基因工程原理

28圖3-21鈣誘導的轉化二、重組體的遺傳學篩選法所謂遺傳學方法(geneticselection)主要是根據(jù)受體細胞接受了重組DNA分子后所發(fā)生的遺傳表型的變化直接選擇重組體的方法。遺傳表型的變化包括抗藥性、缺陷基因的功能互補表型及噬菌斑的變化等。這些表型的變化有些是載體提供的表型特征，有些則是插入序列提供的表型特征。選擇的方法主要是根據(jù)平板上可見的表型變化，用于選擇的平板包括普通抗生素平板、插入失活抗生素平板、插入表達抗生素平板、顯色平板等，由于這些方法都是直接從平板上篩選,所以又稱為平板篩選法。(一)插入失活篩選法從原理上講，當外源基因(或DNA片段)插入到某一基因內(nèi)的位點后，使這個基因喪失了原有的功能叫插入失活(insertionalinactivation)。弓儲'一物I互訃5JIW1I生撲與引物I!1L卡卜5趣融苗景祚，?弓L物結介1曲姐的雙聯(lián)口村人弓儲'一物I互訃5JIW1I生撲與引物I!1L卡卜5趣融苗景祚，?弓L物結介1曲姐的雙聯(lián)口村人區(qū)分離井r與引物退火5*新中初川物延伸-j，見物1H補^5J用物延伸jrtrtfttjrna升段圖3-22插入失活的原理圖3-23聚合酶鏈反應(引自Watsonetal,1992).抗性基因插入失活篩選法根據(jù)抗生素抗性基因插入失活原理而設計的插入失活法是重組體常用的篩選方法。如非重組的PBR322質粒DNA上的四環(huán)素和氨芐青霉素抗性基因都是正常的，表型為AprTcr。帶有這種質粒的受體菌可以在加有四環(huán)素和氨芐青霉素的雙抗性平板上生長。但是,如果在該質粒的四環(huán)素抗性基因內(nèi)插入外援片段，就會造成四環(huán)素抗性基因失活，變成AprTcs,攜帶這種質粒的宿主菌可以在氨芐青霉素的平板上生長，而不能在四環(huán)素抗性平板上生長(圖3-22)。.藍白斑篩選法根據(jù)抗生素抗性基因插入失活原理而設計的插入失活法需要進行菌落平板的影印復制，才能夠將所需的重組體挑選出來，大大增16胡耳加了篩選的工作量。后來，人們設計了以B-半乳糖苷酶的產(chǎn)生作為顏色篩選標記的載體，簡化了篩選程序，提高了靈敏度。這類載體系統(tǒng)包括M13噬菌體、pUC質粒系統(tǒng)、pEGM質粒系統(tǒng)。它們的共同特點是載體上攜帶一段細菌的lacZ基因，它編碼B-半乳糖苷酶的一段146個氨基酸的a-肽，載體轉化的受體菌為lacZAM15基因型。這樣，載體同宿主通過互補，具有完整的B-半乳糖苷酶的活性。如果在載體的lacZ基因中插入外源DNA,造成lacZ基因失活，不能合成a-肽，失去同宿主的互補，不能形成有功能的B-半乳糖苷酶，失去分解X-gal的能力。在X-gal平板上，含陽性重組體的細菌為物色菌落（質粒載體）或無色噬菌斑（M13噬菌體載體）；非重組體轉化的細菌為藍色菌落或藍色噬菌斑。顯色反應篩選方法比較簡單，但是B-半乳糖苷酶的合成需要誘導。實驗中起誘導作用的是安慰誘導物一IPTG（異丙基硫代-B-D-半乳糖苷），作用底物是X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷）。通常是將X-gal和IPTG混合后,涂布在固體平板的表面。（二）PCR法聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction，PCR）是一種體外擴增特定DNA序列的新技術，這種DNA的體外擴增是通過同DNA雙鏈互補的兩個引物在DNA聚合酶的作用下，進行引物延伸來完成的。在反應系統(tǒng)中，需要有：①模板（含有特定序列的DNA分子）。②兩個寡聚核苷酸引物，這兩個引物可同雙鏈DNA分子的互補鏈雜交，并且位于靶DNA欲擴增區(qū)的兩側。③耐熱DNA聚合酶。④4種脫氧核糖單核苷酸。然后經(jīng)過不同溫度的循環(huán)進行DNA擴增（圖3—23）。