYBRGreen4DNAMarker2000，-2043DNA4MGF-36MSGX11-TPCR≥12000r/min4.4.2.32μL、10μL、100μL200μL1000μL0.01mg。取咽喉棉拭子。將棉拭子樣品懸浮于1mLPBS溶液中，混勻成懸浮液。DNA4000r/min5min1.5mL℃條件下，12000g20min25μL～50μL0.1%焦碳DEPDNADNA（PCR）雞毒支原體和滑液囊支原體的PCR檢測方法使用的引物及反應條件等參考NY/T553。（LAMP）引物的mgc2的16SrRNALAMP200bpMG-F3：5’-ACACTTGTTTTACATGAAGGT-3’MG-B3：5’-CAACCATCTTTTGGTGTTCT-3’MG-FIP：5’-ACAATCAACCCAGCACCTGCGTTGGTCCAAGAAAGATTACCT-3’MG-BIP：5’-TGTTTCTTTACTCTTGGGTTTAGGGTCACGTTCTTGGATCATCA-3’MS-F3：5’-GCATTAAGCGGATCGGTT-3’MS-B3：5’-AACTGCTGCATCAAGAGC-3’MS-FIP：5’-TGTTGCTGCTGTGTATTTTTCTTCTGCAGTTAAAGATGATGCACAA-3’MS-BIP：5’-ACTAGAAGATGGAACAAAACTTGCAGCAGATTCTAGATCACTTTGAGT-3’LAMP所采用的試劑盒反應體系見表1。表1禽支原體LAMP反應體系反應組分體積10×AmplificationbufferⅡ2.5μLdNTP混合液(10mmol/L)4.0μLF3/B3(10μmol/L)0.5μL×2FIP/BIP(30μmol/L)1μL×2Betaine(10mmol/L)2μLDNA1μLBstDNAPolymerase(6U/μL)1μLMgSO4(100mmol/L)1μLddH2010.5μL取DNA1-5μLLAMP1mL1000×SYBRGreen6360min，8010minLAMPSYBRGreenⅠ核酸染料與LAMPC）。參照T/CVMA11.5mL0.5mL將采集到的樣品一分為二。一部分樣品用于進行PCR或LAMP檢測（二選其一）。PCR按照NY/T553LAMP4.4.6PCR或LAMP即對可疑樣品的備份按照世界動物衛(wèi)生組織（OIE）陸生動物診斷試驗和疫苗標準手冊進行病原分離和鑒定。或LAMPPCR或LAMP觀察雞群，對有4.1.1或4.1.2臨床癥狀的可疑育成期雞進行淘汰。100SPA采集可疑雞群的咽喉棉拭子樣品進行PCR或LAMP，分別檢測雞毒支原體和雞滑液囊支原體。淘汰所有PCR或LAMP檢測陽性的雞。陰性雞群應小群隔離飼養(yǎng)，作為后備育種雞群。淘汰所有PCR或LAMP檢測陽性的雞。陰性雞群應小群隔離飼養(yǎng)，作為后備育種雞群。觀察開產(chǎn)前雞群，對有4.1.1或4.1.2臨床癥狀的可疑病雞進行淘汰。同5.1.2.2。同5.1.2.3。淘汰所有血清學檢測陽性和PCR或LAMP檢測陽性的雞。對檢測為陰性的雞群應維持小群飼養(yǎng)，作為后備育種雞群。觀察留種雞群，對有4.1.1或4.1.2臨床癥狀的可疑病雞進行淘汰。1005.1.2.2和5.2.2.3PCR或LAMP5.1.4.3預防用藥在留種前2周，按照7.2進行選擇用藥。5.1.5種蛋的選留和孵化5.1.1～5.1.4145℃，維持14父母代PCR或PCR或LAMP同5.1.2。同5.1.3。同5.1.4。5.2.1～5.2.4雞毒支原體和雞滑液囊支原體凈化后的商品代雞群。6凈化周期啟動和終止5.1.1～5.1.45.2.1～5.2.4凈化效果評估應按照國家農(nóng)業(yè)行業(yè)主管部門制定的雞毒支原體和雞滑液囊支原體病凈化評估程序和凈化評估標準。凈化評估標準見附錄D。6.3凈化后檢測比例的調(diào)整按照6.2所列要求判定為種雞達到雞毒支原體和雞滑液囊支原體病凈化狀態(tài)的雞群建議不再按照5.1.1～5.1.45.2.1～5.2.4105.1.1～5.1.4和5.2.1～5.2.42～37.1.9NY/T11687.1.9NY/T1168DB63/T1652化處理。NY/T50308檔案管理LAMP或PCR附錄A（資料性附錄）試劑的配制10mmol/LBetaine溶液Betaine 1.171510即配置成1mol/L濃度，取10μL加DEPC水至1mL，制成10mmol/LBetaine溶液。100mmol/LMgSO4MgSO4.7H2O 0.2461附錄B（資料性附錄）血清平板凝集試驗判定標準血清平板凝集試驗結(jié)果判定標準圖見圖B.1。圖B.1血清平板凝集試驗結(jié)果判定標準對照圖（左為陽性，中為可疑，右為陰性）附錄C（）LAMPC.1可見光下LAMP反應結(jié)果判定圖C.1可見光下LAMP反應陽性（綠色熒光）與陰性（橙黃色）對照圖C.2紫外光下LAMP反應結(jié)果圖C.2紫外光下LAMP反應陽性（綠色熒光）與陰性（無熒光）對照圖附錄D（資料性附錄）雞毒支原體病和滑液囊支原體病凈化評估標準同時滿足以下要求，視為達到凈化標準：——種雞群抽檢，雞毒支原體和滑液囊支原體病原學檢測均為陰性；——連續(xù)兩年以上無臨床病例；——現(xiàn)場綜合審查通過。同時滿足以下要求：150GB/T17999.4—2008SPA1D.2.2病原學評估（）3%～5PCRLAMP附錄E（）表E.1種雞群凈化雞毒支原體檢測記錄表雞場名稱：檢測日期：頁碼1/2種雞品種種群規(guī)模（羽）周齡（W）凈化世代抽檢量檢測項目雞毒支原體（MG）MG抗原及標準血清批號平板凝集反應SPA陰性編號陽性編號可疑編號PCR或LAMP陰性編號陽性編號