素材：基因工程教學(xué)中三個常見問題-高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

基因工程教學(xué)中三個常見問題進化論的觀點讓我們認(rèn)識到自然界中現(xiàn)存的生物物種和類群是由古代的生物經(jīng)過幾十億年的長期進化而逐漸形成的，各物種之間存在著不同程度的親緣關(guān)系。根據(jù)生物分類規(guī)則，自然界中的生物分為原核生物和真核生物。由于原核生物在基因結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄催化酶類、RNA轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯過程及場所以及翻譯后蛋白加工等方面都與真核生物存在顯著差異，導(dǎo)致基因工程實際操作中目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構(gòu)建、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因在受體細(xì)胞的表達及目的基因編碼蛋白的活性等方面存在差異1.原核生物細(xì)菌的基因直接導(dǎo)入真核生物的受體細(xì)胞，或真核生物基因(如人的白細(xì)胞介素基因)導(dǎo)入原核生物大腸桿菌中能否表達獲得重組蛋白的問題人教版高中生物學(xué)教材選擇性必修3中，在基因工程部分開篇引用轉(zhuǎn)基因抗蟲棉案例，該案例是基于蘇云金芽孢桿菌伴胞晶體蛋白(Bt抗蟲蛋白)基因?qū)胧荏w棉花細(xì)胞，再經(jīng)組織培養(yǎng)而成的基因工程產(chǎn)品。我們知道，無論原核生物還是真核生物，一個完整的基因包括啟動子、編碼區(qū)和終止子等組成部分，但真核生物與原核生物基因的啟動子、編碼區(qū)及終止子都存在結(jié)構(gòu)差異，直接利用其本身的啟動子無法在跨類的受體細(xì)胞中表達。這是因為原核基因的啟動子的基本結(jié)構(gòu)是－10區(qū)的共同序列TATA盒(Pribnowbox)和－35區(qū)的共同序列TTGACA(圖1A)，該結(jié)構(gòu)則是與原核生物轉(zhuǎn)錄催化酶RNA聚合酶的結(jié)構(gòu)相適應(yīng)的，原核生物典型的RNA聚合酶的結(jié)構(gòu)包含2個ɑ亞基、1個β亞基、1個β'亞基和1個ω亞基，與啟動子結(jié)合后還結(jié)合1個σ因子(圖2A)。而真核生物基因典型的啟動子包含了－25—－30區(qū)的TATAAA共同序列(Hognessbox)，－70—－80區(qū)的共同序列CCAAT(CAATbox)以及－80—－110區(qū)的富含GC的保守序列(GCbox)(圖1B)，真核生物啟動子結(jié)構(gòu)與真核生物RNA聚合酶相適應(yīng)，真核生物的RNA聚合酶有3類:RNA聚合酶I、RNA聚合酶II以及RNA聚合酶III。RNA聚合酶I主要負(fù)責(zé)rRNA的轉(zhuǎn)錄，RNA聚合酶II主要負(fù)責(zé)mRNA的轉(zhuǎn)錄(圖2B)，而RNA聚合酶III主要催化tRNA的合成。真核生物每類RNA聚合酶都由8—16個亞基組成，結(jié)構(gòu)與原核生物的RNA聚合酶有相似性，但都比原核生物RNA聚合酶復(fù)雜。因此，原核基因的表達需要受體細(xì)胞有原核生物的RNA聚合酶，真核基因表達需要受體細(xì)胞提供真核生物的RNA聚合酶。此外，真核生物的基因多數(shù)是斷裂基因，即真核生物基因的編碼區(qū)是由編碼氨基酸的外顯子和不編碼氨基酸的內(nèi)含子交替排列組成，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA前體(核不均一RNA)需要進一步通過去除內(nèi)含子、連接外顯子、5'加上m7GpppNmNm“帽子”以及3'添加poly(A)“尾巴”，才能加工成為連續(xù)編碼氨基酸序列的成熟mRNA。原核生物中沒有這套核不均一RNA的加工系統(tǒng)。因此，利用原核基因本身的啟動子和編碼序列轉(zhuǎn)化真核生物受體細(xì)胞，或者利用真核生物基因的啟動子和基因序列轉(zhuǎn)化原核生物受體細(xì)胞，目的基因在受體細(xì)胞中無法表達?；蚬こ虒嶋H操作時，在原核生物中表達，要利用原核生物的啟動子或噬菌體的啟動子(受體細(xì)胞提供噬菌體的RNA聚合酶)，在真核生物中表達目的基因時，應(yīng)該利用真核生物或侵染真核生物病毒基因的啟動子，當(dāng)真核生物基因轉(zhuǎn)化原核生物時，一般轉(zhuǎn)化的是該基因的cDNA而不是含有內(nèi)含子的原始基因。2.