這一技術是KaryMullis在1985年發(fā)明的，并于1993年獲得諾貝爾化學獎。PCR應用十分廣泛，并且可通過菌液PcR進行重組克隆的快速篩選?；痉椒ㄊ菑目剐云桨迳咸羧尉浣臃N至250PL的LB培養(yǎng)基中，200r/min振蕩培養(yǎng)8h以后，取1DL菌液進行裂解制備模板進行PCR篩選。（三）核酸雜交篩選法核酸雜交又叫分子雜交（molecularhybridization）,是鑒定和篩選重組體的一種方法。原理是：兩條具有堿基互補序列的DNA分子變性后，在溶液中一起進行復性時，可以形成雜種雙鏈DNA分子。同樣，一條DNA鏈與之具有互補堿基序列的RNA鏈在一起復性時，也能形成雙鏈結構（DNA-RNA雜交體）。雜交包括下列過程：①DNA的“熔解”，即變性，目的是使雙螺旋解開成為單鏈，這可將DNA溶液的溫度升高超過Tm值（解鏈溫度）即可；②退火，即DNA的復性，將加熱過的DNA溶液緩慢冷卻即可發(fā)生。雜交的雙方是待測的核苷酸序列及探針。待測核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未經(jīng)克隆的基因組DNA或是細胞總RNA。核酸雜交方法的兩個特點是高度特異性及高度靈敏性。菌落雜交在大量篩選重組的細菌細胞時,需要從中尋找出為數(shù)極少的含有目的序列的細胞。另外.在利用插入失活、顯色反應等手段得到含重組質粒的細菌細胞后,還需要證明這些重組質粒是否含所需要的目的序列。若將所得菌落逐個擴大培養(yǎng)，提取質粒DNA,然后用Southern雜交法固然可以鑒定重組質粒，不僅工作量大，又耗費財力，用菌落雜交（colonyhybridization）（圖3-24）,就方便得多。首先要將轉化的受體菌在合適的瓊脂平板上制成單菌落,然后將菌落復制到硝酸纖維素濾膜上,保留主平板,將硝酸纖維素濾膜上的菌落進行原位溶菌、原位釋放DNA、原位進行DNA變性、中和洗滌后進行原位固定。然后同特異的探針進行雜交,通過放射自顯影后,有雜交信號的即為重組體,對照主平板則可將重組體選擇出來。

圖3-24菌落雜交的基本過程(引自Old&Primrose,1980)Southern雜交Southern雜交(Southernhybridization)是1975年Southern建立起來的一種雜交方法，屬固相-液相雜交。該法的主要特點是利用可毛細現(xiàn)象將DNA轉移到固體支持物上,稱為Southern轉移或Southern印跡(Southernblotting)o它首先用合適的限制性內(nèi)切酶將DNA切割后，進行電泳分離后，利用干燥的吸水紙產(chǎn)生毛細作用，使液體經(jīng)過凝膠，從而使DNA片段由液流攜帶而從凝膠轉移并結合在固體支持物表面，然后進行雜交(圖3-25)。圖3-25Southern雜交中的DNA轉移(引自Albertsetal.2002)Northern雜交Northern雜交(NorthernHybridization)是分析RNA的一種方法,它的基本原理是將RNA樣品通過變性瓊脂糖凝膠電泳進行分離,再轉移到尼龍膜等固相膜載體上,用放射性同位素標記的DNA或RNA特異探針對固定于膜上的mRNA進行雜交,洗膜去除非特異性雜交信號,經(jīng)放射自顯影,對雜交信號進行分析。將雜交的mRNA分子在電泳中的遷移位置與標準分子量分子進行比較,即可知道細胞中特定的基因轉錄產(chǎn)物的大小,對雜交信號的強弱比較,可以知道該基因表達mRNA的強弱。這一技術應用十分廣泛,常用于基因表達調控、基因結構與功能、遺傳變異及病理研究。主要用來檢測外源基因在受體細胞中是否轉錄成RNA。Northern印跡的原理同Southern印跡。但有兩點不同：其一是轉移的對象不同，Northern印跡是將RNA變性及電泳分離后，將其轉移到固相支持物上的過程。其二，雖然RNA電泳前不需向DNA那樣進行酶切，但也需要變性。不過變性方法是不同的，它不能用堿變性，因為堿變性會導致RNA的水解。