基因表達(dá)調(diào)控習(xí)題

（一）名詞解釋1.操縱子；2.啟動(dòng)子；3.增強(qiáng)子；4.衰減子；5.反式作用因子；6.降解物基因活化蛋白；7.克隆技術(shù)；8.限制性核酸內(nèi)切酶；9.基因組DNA文庫(kù)；10.cDNA文庫(kù)。（二）填充題.正調(diào)控和負(fù)調(diào)控是基因表達(dá)的兩種最基本的調(diào)節(jié)形式，其中原核細(xì)胞常用模式，而真核細(xì)胞常用模式。.在原核細(xì)胞中，由同一調(diào)控區(qū)控制的一群功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因組成一個(gè)基因表達(dá)調(diào)控單位，稱為，其調(diào)控區(qū)包括基因和基因。.有些基因的表達(dá)較少受環(huán)境的影響，在一個(gè)生物體的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，因此被稱為；另有一些基因表達(dá)極易受環(huán)境的影響，在特定環(huán)境信號(hào)刺激下，相應(yīng)的基因被激活，基因表達(dá)產(chǎn)物增加，這種基因是可的基因，相反，如果基因?qū)Νh(huán)境信號(hào)應(yīng)答時(shí)被抑制，這種基因是可的基因。.在基因重組技術(shù)中，切割DNA用，連接DNA用。.除噬菌體外，和也是分子克隆的常用載體。.用動(dòng)物病毒DNA改造的基因載體有和。用于植物基因工程的常用載體是。.將重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌稱，將噬菌體DNA轉(zhuǎn)入細(xì)菌稱。.Southern印跡法、Northern印跡法和Western印跡法是分別用于研究、和轉(zhuǎn)移和鑒定的幾種常規(guī)技術(shù)。三）選擇題（在備選答案中選出1個(gè)或多個(gè)正確答案）.一個(gè)操縱子通常含有A.一個(gè)啟動(dòng)序列和一個(gè)編碼基因B.一個(gè)啟動(dòng)序列和數(shù)個(gè)編碼基因C.數(shù)個(gè)啟動(dòng)序列和一個(gè)編碼基因D.數(shù)個(gè)啟動(dòng)序列和數(shù)個(gè)編碼基因E兩個(gè)啟動(dòng)序列和數(shù)個(gè)編碼基因.有關(guān)操縱子學(xué)說的論述，正確的是A.操縱子調(diào)控系統(tǒng)是真核生物基因調(diào)控的主要方式B.操縱子調(diào)控系統(tǒng)是原核生物基因調(diào)控的主要方式C.操縱子調(diào)控系統(tǒng)由調(diào)節(jié)基因、操縱基因、啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)基因組成D.誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄E.誘導(dǎo)物與啟動(dòng)子結(jié)合而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄.轉(zhuǎn)錄因子是A.調(diào)節(jié)DNA結(jié)合活性的小分子代謝效應(yīng)物B.調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄延伸速度的蛋白質(zhì)C.調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始速度的蛋白質(zhì)D.調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分解速度的蛋白質(zhì)E.促進(jìn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加工的蛋白質(zhì).阻遏蛋白（阻抑蛋白）識(shí)別操縱子中的A.啟動(dòng)基因B.結(jié)構(gòu)基因C.操縱基因D.內(nèi)含子E.調(diào)節(jié)基因.在下列哪種情況下，乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄活性最高A.高乳糖，低葡萄糖B.高乳糖，高葡萄糖C低乳糖，低葡萄糖D.低乳糖，高葡萄糖E.不一定.順式作用元件是指A.基因的5,側(cè)翼序列B.基因的3,側(cè)翼序列C基因的5,和3,側(cè)翼序列D.基因的5,和3,側(cè)翼序列以外的序列E.具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的特異DNA序列.反式作用因子是指A.具有激活功能的調(diào)節(jié)蛋白B.具有抑制功能的調(diào)節(jié)蛋白C.對(duì)自身基因具有激活功能的調(diào)節(jié)蛋白D.對(duì)另一基因具有激活功能的調(diào)節(jié)蛋白E.對(duì)另一基因有調(diào)節(jié)功能的蛋白質(zhì)因子.