在進行基因表達載體的構(gòu)建時，用于轉(zhuǎn)化原核生物的表達載體上有RBS序列，而轉(zhuǎn)化真核生物的載體一般沒有該序列原核生物mRNA在起始密碼子前7—12個核苷酸處有一個保守序列，該序列與核糖體小亞基中16SrRNA的3'端反向互補，是核糖體結(jié)合在mRNA上引起翻譯起始所必需的，該序列稱為SD序列(Shine-Dagarnosequence)或核糖體結(jié)合位點(RBS，ribosomebindingsite)。真核生物翻譯的起始階段，核糖體與mRNA的結(jié)合不依賴于mRNA1上存在的RBS，真核生物40S核糖體上有一種m7GpppNmNm“帽子”結(jié)合蛋白(eIF4E)，該蛋白專一性識別mRNA“帽子”結(jié)構(gòu)，使核糖體40S小亞基與mRNA結(jié)合，經(jīng)過真核生物翻譯起始因子eIF3、eIF4G和poly(A)“尾巴”結(jié)合蛋白(PAB)而結(jié)合在3'poly(A)“尾巴”，最后通過大小亞基中rRNA的堿基配對，結(jié)合上60S的大亞基，引起翻譯的起始。在基因工程實際操作中，轉(zhuǎn)化原核生物的表達載體上通常在啟動子和目的基因之間插入了RBS編碼序列，這樣目的基因在原核生物的受體細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄后形成的mRNA可以順利與核糖體結(jié)合，實現(xiàn)目的基因控制重組蛋白合成的效果。3.轉(zhuǎn)基因的受體細(xì)胞從DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平進行檢測，結(jié)果都顯示是陽性，但在個體水平上卻檢測不到目的基因編碼蛋白質(zhì)的活性目的基因成功導(dǎo)入受體細(xì)胞后，基因會隨著復(fù)制子的復(fù)制從親代細(xì)胞傳遞給子代細(xì)胞，會通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA，也會通過翻譯產(chǎn)生目的基因編碼的蛋白質(zhì)。但是讓受體細(xì)胞產(chǎn)生目的基因控制性狀，翻譯出的蛋白質(zhì)必須具有生物學(xué)活性。重組蛋白在受體細(xì)胞翻譯出來以后，若其未能成功折疊、未能切除非功能肽段或未能進行蛋白質(zhì)翻譯后的修飾等，則Westernblotting等方法能檢測到重組蛋白的表達，卻檢測不到重組蛋白的活性。原核生物和真核生物都存在一些協(xié)助其他蛋白正確折疊成三級結(jié)構(gòu)的分子伴侶，雖然部分蛋白質(zhì)在缺少分子伴侶的條件下，依靠熱力學(xué)會自發(fā)折疊成有活性的三級結(jié)構(gòu)，但也有一些蛋白質(zhì)的折疊必須依賴特異的分子伴侶。此外，真核細(xì)胞中存在復(fù)雜的蛋白質(zhì)后加工系統(tǒng)，如蛋白質(zhì)N末端Met和非必需肽段的去除，分子內(nèi)二硫鍵的形成和部分氨基酸殘基的糖基化、磷酸化、甲基化等修飾加工，而原核生物中這些蛋白質(zhì)翻譯后加工能力比較有限。很多真核生物或人類基因(如調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子———白細(xì)胞介素6的cDNA)轉(zhuǎn)化大腸桿菌后可以大量表達重組白細(xì)胞介素6，但由于缺少合適的分子伴侶，該蛋白主要是以無規(guī)則蛋白顆?！w的形式存在，在溶液中也不溶解，無法檢測到其活性，需要在去垢劑存在下溶解包涵體，并經(jīng)進一步復(fù)性才能獲得有活性的蛋白。胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白水解酶，重組豬胰蛋白酶原在酵母中實現(xiàn)表達后，需要體外腸激酶切除部分C末端肽段后才能具有蛋白酶活性。促紅細(xì)胞生成素(又稱紅細(xì)胞刺激因子或促紅素)是一種人體內(nèi)源性糖蛋白激素，可刺激紅細(xì)胞生成，糖基對于穩(wěn)定蛋白的結(jié)構(gòu)和功能非常重要。促紅細(xì)胞生成素的cDNA導(dǎo)入大腸桿菌能夠?qū)崿F(xiàn)表達，但由于大腸桿菌無法對重組促紅細(xì)胞生成素進行糖基化修飾，導(dǎo)致獲得的重組蛋白生物學(xué)活性很低，若該cDNA在真核細(xì)胞(如中國倉鼠卵巢細(xì)胞)中表達，則獲得的重組促紅細(xì)胞生成素就顯示明顯的生物學(xué)活性?？茖W(xué)思維和科學(xué)探究意識的培養(yǎng)基因工程教學(xué)伴隨著大量科學(xué)思維訓(xùn)練的內(nèi)容，體現(xiàn)在基于證據(jù)得出結(jié)論，嚴(yán)謹(jǐn)縝密的思維過程，合乎邏輯的推理判斷。基因工程是人類通過技術(shù)手段實現(xiàn)了控制性狀基因的跨越物種、跨越生物