Northern雜交與Southern雜交的主要區(qū)別是在變性劑存在下，用瓊脂糖進行電泳分離RNA。變性劑的作用是防止RNA的二級結構發(fā)夾環(huán)的形成，保持其單鏈線性狀態(tài)。第六節(jié)生物技術及應用基因工程技術的發(fā)展推動了生物技術(biotec}lnokogy)的發(fā)展，現(xiàn)代生物技術作為一門綜合性的學科，與現(xiàn)代微生物學、生物化學、細胞生物學、遺傳學、分子生物學和化學工程等多學科密切相關。生物技術產(chǎn)業(yè)從20世紀80年代開始起步，經(jīng)過20年的發(fā)展，目前在農(nóng)牧業(yè)、食品、醫(yī)藥等領域得到廣泛的應用。生物技術產(chǎn)業(yè)市場逐漸形成，其前景廣闊，將成為21世紀經(jīng)濟的支柱產(chǎn)業(yè)。(一)細胞工程細胞工程(cellengineering)是利用細胞的全能性，在細胞或細胞器水平上改變細胞的某些遺傳特性，以改良其性狀、獲得有用基因產(chǎn)物或加速細胞及生物體繁殖的綜合技術，可分為微生物細胞工程、植物細胞工程和動物細胞工程，是以細胞培養(yǎng)技術為基礎，通過細胞融合、細胞核移植、動物克隆、染色體工程和生物反應器來實現(xiàn)。1■■■■■細胞融合(cellfusion)又稱體細胞雜交(somatichybridization)，是指兩個不同來源的細胞，彼此融合成雜交細胞，使來自兩個親本細胞的基因有可能都被表達，打破遠緣生物不能雜交的屏障，形成新物種或新品種的技術。1975年，英國劍橋大學的科學家科萊爾(G.Kohler)和米爾斯坦(CMilstein)用細胞融合技術將能分泌抗體的B淋巴細胞(綿羊紅細胞、免疫小鼠脾細胞)與具有無限生長能力的腫瘤細胞(小鼠骨髓瘤細胞)融合，得到了既能持續(xù)產(chǎn)生單一抗體又能在體外無限繁殖的雜合細胞(雜交瘤細胞，hybridomacell)(圖3-26),通過細胞培養(yǎng)將雜合細胞克隆為單純的細胞系(單克隆系)，由此類細胞系可獲得結構和特性完全相同的高純度抗體，即單克隆抗體(monoclonalantibody,McAb)。這一技術的創(chuàng)立在生物醫(yī)學領域取得重大突破，兩位科學家因而榮獲1984年諾貝爾生理醫(yī)學獎。

圖3—26利用細胞融合技術制備單克隆抗體（引自Kuby,1994）如今這種細胞融合技術已在動物間實現(xiàn)了小鼠和田鼠，小鼠和小雞，甚至于小鼠和人等許多遠緣和超遠緣的體細胞雜交。雖然目前動物的雜交細胞還只停留在分裂傳代的水平，不能分化發(fā)育成完整的個體，但在理論研究和基因定位上都有重大意義。而植物間的細胞融合所得到的雜交細胞，獲得了新的雜交植物，如西紅柿與馬鈴薯細胞融合獲得“西紅柿馬鈴薯”，羽衣甘藍與白菜型油菜細胞融合得到“甘藍型油菜”等。2.細胞核移植細胞核移植是將一種動物的細胞核移入同種或異種動物的去核成熟卵細胞內(nèi)的顯微操作技術。由于主要遺傳物質存在于細胞核內(nèi)，因而此技術可獲得遺傳上具同質性狀的動物，對動物優(yōu)良雜交種的無性繁殖和瀕臨絕跡的珍貴動物的傳種具有重大意義。1952年，美國科學家布里格斯（R.Briggs）首次利用豹紋蛙卵細胞建立了細胞核移植技術。1981年，瑞士科學家K.IUmenses率先對哺乳動物小鼠卵細胞進行核移植獲得成功。他將灰鼠的細胞核注入到除去了精核和卵核的黑鼠的受精卵內(nèi)，然后再將這一f'Fh黑鼠細胞質和灰鼠細胞核組成的卵細胞體外培養(yǎng)，得到的仔鼠是灰色的，說明仔鼠的性狀取決于細胞核的來源。在細胞核移植技術上發(fā)展起來的動物體細胞克隆技術在1997年因克隆羊“多莉”（Dolly）的誕生而取得了重大突破。英國科學家維爾穆特（Iwilmut）等1997年2月27日在《自然》描述了“多莉”的克隆過程（圖3-27）。