下列關(guān)于限制性內(nèi)切酶的敘述哪一項(xiàng)是錯(cuò)誤的A.它能識(shí)別DNA特定的堿基順序，并在特定的位點(diǎn)切斷DNAB.切割點(diǎn)附近的堿基順序一般呈回文結(jié)構(gòu)C.它能專一性降解經(jīng)甲基化修飾的DNAD.是重組DNA的重要工具酶E.主要從細(xì)菌中獲得.基因工程中，不常用到的酶是A.限制性核酸內(nèi)切酶B.DNA聚合酶C.DNA解鏈酶D.DNA連接酶E.反轉(zhuǎn)錄酶10下列哪項(xiàng)不能作為表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的方法？A.磷酸鈣轉(zhuǎn)染B.電穿孔C.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染D.氯化鈣轉(zhuǎn)染E.顯微注射.重組體的篩選方法有A.抗藥標(biāo)志篩選B.標(biāo)記補(bǔ)救C.分子雜交D.免疫化學(xué)E.酶聯(lián)免疫檢測(cè).cDNA是指A.在體內(nèi)合成的與病毒DNA或RNA互補(bǔ)的DNAB.在體外經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的與DNA互補(bǔ)的DNAC.在體外經(jīng)轉(zhuǎn)錄合成的與DNA互補(bǔ)的RNAD.在體外經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的與RNA互補(bǔ)的DNAE.在體內(nèi)經(jīng)轉(zhuǎn)錄合成的與DNA互補(bǔ)的RNA.建cDNA文庫(kù)時(shí)，首先需分離細(xì)胞的A.染色體DNAB.線粒體DNAC.總mRNAD.tRNAE.rRNA（四）判斷題.高等真核生物的大部分DNA是不為蛋白質(zhì)編碼的。.大多數(shù)管家基因編碼低豐度的mRNA..乳糖可以誘導(dǎo)乳糖操縱子的表達(dá)，所以乳糖對(duì)乳糖操縱子的調(diào)控屬于正調(diào)控系統(tǒng)。.某些蛋白質(zhì)既可以作為阻遏蛋白又可以作為激活蛋白參與基因表達(dá)的調(diào)控。.準(zhǔn)備用原核生物表達(dá)真核基因時(shí)，最好通過cDNA獲取目的基因。.用原核生物表達(dá)真核生物的糖蛋白，其表達(dá)產(chǎn)物不會(huì)有正常的生物學(xué)功能。.Ti質(zhì)?？梢噪S土壤農(nóng)桿菌進(jìn)入植物細(xì)胞。.用人噬菌體作克隆載體時(shí)，外源DNA片斷越小，克隆的成功率越高。.基因克隆選擇的宿主細(xì)胞必須無(wú)限制性核酸內(nèi)切酶。.采用藍(lán)白斑選擇法時(shí)，藍(lán)色菌落或噬菌斑是含有重組載體的克隆。（五）分析與計(jì)算題.簡(jiǎn)述操縱子的基本結(jié)構(gòu)。.舉例說明基因表達(dá)的誘導(dǎo)與阻遏，正調(diào)控與負(fù)調(diào)控。.概述原核生物基因表達(dá)調(diào)控的特點(diǎn)。.概述真核生物基因組的特點(diǎn)。.概述真核生物基因表達(dá)調(diào)控的特點(diǎn)。.簡(jiǎn)答真核生物基因表達(dá)的調(diào)控方式。.常用的限制性核酸內(nèi)切酶有哪些特點(diǎn)？.在基因克隆中，目的基因有哪些主要來(lái)源？.什么是cDNA文庫(kù)?cDNA文庫(kù)與基因組文庫(kù)有何差別？.用于DNA重組的載體應(yīng)具備什么條件?常用的載體有哪一些?各有何特點(diǎn)？.簡(jiǎn)述連接目的基因與載體的主要方法？.概述篩選和鑒定DNA重組體的常用方法。參考答案（一）名詞解釋.原核生物的幾個(gè)功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因往往排列在一起，轉(zhuǎn)錄生成一個(gè)mRNA,然后分別翻譯成幾種不同的蛋白質(zhì)。這些蛋白可能是催化某一代謝過程的酶，或共同完成某種功能。這些結(jié)構(gòu)基因與其上游的啟動(dòng)子，操縱基因共同構(gòu)成轉(zhuǎn)錄單位，稱操縱子。順式調(diào)控元件：指可影響自身基因表達(dá)活性的真核DNA序列。根據(jù)順式作用元件在基因中的位置、轉(zhuǎn)錄激活作用的性質(zhì)及發(fā)揮作用的方式，分為啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及沉默子等。.是RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)周圍的一組轉(zhuǎn)錄控制組件，包括至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。在真核基因中增強(qiáng)子和啟動(dòng)子常交錯(cuò)覆蓋或連續(xù)。