他們?nèi)〕隽g的芬蘭多塞特白綿羊母羊的乳腺細胞核，將此核導入蘇格蘭黑綿羊去核的卵細胞內(nèi)，待手術完成之后，以相同頻率的電脈沖刺激換核卵，讓蘇格蘭黑綿羊的卵細胞質與芬蘭多塞特白綿羊母羊乳腺細胞的核相互協(xié)調，使這個“組裝”細胞在體外發(fā)育成早期胚胎，然后將胚胎植入另一只母羊的子宮內(nèi)，產(chǎn)下了小綿羊“多莉”?！岸嗬颉辈皇怯赡秆虻穆鸭毎凸虻木毎芫漠a(chǎn)物，而是體細胞核加去核的卵細胞質，不經(jīng)兩性結合誘導出來的胚胎產(chǎn)生的。“克隆羊”的誕生表明：動物體中執(zhí)行特殊功能、具有特定形態(tài)的所謂高度分化的細胞與受精卵一樣具有發(fā)育成完整個體的潛在能力。

圖3—27克隆羊“多莉”誕生的過程(引自Glick&Pasternak,1998)1998年，日本科學家利用成年動物體細胞克隆的兩頭牛犢誕生；同年，美國科學家用成年鼠的體細胞成功地培育出了第三代共50多只克隆鼠；1999年，夏威夷大學的科學家利用成年鼠體細胞克隆出第一只雄性老鼠；2000年1月，美國科學家宣布克隆猴成功，這只恒河猴被命名為“泰特拉”；同年3月，曾參與克隆小羊“多莉”的英國PPL公司宣布，他們成功培育出5頭克隆豬。2002年，我國科學家成功克隆出牛和山羊，使我國成為少數(shù)掌握體細胞克隆哺乳動物關鍵技術的國家之一。2003年，美國、意大利等國科學家分別培育出世界上第一匹克隆騾子和克隆馬。中國和法國科學家合作首次克隆出大鼠。(二)蛋白質工程蛋白質工程是根據(jù)分子設計的方案，通過對天然蛋白質的基因進行改造，來實現(xiàn)對其所編碼的蛋白質的改造，它的產(chǎn)品已不再是天然的蛋白質，而是經(jīng)過改造的，具有了人類所需要特性的特殊蛋白質。天然蛋白質都是通過漫長的進化過程自然選擇而來的，而蛋白質工程對天然蛋白質的改造，能更快、更有效地為人類服務。重組人p干擾素(IFNp)的人工改造是蛋白質工程的一個成功范例。干擾素(interferon)是人體細胞分泌的一種蛋白質，具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)功能，是人體防御系統(tǒng)的重要組成部分。重組人IFNB是采用重組DNA技術，克隆人B干擾素基因，構建合成干擾素的基因工程菌，經(jīng)發(fā)酵、提純、純化制備而成。其基因工程產(chǎn)物活性為10萬U/mg，僅是天然IFN口產(chǎn)物活性的10%。蛋白質結構分析發(fā)現(xiàn)，人IFNB由154個氨基酸組成，在17、41、141位有3個半胱氨酸(Cys)，人體天然產(chǎn)物在41、141間形成二硫鍵，基因工程產(chǎn)物二硫鍵位置有偏差，17位Cys的巰基參與二硫鍵，形成無活性的二聚體或寡聚體。由于絲氨酸(Ser)與半胱氨酸在結構上除羥基(-OH)與巰基(-SH)外完全一樣，因此將17位Cys點突變?yōu)镾er，結果證明人工改造的IFN口產(chǎn)物活性提高100倍，穩(wěn)定性好于天然產(chǎn)物。(三)酶工程酶工程(enzymeengineering)就是通過對酶的修飾改造，提高酶的催化效率并在某一生物反應器中大規(guī)模生產(chǎn)的技術過程，主要包括酶的發(fā)酵生產(chǎn)、酶的分離純化、酶分子修飾、酶和細胞固定化、酶反應動力學與反應器、酶的應用等。酶工程的應用主要集中于食品工業(yè)、輕工業(yè)以及醫(yī)藥工業(yè)中(表3—4)。例如，固定化青霉素酰化酶用于連續(xù)裂解青霉素生產(chǎn)；a-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖異構酶連續(xù)作用于淀粉，就可以生產(chǎn)出各類糖漿；利用葡萄糖苷酶可生產(chǎn)出低糖啤酒；蛋白酶用于除去毛皮中的特定蛋白，軟化皮革等。加酶洗衣粉、用蛋白酶生產(chǎn)的嫩肉粉等,都是酶工程的產(chǎn)物。此外，酶工程還用于農(nóng)副產(chǎn)品的加工利用。美國利用大豆生產(chǎn)出200余種產(chǎn)品，包括營養(yǎng)食品、藥品、食品添加劑等，例如高純度大豆卵磷脂、大豆蛋白等。目前工業(yè)生產(chǎn)的酶有60余種，其中規(guī)?；a(chǎn)僅20余種。表3—4酶工程的主要應用領域應用領域酶類主要用途