有時(shí)，將結(jié)構(gòu)密切聯(lián)系而無(wú)法區(qū)分的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子樣結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱啟動(dòng)子。.是一種能夠提高轉(zhuǎn)錄效率的順式調(diào)控元件，最早是在SV40病毒中發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)約200bp的一段DNA,可使旁側(cè)的基因轉(zhuǎn)錄提高100倍，其后在多種真核生物，甚至在原核生物中都發(fā)現(xiàn)了增強(qiáng)子。增強(qiáng)子通常占100?200bp長(zhǎng)度，也和啟動(dòng)子一樣由若干組件構(gòu)成，基本核心組件常為8?12bp,可以單拷貝或多拷貝串連形式存在。.在原核生物的Trp操縱子結(jié)構(gòu)中，第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因與啟動(dòng)子P之間有一個(gè)區(qū)域含Trp密碼子，稱衰減子。當(dāng)環(huán)境中Trp濃度很高時(shí)，它可通過編碼并翻譯，使正在轉(zhuǎn)錄的mRNA形成終止信號(hào)，從而終止Trp操縱子的表達(dá)。這種轉(zhuǎn)錄衰減實(shí)質(zhì)上是轉(zhuǎn)錄與一個(gè)前導(dǎo)肽翻譯過程的偶聯(lián)，它是原核生物特有的一種基因調(diào)控機(jī)制。.大多數(shù)真核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子由某一基因表達(dá)后，通過與特異的順式作用元件相互作用（DNA—蛋白質(zhì)相互作用），或通過與基它調(diào)節(jié)因子的相互作用（蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用），反式激活另一基因的轉(zhuǎn)錄，故稱反式作用蛋白或反式作用因子。.也就是cAMP受體蛋白（cAMPreceptorprotein,CRP）,它與cAMP的復(fù)合物可以促進(jìn)某些原核操縱子（如乳糖操縱子）的轉(zhuǎn)錄。.“克隆”作為名詞指相同的分子或細(xì)胞構(gòu)成的群體，或一個(gè)共同的祖先通過無(wú)性繁殖所得到的群體，作為動(dòng)詞指獲取“克隆”的過程?？寺〖夹g(shù)特指獲取“克隆”的過程，包括分子克隆，細(xì)胞克隆等技術(shù)。.就是識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類核酸內(nèi)切酶。限制性核酸內(nèi)切酶存在于細(xì)菌體內(nèi)，與相伴存在的甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制、修飾體系，限制外源DNA,保護(hù)自身DNA,對(duì)保持細(xì)菌遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定具有重要意義。限制性核酸內(nèi)切酶分為三類，其中的H類酶能特異性在一定的核苷酸序列處切割雙鏈DNA,因而在基因工程中得到廣泛的應(yīng)用。.利用限制性核酸內(nèi)切酶將染色體DNA切割成一定大小的片段，將這些片段分子與適當(dāng)?shù)目寺≥d體拼接成重組DNA分子，繼而轉(zhuǎn)入受體菌，使每個(gè)細(xì)菌內(nèi)都攜帶一種重組DNA分子。不同細(xì)菌中的重組DNA分子可能包含不同的染色體DNA片段，這樣，只要得到的轉(zhuǎn)化細(xì)菌所攜帶的重組DNA分子種類足夠多，則全部轉(zhuǎn)化細(xì)菌所攜帶的各種染色體片段就代表了染色體的整個(gè)基因組。存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌內(nèi)，由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA片段的集合稱基因組DNA文庫(kù)?；蚪MDNA文庫(kù)涵蓋了基因組的全部基因信息。.以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA,與適當(dāng)?shù)妮d體（常用噬菌體或質(zhì)粒載體）連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個(gè)細(xì)菌含有一段cDNA,并能繁殖擴(kuò)增，這樣包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細(xì)胞的cDNA文庫(kù)?；蚪M含有的基因在特定的組織細(xì)胞中只有一部分表達(dá)，而且處在不同環(huán)境條件、不同分化時(shí)期的細(xì)胞其基因表達(dá)的種類和強(qiáng)度也不盡相同，所以cDNA文庫(kù)具有組織細(xì)胞特異性。cDNA文庫(kù)顯然比基因組DNA文庫(kù)小得多，能夠比較容易從中篩選克隆得到細(xì)胞特異表達(dá)的基因。