淀粉酶類蛋白酶類糖化酶食品工業(yè)葡萄糖異構酶葡萄糖苷酶凝乳酶果膠酶淀粉酶類紡織工業(yè)纖維素酶日化工業(yè)蛋白酶類淀粉酶類蛋白酶類糖化酶食品工業(yè)葡萄糖異構酶葡萄糖苷酶凝乳酶果膠酶淀粉酶類紡織工業(yè)纖維素酶日化工業(yè)蛋白酶類

蛋白酶類

淀粉酶類糖酐酶制革工業(yè)蛋白酶類青霉素?；噶u化酶酪氨酸酶蛋白酶類高果糖漿生產(chǎn)低糖啤酒生產(chǎn)乳酪生產(chǎn)果酒、果汁去濁紡織品褪漿處理纖維制品，提高棉毛紡織品質量絲制品脫膠處理加酶洗滌劑、加酶護膚品與化妝品生產(chǎn)超氧化物歧化酶化妝品生產(chǎn)加酶洗滌劑生產(chǎn)牙膏添加劑超氧化物歧化酶化妝品生產(chǎn)皮革去毛、軟化青霉素、頭孢霉素生產(chǎn)氫化可的松生產(chǎn)多巴（主治帕金森病）生產(chǎn)氨基酸、蛋白水解液生產(chǎn)，治療消化不良，消腫，降壓等葡萄糖腦苷酯酶治療高雪?。ㄆ咸烟悄X苷酯酶缺乏癥）醫(yī)藥工業(yè)天冬酰胺酶溶菌酶尿激酶治療白血病醫(yī)藥工業(yè)天冬酰胺酶溶菌酶尿激酶消炎，鎮(zhèn)痛，止血等治療心肌梗死、結膜出血等超氧化物歧化酶治療紅斑狼瘡、皮肌炎、輻射損傷等治療血栓性靜脈炎、血腫等多種疾病診斷（如葡萄糖氧化酶診斷糖尿病，膽堿酯酶診斷肝炎等）處理造紙工業(yè)廢水處理高有機物含量廢水處理釀酒工業(yè)廢水鏈激酶其他多種酶淀粉酶類溶菌酶環(huán)保工業(yè)丁酸梭菌酶系其他多種酶（四）發(fā)酵工程環(huán)境監(jiān)測試劑（如膽堿酯酶監(jiān)測有機磷農(nóng)藥，硫氰酸酶監(jiān)測氰化物等）發(fā)酵工程（fermentationengineering）是利用微生物的特性，通過現(xiàn)代化工程技術，在反應器中生產(chǎn)目的產(chǎn)物或提供所需服務的技術過程。“發(fā)酵”一詞來源于拉丁語動詞鏈激酶其他多種酶淀粉酶類溶菌酶環(huán)保工業(yè)丁酸梭菌酶系其他多種酶（四）發(fā)酵工程發(fā)酵工程由3部分組成（圖3—28）：上游工程、發(fā)酵過程和下游工程。其中上游工程包括優(yōu)良菌株的選育、最適發(fā)酵條件（pH、溫度、溶氧和營養(yǎng)組成的確定、營養(yǎng)物的準備等。發(fā)酵過程主要指在最適發(fā)酵條件下，發(fā)酵罐中大量培養(yǎng)細胞和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的工藝技術。這里要有嚴格的無菌生長環(huán)境，包括發(fā)酵開始前采用高溫高壓對發(fā)酵原料和發(fā)酵罐以及各種連接管道進行滅菌的技術，在發(fā)酵過程中不斷向發(fā)酵罐中通入干燥無菌空氣的空氣過濾技術，在發(fā)酵過程中根據(jù)細胞生長要求控制加料速度的計算機控制技術，還有種子培養(yǎng)和生產(chǎn)培養(yǎng)的不同的工藝技術。圖3—28發(fā)酵工程的基本流程微生物發(fā)酵產(chǎn)品可分為以下幾大類：.微生物細胞（生物量）作為產(chǎn)品，如單細胞（酵母）蛋白作為食品或飼料。.微生物代謝物產(chǎn)品，目前醫(yī)用抗生素、農(nóng)用抗生素等已有近200個品種，絕大部分都是發(fā)酵產(chǎn)品。此外，發(fā)酵產(chǎn)品還包括酒精、氨基酸、檸檬酸和工業(yè)用酶等。味精、多種維生素等也是發(fā)酵工程的產(chǎn)品。.基因工程產(chǎn)品。微生物（如大腸桿菌、芽孢桿菌、鏈霉菌和酵母等）是最常用的重組基因的表達系統(tǒng)。