另外，對(duì)真核細(xì)胞來(lái)說，從基因組DNA文庫(kù)獲得的基因與從cDNA文庫(kù)獲得的不同，基因組DNA文庫(kù)所含的是帶有內(nèi)含子和外顯子的基因組基因，而從cDNA文庫(kù)中獲得的是已經(jīng)過剪接，去除了內(nèi)含子的cDNA。一般來(lái)說，從cDNA文庫(kù)獲得的基因，因不含內(nèi)含子而片段較小，更適合于用作基因工程的目的基因。由于原核生物不存在將hnRNA加工成mRNA的酶系統(tǒng)，若用原核生物表達(dá)真核基因，則目的基因一定要通過cDNA獲取。（二）填充題1.負(fù)調(diào)控，正調(diào)控；2.啟動(dòng)子，啟動(dòng)，操縱；3.管家基因，誘導(dǎo)，阻遏；4.限制性核酸內(nèi)切，DNA連接；5.質(zhì)粒，病毒；6.腺病毒載體，反轉(zhuǎn)錄病載體，Ti質(zhì)粒。7.轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)；8.DNA,RNA,蛋白質(zhì)；（三）選擇題（在備選答案中選出1個(gè)或多個(gè)正確答案）.（B）操縱子均含有數(shù)個(gè)編碼基因，但啟動(dòng)序列只有1個(gè)。.(B,C,D)操縱子調(diào)控系統(tǒng)由調(diào)節(jié)基因，操縱基因，啟動(dòng)子和多個(gè)結(jié)構(gòu)基因組成，是原核生物基因表達(dá)調(diào)控的主要方式，誘導(dǎo)物與組遏蛋白結(jié)合啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。誘導(dǎo)物不能直接與啟動(dòng)子結(jié)合。真核生物不存在操縱子調(diào)控系統(tǒng)。.(C)轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的蛋白質(zhì)，對(duì)轉(zhuǎn)錄延伸的速度，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分解的速度和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工均無(wú)影響。.(C)操縱基因位于啟動(dòng)基因與結(jié)構(gòu)基因之間，阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合后，與啟動(dòng)基因結(jié)合的RNA聚合酶不能轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)基因。.(A)參與乳糖代謝的三種酶的表達(dá)同時(shí)受控于正負(fù)調(diào)控兩種機(jī)制，只有在正調(diào)控發(fā)揮作用，負(fù)調(diào)控不起作用的時(shí)候，這三種酶才能有效的表達(dá)。當(dāng)培養(yǎng)基中加入乳糖的時(shí)候，參與負(fù)調(diào)控的阻遏蛋白將失去活性，但如果培養(yǎng)基中含有葡萄糖，則細(xì)菌優(yōu)先利用葡萄糖，這時(shí)參與乳糖代謝的酶仍然不能有效的表達(dá)，這是因?yàn)槠咸烟墙档土思?xì)胞內(nèi)的cAMP水平，而cAMP濃度的降低，導(dǎo)致降解物激活蛋白喪失活性，正調(diào)控的機(jī)制失去作用，這時(shí)三種酶不可能正常的表達(dá)。.(E)順式作用元件是對(duì)某基因自身有調(diào)節(jié)功能的DNA序列，其中的啟動(dòng)子多在基因的5'側(cè)翼，但增強(qiáng)子既可以在5'側(cè)翼，又可以在3'側(cè)翼，一般距基因較遠(yuǎn)。有些順式作用元件甚至可以在基因內(nèi)部。.(E)反式作用因子是指對(duì)另一基因的表達(dá)有激活或抑制作用的蛋白質(zhì)因子。.(C)限制性核酸內(nèi)切酶主要存在于細(xì)菌，它可以水解外源DNA,而自身DNA因在特定位點(diǎn)被甲基化而可以免遭水解。限制性核酸內(nèi)切酶由于可識(shí)別特定的堿基序列并在特定的位點(diǎn)切割雙鏈DNA,因而在基因工程中得到廣泛的使用。.(C)DNA聚合酶可用來(lái)獲取目的基因，測(cè)序和PCR等項(xiàng)工作，限制性核酸內(nèi)切酶用于DNA酶切片段長(zhǎng)度的多態(tài)性分析，載體和目的基因的特異性切割等工作，DNA連接酶可用于基因重組的連接反應(yīng)。DNA解鏈酶在基因工程中幾乎用不到。.(D)CaCl2處理受體細(xì)胞是提高細(xì)菌轉(zhuǎn)化率的常用方法，不適用于真核生物，題中列出的其余4種方法均可用于將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞。.(A,B,C,D,E)題中列出的5種方法均可用于重組體的篩選。.(D)cDNA指在體外經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的與RNA互補(bǔ)的DNA。.(C)cDNA文庫(kù)應(yīng)包含某一細(xì)胞在某一狀態(tài)下所表達(dá)的基因，因此，構(gòu)建cDNA文庫(kù)首先要分離細(xì)胞的總mRNA。(四)判斷題.對(duì)。高等真核生物的DNA中含有不少高度重復(fù)序列的非編碼序列，基因內(nèi)部又有內(nèi)含子，不少基因內(nèi)含子的總長(zhǎng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于外顯子。因此，真核生物的編碼區(qū)只占DNA總長(zhǎng)度的一小部分，一般認(rèn)為，編碼區(qū)不超過總長(zhǎng)度的5%。.對(duì)。管家基因是持續(xù)表達(dá)的，mRNA豐度不高，但壽命較長(zhǎng)，翻譯效率較高。.錯(cuò)。乳糖被轉(zhuǎn)化為別乳糖后，與乳糖操縱子調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白失去活性。由于這一調(diào)控方式起作用的是阻遏蛋白，故屬于負(fù)調(diào)控。.對(duì)。某些蛋白質(zhì)能夠與DNA分子的不同區(qū)域結(jié)合，分別發(fā)揮激活蛋白或阻遏蛋白的作用。.對(duì)。真核生物的基因多數(shù)含有內(nèi)含子，原核生物缺乏從轉(zhuǎn)錄初級(jí)產(chǎn)物切除內(nèi)含子的加工系統(tǒng)，另外，如果將基因組DNA作為目的基因，基因片段因含有內(nèi)含子而過大，也會(huì)降低基因轉(zhuǎn)移的成功率。cDNA是以成熟mRNA為模板經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄制成的，不含內(nèi)含子，適合于作為目的基因用于基因的克隆或表達(dá)。.對(duì)。原核生物缺乏真核生物的翻譯后加工系統(tǒng)。不能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化。因此，表達(dá)糖蛋白要用真核表達(dá)系統(tǒng)。.錯(cuò)。土壤農(nóng)桿菌可以促進(jìn)Ti質(zhì)粒進(jìn)入植物細(xì)胞，但農(nóng)桿菌本身并不進(jìn)入植物細(xì)胞。.錯(cuò)。入噬菌體的外殼蛋白只能包裝長(zhǎng)度為噬菌體DNA78%?105%的DNA,若外源DNA片段太小，重組體DNA的長(zhǎng)度小于噬菌體DNA的78%,就不能在體外包裝成噬菌體，因而，克隆很難成功。.對(duì)。如果宿主細(xì)胞有限制性核酸內(nèi)切酶，將會(huì)水解進(jìn)入宿主細(xì)胞的重組體DNA,導(dǎo)致克隆失敗。.錯(cuò)。采用藍(lán)的斑選擇法時(shí)，克隆位點(diǎn)被選在表達(dá)一肽的基因內(nèi)，含有空載體的受體菌可以在IPTG（異丙基硫代——D—半乳糖苷）的誘導(dǎo)下，表達(dá)一肽，通過與受體菌的—互補(bǔ)，能夠水解X—gal（5—溴一4氯一3—吲哚——D—半乳糖苷）生成藍(lán)色的水解產(chǎn)物，因而菌落或噬菌斑為藍(lán)色。含有重組DNA的受體菌，由于外源基因插入表達(dá)一肽的基因內(nèi)，不能表達(dá)一肽，因而，菌落或噬菌斑為白色。（五）分析與計(jì)算題操縱子的調(diào)控區(qū)有一個(gè)操縱序列，一個(gè)啟動(dòng)序列及一個(gè)CAP位點(diǎn)，調(diào)控區(qū)下游有幾個(gè)結(jié)構(gòu)基因，還有一個(gè)調(diào)節(jié)基因編碼阻遏蛋白，阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合，使操縱子受阻遏而處于關(guān)閉狀態(tài)。若cAMP與CAP結(jié)合，形成的復(fù)合物與CAP位點(diǎn)結(jié)合，可增大操縱子的轉(zhuǎn)錄活性。阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)和CAP的正性調(diào)節(jié)共同調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，操縱子機(jī)制在原核基因表達(dá)調(diào)控中具有較善遍的意義，因其多是幾個(gè)功能相關(guān)基因串聯(lián)于同一操縱子上，故在同一啟動(dòng)序列控制下，可轉(zhuǎn)錄出能為多種蛋白質(zhì)編碼的mRNA,即多順反子mRNA。在特定的環(huán)境信號(hào)刺激下，相應(yīng)的基因被激活，基因表達(dá)產(chǎn)物增加，則這種基因是可誘導(dǎo)的?？烧T導(dǎo)基因在特定的環(huán)境中表達(dá)增強(qiáng)的過程稱為誘導(dǎo)。例如有DNA損傷時(shí)，修復(fù)酶基因就會(huì)在細(xì)菌內(nèi)被誘導(dǎo)激活，使修復(fù)酶的活性增加。