主要產(chǎn)品包括干擾素、胰島素、牛凝乳酶、G—CSF（粒細胞集落刺激因子）、EPO（紅細胞生成素）和tPA（重組組織型纖溶酶原激活劑）等。（五）生物醫(yī)學工程生物醫(yī)學工程（biomedicalengineering）是綜合生物學、醫(yī)學和工程學的理論和方法而發(fā)居起來的新興綜合學科。生物醫(yī)學工程開始以仿生學原理制造人工器官，如心臟起搏器、人造心臟、假肢等，以及用于診療手段的醫(yī)學儀器。后來人體器官移植成為醫(yī)療中可以選擇的手段，但常常要克服異體器官的排斥反應，在用藥物能夠解決排斥反應之前，人體器官移植成功的例子很少。由于生物技術迅猛發(fā)展，在DNA雙螺旋結構發(fā)現(xiàn)50年后，人類基因組計劃已經(jīng)完成，對人類基因全面了解后，人們已經(jīng)將眼光投到干細胞克隆和治療性克?。ǚ巧承钥寺。?，一些國家如美國建立了胚胎的干細胞系，用于包括治療性克隆等方面的研究。國外已經(jīng)成功地從自體鼻窿腔內(nèi)取出干細胞，導人心臟，去除心臟因炎癥等留下的疤痕，恢復了心臟的正常功能，以及用血液中的干細胞修復因車禍等造成四肢癱瘓患者的脊髓神經(jīng)，使他們重新站立起來。這是因為即便是成人，一些在胚胎時期存在的干細胞仍可以留存在身體的各部分，或者作為專能干細胞，也在人體的器官中，這些干細胞能夠在特定的情況下進一步分化為組織。利用自體的干細胞也免除了異體器官移植糟糕的排斥反應。這種利用人體自身干細胞修復人體受損部分已經(jīng)成功的例子以及治療性克隆的前景，為解除人類的病痛帶來了福音。（六）生物信息工程生物信息工程（biologicalinformationengineering）可以簡單地定義為計算機與信息技術在生命科學中的應用，它是一個年輕和快速發(fā)展的領域。生物信息工程運用數(shù)學、計算機科學和生物學來闡明和理解大量生物學研究的實驗數(shù)據(jù)中所包含的生物學意義，包括此類數(shù)據(jù)的采集、貯存、整理、歸檔、分析與可視化等。以人類基因組計劃（humangenomeproject，HGP）為序幕的生物信息學研究，是全面認識生命及其過程的重要手段，由此引發(fā)的生物信息革命，將從根本上改變生命科學和生物產(chǎn)業(yè)的思維方式和研究體系。人類基因圖譜繪制既是生物學的突破也是計算科學的壯舉。在生物學家看來，存在于基因組中的堿基對序列是寶貴的生物信息資源，是未來生物工程產(chǎn)業(yè)的支柱。人類3萬?4萬個基因的信息以及相應的染色體位置被闡明后，將成為醫(yī)學和生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)知識和技術創(chuàng)新的源泉。一些困擾人類健康的主要疾病，例如心腦血管疾病、糖尿病、肝病、癌癥、老年癡呆癥等都與基因有關，可以依據(jù)已知的基因序列和功能，找出這些基因并針對相應的靶位進行藥物篩選，并設計新藥。到2002年底，已有1500多種致病基因被標記。信息技術有史以來首次成為推動實驗生物學和醫(yī)學發(fā)展的主要動力。這一趨勢明顯地表現(xiàn)在所有與了解疾病起因、新藥開發(fā)相關的關鍵領域中一一基因組學、蛋白質組學以及代謝途徑的研究等，這些專業(yè)的研究需要依靠強大的計算機系統(tǒng)、數(shù)據(jù)和存儲管理系統(tǒng)來完成大量的數(shù)據(jù)處理工作。而這些對生命的研究數(shù)據(jù)將幫助人類解開人體內(nèi)數(shù)以萬計蛋白質種類的基因編碼秘密。此外，利用生物信息工程技術建立動、植物良種及相關有用基因數(shù)據(jù)庫將有助于各種家畜、作物的基因改良。