相反，如果基因?qū)Νh(huán)境信號(hào)應(yīng)答時(shí)被抑制則這種基因是可阻遏的，可阻遏基因表達(dá)產(chǎn)物水平降低的過程稱為阻遏，例如，當(dāng)培養(yǎng)液中色氨酸供應(yīng)充分時(shí)，在細(xì)菌內(nèi)編碼色氨酸合成相關(guān)酶的基因表達(dá)會(huì)被抑制。如果某種基因在沒有調(diào)節(jié)蛋白存在時(shí)是表達(dá)的，加入某種調(diào)節(jié)蛋白后基因表達(dá)活性便被關(guān)閉，這樣的控制為負(fù)調(diào)控。例如，乳糖操縱子。相反，若某種基因在沒有調(diào)節(jié)蛋白存在時(shí)是關(guān)閉的，加入某種調(diào)節(jié)蛋白后基因活性就被開啟，這種控制稱為正調(diào)控。例如代謝物阻遏。原核基因表達(dá)調(diào)控與真核存在很多共同之處，但因原核生物沒有細(xì)胞核和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其基因組結(jié)構(gòu)要比真核生物簡(jiǎn)單，基因表達(dá)的調(diào)控因此而比較簡(jiǎn)單。雖然原核基因的表達(dá)也受轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄終止、翻譯調(diào)控及RNA、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性等多級(jí)調(diào)控，但其表達(dá)開、關(guān)的關(guān)鍵機(jī)制主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄起始。其特點(diǎn)包括以下3方面：（1）。因子決定RNA聚合酶的識(shí)別特異性：原核生物只有一種RNA聚合酶，核心酶催化轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng)，亞基識(shí)別特異啟動(dòng)序列，即不同的因子協(xié)助啟動(dòng)不同基因的轉(zhuǎn)錄。（2）操縱子模型的普遍性：除個(gè)別基因外，原核生物絕大數(shù)基因按功能相關(guān)性成簇地連續(xù)排列在染色體上，共同組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位即操縱子，如乳糖操縱子等。一個(gè)操縱子含一個(gè)啟動(dòng)序列及數(shù)個(gè)編碼基因。在同一個(gè)啟動(dòng)序列控制下，轉(zhuǎn)錄出多順反子mRNA.（3）阻遏蛋白與阻遏機(jī)制的普遍性：在很多原核操縱子系統(tǒng)，特異的阻遏蛋白是控制啟動(dòng)序列活性的重要因素。當(dāng)阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合或解離時(shí)，結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄被阻遏或去阻遏。4（1）基因組結(jié)構(gòu)龐大：哺乳動(dòng)物基因組DNA由約bp的核苷酸組成。大約有3萬(wàn)個(gè)左右的基因，90%以上的DNA不為蛋白質(zhì)編碼。真核細(xì)胞DNA與組蛋白結(jié)合形成復(fù)雜的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制更加復(fù)雜。（2）單順反子：真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子，即一個(gè)編碼基因轉(zhuǎn)錄生成一個(gè)mRNA分子，經(jīng)翻譯生成一條多肽鏈。許多蛋白質(zhì)由幾條不同的多肽鏈組成，因此存在多個(gè)基因的協(xié)調(diào)表達(dá)。（3）重復(fù)序列：重復(fù)序列在真核DNA中普遍存在，重復(fù)序列長(zhǎng)短不一，短的在10個(gè)核苷酸以下，長(zhǎng)的達(dá)數(shù)百，乃至上千個(gè)核苷酸。據(jù)重復(fù)頻率不同分為高度重復(fù)序列、中度重復(fù)序列及單拷貝序列。（4）基因的不連續(xù)性：結(jié)構(gòu)基因的兩側(cè)有不被轉(zhuǎn)錄的非編碼序列，往往是基因表達(dá)的調(diào)控區(qū)。在編碼基因內(nèi)部有一些不為蛋白質(zhì)編碼的間隔序列，稱內(nèi)含子，而編碼序列稱外顯子，因此真核基因是不連續(xù)的。同原核生物一樣，真核基因表達(dá)調(diào)控的最基本環(huán)節(jié)也是轉(zhuǎn)錄起始，而且某些機(jī)制是相同的，但也存在明顯差別：（1）RNA聚合酶：真核有3種RNA聚合酶，分別負(fù)責(zé)3種RNA轉(zhuǎn)錄。（2）活性染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化：當(dāng)基因被激活時(shí)，可觀察到染色體相應(yīng)區(qū)域發(fā)生結(jié)構(gòu)和性質(zhì)變化。