四、轉基因動物圖3—30轉基因鼠（引自Griffithsetal,1999）傳統(tǒng)的家畜改良主要是通過多代選擇性交配改良飼養(yǎng)動物的遺傳性狀，如產(chǎn)奶、羊毛品質、生長速度和產(chǎn)蛋率等。在每一輪連續(xù)世代中，那些具有優(yōu)越性狀的動物可作為選育良種。這種交配、選育的方式雖然費時、費力，但卻很成功，現(xiàn)今幾乎所有的家畜都經(jīng)過這種改良。但是這種方法不能將單一的功能基因或基因簇引入高等動物的染色體DNA上。經(jīng)過20世紀80年代不懈的努力，借助于受精卵原核顯微注射和早期胚胎細胞的反轉錄病毒感染等手段，將基因導入受精卵產(chǎn)生新品種的設想已成為現(xiàn)實。動物轉基因技術迅速成為研究哺乳動物基因表達和發(fā)育的有效手段，在建立研究人類疾病的動物模式系統(tǒng)中發(fā)揮著作用，還可以使動物的乳腺分泌含有藥用蛋白的乳汁，因而出現(xiàn)了“乳腺生物反應奧，，W訂O轉基因技術在小鼠的研究中發(fā)展得較為成熟（圖3—30）。20世紀80年代以來，已經(jīng)將幾百種基因導入不同的品系中。這些研究使人們對基因調控、腫瘤發(fā)生、免疫專一性、發(fā)育的分子遺傳學及其他一些基本的生物活動過程有了更多的了解。轉基因小鼠還可作為人類治療藥物的檢測動物，不同的轉基因品系可作為研究人類遺傳疾病的生物醫(yī)學模型。（一）基因導入動物的方法在轉基因中，DNA可通過3種方式導入：①反轉錄病毒介導感染早期胚胎細胞，然后植入雌性動物體內(nèi)。②顯微注射到受精卵內(nèi)膨大的精核（雄性原核）中。③基因工程處理胚胎干細胞，導入一個早期發(fā)育胚胎后再植入雌性動物體內(nèi)。.反轉錄病毒載體法圖3—31顯微注射法進行動物轉基因的基本過程（引自Glick&Pasternak,1998）在各種基因轉移方法中，反轉錄病毒作為載體能夠有效地使轉移基因整合到受體細胞基因組中。但是，這類載體只能攜帶小片段（約8kb）DNA,因為長度的限制，這些轉移基因可能缺少關鍵的相鄰調控序列。使用病毒載體有一個最主要的缺陷，雖然這些載體被設計為復制缺陷型，但是用于制備大量載體DNA的病毒株的基因組可同樣進入細胞核。除非采取特殊的預防措施，這些輔助病毒會在轉基因個體中復制、產(chǎn)生。無論是直接將轉基因個體作為食品，還是利用其產(chǎn)物，都應絕對避免病毒的污染，所以，反轉錄病毒介導法很少用于生產(chǎn)經(jīng)濟用途的轉基因動物。.DNA顯微注射法由于反轉錄病毒介導法的不足，顯微注射DNA成為產(chǎn)生轉基因小鼠的首選方法。整個過程包括3個主要步驟（圖3-31）：①刺激供體雌性鼠超量排卵，以產(chǎn)生足夠的受精卵用于注射。首先注射孕馬血清，約48h后再注射人絨毛膜促性腺激素，一只超量排卵的小鼠可產(chǎn)生大約35顆卵,而不是通常的5?10顆卵。②雌鼠經(jīng)過交配，受精卵從輸卵管中洗出。③立即對采集的受精卵進行顯微注射。注射的轉移基因通常是線性結構，不采用原核生物的載體序列。整個過程看似簡單，但需要一系列實驗步驟的配合，并且成功率最高也只有5%左右，所以必須對大量的卵進行注射。例如，

經(jīng)注射的卵有66%的成活率，成活的受精卵25%可正常發(fā)育，25%的后代攜帶轉移基因，那么，注射1000個受精卵,才能獲得30?50個轉基因后代。并且，DNA在染色體上隨機整合，在某些個體中，轉移基因由于整合位點不當而不能表達，在某些個體中因拷貝數(shù)高而過度表達，這會干擾動物的正常生理活動。.胚胎干細胞法小鼠胚胎發(fā)育卵泡階段的細胞在培養(yǎng)基中依然保持分化能力。當把它們重新輸回胚胎胚泡后，仍保留著分化成其他細胞（包括生殖細胞）的能力，這類細胞稱多能性胚胎干細胞（EScell）oES細胞在體外培養(yǎng)時可承受轉基因操作而不影響其分化的多能性。外源基因通過同源重組可特異性整合在ES基因組內(nèi)的一個非必需位點上，構成工程化胚胎干細胞。經(jīng)體外篩選鑒定、擴大培養(yǎng)后再輸回小鼠胚胎胚泡中，最終形成轉基因動物（圖3—32）。這種方法避免了前兩種方法帶來的整合隨機性。