包括對(duì)核酸酶敏感，DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)變化，DNA堿基修飾變化和組蛋白變化。（3）正調(diào)節(jié)占主導(dǎo)地位：真核RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子的親和力極小或根本沒有實(shí)質(zhì)性的親和力，二者的結(jié)合必須依賴一種或多種激活蛋白。盡管發(fā)現(xiàn)少量基因存在負(fù)性順式作用元件，但普遍存在的是正性調(diào)節(jié)機(jī)制。（4）轉(zhuǎn)錄與翻譯分隔進(jìn)行：真核細(xì)胞有胞核及胞質(zhì)等區(qū)間分布，轉(zhuǎn)錄與翻譯在不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中進(jìn)行。（5）轉(zhuǎn)錄后加工：真核基因的內(nèi)含子和外顯子均被轉(zhuǎn)錄，內(nèi)含子在轉(zhuǎn)錄后要被剪接去除，使外顯子連接在一起，形成成熟的mRNA。不同剪接方式可形成不同的mRNA，翻譯出不同的多肽鏈。因此，轉(zhuǎn)錄后加工是真核基因表達(dá)調(diào)控的另一重要環(huán)節(jié)。（1）DNA水平的調(diào)控：a.基因丟失，即DNA片段或部分染色體的丟失，如蛔蟲胚胎發(fā)育過程有27%的DNA丟失。b.基因擴(kuò)增，即特定基因在特定階段的選擇性擴(kuò)增，如非洲爪蟾卵母細(xì)胞中的rDNA是體細(xì)胞的4000倍。c.DNA序列的重排，如哺乳動(dòng)物免疫球蛋白各編碼區(qū)的連接。d.染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，通過異染色質(zhì)關(guān)閉某些基因的表達(dá)。e.DNA的修飾，如DNA的甲基化關(guān)閉某些基因的活性。（2）轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。a.染色質(zhì)的活化，如核小體結(jié)構(gòu)的解開、非組蛋白的作用等。b.轉(zhuǎn)錄因子的作用，轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶及特定的DNA序列（啟動(dòng)子、增強(qiáng)子）相互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。（3）轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。a.mRNA前體的加工，如5,端加帽、3,端加尾、拼接、修飾、編輯等。B.mRNA的選擇性拼接，如抗體基因的選擇性拼接。（4）翻譯水平的調(diào)控。a.控制mRNA的穩(wěn)定性，如5’端的帽子結(jié)構(gòu)、3,端polyA尾巴和mRNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合有利于mRNA的穩(wěn)定。b.反義RNA的作用，反義RNA可以選擇性抑制某些基因的表達(dá)。c.選擇性翻譯，如血紅素缺乏時(shí)，通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)使eIF2磷酸化。d.抑制翻譯的起始。（5）翻譯后水平的調(diào)控。a.多肽鏈的加工和折疊，如糖基化、乙酰化、磷酸化、二硫鍵形成、蛋白質(zhì)的降解。b.氨基酸的重排，如合成伴刀豆蛋白A時(shí)，氨基酸序列大幅度地被剪接重排。c通過肽鏈的斷裂等的加工方式產(chǎn)生不同的活性多肽。7.11型限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）是基因工程中常用的重要工具酶，是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的核酸內(nèi)切酶，常用的限制酶主要有以下特點(diǎn)：（1）均來(lái)自于微生物，并以其來(lái)源的微生物學(xué)名進(jìn)行命名；（2）相對(duì)分子質(zhì)量小，僅需Mg2+作為輔助因子，無(wú)需ATP;（3）識(shí)別特異性DNA雙鏈順序，在序列內(nèi)特異切割產(chǎn)生特異性DNA片段；（4）識(shí)別序列長(zhǎng)度為連續(xù)的4/6/8bp；（5）識(shí)別序列呈二重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱，稱回文結(jié)構(gòu)，富含GC；（6）有3種切口：5,端突出的黏性末端（如Hindlll）,3,端突出的黏性末端（如PstI）和平末端（如H加工）。8.（1）從染色體DNA中直接分離：主要針對(duì)原核生物。（2）化學(xué)合成法：由已知多肽的氨基酸序列，推得編碼這些氨基酸的核苷酸序列，利用DNA合成儀人工合成其基因。