內(nèi)姍電團供體般洵?◎◎I植入供作受體肝泡公◎⑥蟹◎您情其因小眥詵臉汴射胚泡內(nèi)姍電團供體般洵?◎◎I植入供作受體肝泡公◎⑥蟹◎您情其因小眥詵臉汴射胚泡圖3—32胚胎干細胞基因轉化法（引自Glick&Pasternak,1998）（二）轉基因動物的應用轉基因動物具有廣闊的應用前景，目前主要應用于以下幾個方面：①利用動物轉基因技術研究基因的表達與功能。②利用轉基因動物或細胞生產(chǎn)生物大分子。③利用轉基因技術進行動物遺傳性狀改良的研究。④基因治療。.乳腺生物反應器由于基因工程技術的出現(xiàn)，人類已可以大量取得過去只能從組織中提取的珍稀蛋白，用于研究或治療疾病?？梢酝瓿蛇@件工作的系統(tǒng)有細菌發(fā)酵、真核細胞培養(yǎng)和乳腺生物反應器等3種主要生產(chǎn)方式。在這3種生產(chǎn)方式中，乳腺生物反應器有特殊優(yōu)點。乳腺生物反應器是根據(jù)細胞生物學中蛋白質合成與分選的機制，結合基因工程技術、動物轉基因技術等，利用動物的乳腺分泌某些具有重要價值的基因產(chǎn)物（圖3—33）。

含有目的蛋白的乳汁『?；傅胤殖眆l的小n含有目的蛋白的乳汁『?；傅胤殖眆l的小n的母羊C7：O/蚩白的分離蚪i化日的小冏蛋白圖3—33用轉基因綿羊生產(chǎn)重要的醫(yī)用蛋白質(引自川@$加9etal,l994)乳腺生物反應器是一項綜合技術，發(fā)展乳腺生物反應器不僅需要基因工程技術，還需要動物胚胎技術、轉基因技術、蛋白質提純技術和常規(guī)畜牧技術。到目前為止，世界各國科學家已經(jīng)制造出乳腺分泌各種醫(yī)用蛋白質的牛、山羊、綿羊、豬和家兔，乳腺分泌的蛋白質達到可商業(yè)開發(fā)水平的轉基因動物達十多種。.轉基因鼠在揭示人類分子病病理中的應用轉基因小鼠可作為研究人類疾病的模式系統(tǒng)，或對某種可能的藥物進行檢測。完整的動物模式應模擬人類疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，但是，小鼠畢竟不是人類，所以，從轉基因模型得到的信息在醫(yī)學上并不總具有相關性，不過，在研究復雜疾病時，可對致病原因的發(fā)現(xiàn)帶來突破性進展?，F(xiàn)已發(fā)展了多種轉基因小鼠模型用來研究人類遺傳疾病，例如阿爾茨海默病(Alzhaeirnerdisease)、關節(jié)炎(arthritis)、肌肉萎縮癥(muscularddystrophy)、腫瘤發(fā)生(tumorigenesis)、高血壓(hypertension)、神經(jīng)退行性病變失調(neurodegenerativedisorder)、內(nèi)分泌功能異常(endocrinologicaldysfunction)和冠心病(coronarydisease)等。Alzheimer病是一種大腦機能退行性失調，表現(xiàn)為精確思維能力和記憶力的持續(xù)喪失，伴隨性格改變、語言紊亂和身體機能的遲鈍。雖然1%的60?65歲人群和30%的80歲以上人群可能患此病，但該病的臨床診斷仍很不足。在患者腦部的新皮質和海馬部位，神經(jīng)元胞體內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)元纖維的纏結，在軸突終端生成密集的胞外聚集物”衰老斑”，腦細胞(神經(jīng)元)逐漸死亡。在患者腦血管中也發(fā)現(xiàn)這種稱為“淀粉樣小體”的聚集物。衰老斑與淀粉樣小體的基本組分是一種相對分子質量4X103的蛋白AB(amyloidB,8-蛋白、8-淀粉樣蛋白、B-A4)。組成各種AB蛋白的氨基酸殘基數(shù)目不同，如AB40、AB42。所有的AB蛋白都是B-淀粉樣前體蛋白(APP)自身水解生成的。目前還不知道AB積累的原因。在一些Alzheimer病高危家族中發(fā)現(xiàn)了APP基因的突變，顯示APP/r/