（3）從基因組DNA文庫(kù)中篩選分離組織/細(xì)胞染色體DNA：利用限制性核酸內(nèi)切酶將染色體DNA切割成片段，與適當(dāng)?shù)目寺≥d體連接后轉(zhuǎn)入受體菌擴(kuò)增，即獲得基因組DNA文庫(kù)，用核酸探針將所需目的基因從基因文庫(kù)中“釣”取出來(lái)。（4）從文庫(kù)中篩選cDNA：提取mRNA,利用反轉(zhuǎn)錄酶合成與其互補(bǔ)的DNA（cDNA）分子，再?gòu)?fù)制成雙鏈cDNA片段，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，即獲得cDNA文庫(kù)，然后采用適當(dāng)方法從cDNA文庫(kù)中篩選出目的cDNA。（5）用PCR從基因組DNA或cDNA中擴(kuò)增目的基因。9.同mRNA互補(bǔ)的DNA稱為cDNA。cDNA文庫(kù)是以某一細(xì)胞的總mRNA為模板，在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，首先合成互補(bǔ)DNA的第一鏈，破壞RNA模板后，再以第一鏈為模板合成第二鏈，得到雙鏈cDNA。選用適合的載體，與合成的cDNA重組，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，經(jīng)篩選得到的cDNA克隆群稱為cDNA文庫(kù)。由于cDNA技術(shù)合成的是不含內(nèi)含子的功能基因，因此是克隆真核生物基因的一種通用方法。由于細(xì)胞內(nèi)的基因在表達(dá)的時(shí)間上并非是統(tǒng)一的，具有發(fā)育的階段性和時(shí)間性，有些則需要特殊的環(huán)境條件。所以，cDNA文庫(kù)不可能構(gòu)建得十分完全，也就是說任何一個(gè)cDNA文庫(kù)都不可能包含某一生物的全部編碼基因。cDNA文庫(kù)與基因組文庫(kù)的主要差別是：（1）基因組文庫(kù)克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列，cDNA文庫(kù)克隆的是具有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)基因，包括調(diào)節(jié)基因。（2）基因組文庫(kù)克隆的是全部遺傳信息，不受時(shí)空影響，cDNA文庫(kù)克隆的是被轉(zhuǎn)錄DNA序列（因它受發(fā)育和調(diào)控因子的影響）。（3）基因組文庫(kù)中的編碼基因是含有內(nèi)含子和外顯子，而cDNA克隆的基因不含內(nèi)含子。.DNA重組載體應(yīng)具備的條件：（1）能自主復(fù)制；（2）具有一種或多種限制性內(nèi)切酶的單一切割位點(diǎn)，并在位點(diǎn)中插入外源基因后，不影響其復(fù)制功能；（3）具有1?2個(gè)篩選標(biāo)記；（4）克隆載體必須是安全的，不應(yīng)含有對(duì)受體細(xì)胞有害的基因，并且不會(huì)任意轉(zhuǎn)入其他生物細(xì)胞；（5）易于操作，轉(zhuǎn)化效率高。常用的基因載體有以下幾種：（1）質(zhì)粒：是細(xì)菌染色體以外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子，本身有復(fù)制功能，且?guī)в心承┻x擇信息，但可插入的目的基因片段較小。（2）噬菌體DNA：是一種病毒DNA,能插入比較大的外源DNA片段，在DNA分子上有多種限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn),便于多種外源DNA酶切片段的克隆。（4）柯斯質(zhì)粒載體和酵母人工染色體：前者結(jié)合了質(zhì)粒和噬菌體載體的優(yōu)點(diǎn)，也是一種環(huán)形雙鏈DNA分子，具有質(zhì)粒的性質(zhì)，可以轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并自行復(fù)制和增殖，但它不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體，構(gòu)建成的此種載體較小，因此能插入比較大的外源DNA片段，所以被廣泛地用于構(gòu)建基因組文庫(kù)。后者既含有大腸桿菌來(lái)源的質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)，又含有酵母菌染色體DNA著絲點(diǎn)，端粒和復(fù)制起始位點(diǎn)的序列，以及合適的選擇標(biāo)記基因，可在轉(zhuǎn)化的酵母菌細(xì)胞內(nèi)，按染色體DNA復(fù)制的形式復(fù)制重組DNA，容納外源DNA片段的能力比前3種載體大得多。.（1）黏性末端連接：用同一限制酶切割載體及目的基因后，產(chǎn)生完全相同的黏性末端，可以用DNA連接酶直接進(jìn)行共價(jià)連接。或兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的配伍末端（相同類型的黏性末端）之間也可以進(jìn)行黏性末端連接。（2）平端連接：某些限制酶切割DNA后產(chǎn)生平頭末端，由于平頭末端5,/