腦室內(nèi)注射胰島素對大鼠全腦缺血后海馬CA1區(qū)Bcl

腦室內(nèi)注射胰島素對大鼠全腦缺血后海馬CA1區(qū)Bcl李兵，章翔，蔣小帆，王彥剛，張戈【關(guān)鍵詞】胰島素；腦缺血；Bl關(guān)鍵詞：胰島素；腦缺血；Bl2TheeffetfintraventriularadinistratinfinsulinnexpressinfBl2RNAandprtEininrathippapalA1reginfllingglbalbrainisheiaKEYRDS:insulin;brainisheia;Bl2自1978年初次在大鼠腦構(gòu)造的提取物中創(chuàng)造有胰島素及其受體以來，一些研究相繼創(chuàng)造在其他哺乳動物及人類腦中也具有胰島素及其受體的存在。胰島素在中樞神經(jīng)體系中的作用引起了普及的留意。在缺血性腦損傷的研究歷程中，人們通過動物實行創(chuàng)造，全腦缺血再灌注后利用胰島素，可減輕神經(jīng)元的殞命或脫失，且這種作用在利用葡萄糖抵銷其落糖作用后并不削弱，表白胰島素在全腦缺血再灌注歷程中可不依靠其外周落血糖作用而發(fā)揮神經(jīng)庇護(hù)作用。但胰島素對缺血性腦損傷產(chǎn)生中樞庇護(hù)作用的詳細(xì)機(jī)理如今仍不甚明白。比年來很多文獻(xiàn)報道,腦缺血后神經(jīng)元的凋亡是缺血造成中樞神經(jīng)體系損傷的一個緊張緣故原由。我們以往的研究證明，胰島素對缺血性腦損傷具有中樞直接庇護(hù)作用并可淘汰大鼠海馬A1區(qū)神經(jīng)元的凋亡[1]。為進(jìn)一步探究胰島素對缺血性腦損傷產(chǎn)生中樞直接庇護(hù)作用的機(jī)理，我們對在腦缺血再灌注后，經(jīng)腦室內(nèi)注入胰島素，對大鼠海馬A1區(qū)Bl2RNA相對含量變革及其卵白表達(dá)的影響舉行了不雅察。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1實行動物及分組接納康健成年雄性SD大鼠，共72只(干凈級)，體重(300±20)g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動物實行中央提供。隨機(jī)分為①缺血組：缺血再灌注后1、3、5d別離取材，每個時間點12只。②胰島素治療組：取材時間點及每個時間點的動物數(shù)同缺血組。1.2動物模子制作大鼠經(jīng)20g/L戊巴比妥鈉(40g/kg)腹腔注射后，俯臥位結(jié)實于立體定向架上，于頸后正中第一、二頸椎處，切一長約1.5暗語，剝離頸部肌肉表現(xiàn)第一頸椎上之雙側(cè)翼孔后，插入雙極電凝鑷，燒灼閉塞從中穿行的椎動脈，縫合傷口，置籠喂養(yǎng)。24h后，同法麻醉，于頭頂部皮下插入針狀電極，仰臥位結(jié)實。分散頸部肌肉，表現(xiàn)雙側(cè)頸總動脈，夾閉30s后描記腦電變革，以腦電釀成直線為模子樂成的尺度。夾閉15in后放開動脈夾，行再灌注。于放開動脈夾后馬上，從前囟后1.2、中線旁開1.5為穿刺點。顱骨鉆孔后，用微量加樣器垂直進(jìn)針3.5穿刺腦室，缺血組注入10μL生理鹽水，治療組注入1u(10μL，1×105u/L)速效基因合成人胰島素(丹麥諾和靈公司)。1.3血糖測定各組鼠別離于頸總動脈夾閉前及再灌注后30in、1、2、6、12、24h自鼠尾靜脈取血約50μL，用血糖測定儀(Lifesan)測定血糖。1.4標(biāo)本網(wǎng)羅于規(guī)按時間，麻醉后開胸表現(xiàn)心臟，自左心室插管至自動脈，剪開右心房，經(jīng)預(yù)冷生理鹽水沖凈血液。每組每個時間點12只大鼠，此中4只以預(yù)冷之40g/L多聚甲醛灌注結(jié)實2h，斷頭取腦，前囟處以美蘭標(biāo)識表記標(biāo)幟，置40g/L多聚甲醛中結(jié)實4h，系列脫水，白臘包埋，冠狀切片，收取前囟后3.8處相鄰切片兩張(6μ)行免疫組化不雅察；4只斷頭取腦，剝離海馬，切取雙側(cè)海馬A1區(qū)構(gòu)造100g，敏捷置入液氮保存用于esternblt檢測。4只以焦碳酸二乙酯(DEP)處置懲罰的0.01l/LPBS(4℃)50L灌注，沖凈血液，冰盒內(nèi)斷頭取腦?？焖賱冸x海馬，切取雙側(cè)海馬A1區(qū)構(gòu)造100g，立即在干冰上冷凍，保存于-80℃冰箱。1.5海馬A1區(qū)Bl2RNA相對含量的測定引物方案及合成根據(jù)已報道[2]的Bl2DNA方案其相應(yīng)的特異性引物(引物序列5′ATGGATTTTT3′；5′AAATTAGTTA3，擴(kuò)增產(chǎn)物長度303bp)。大連寶生物公司合成。1.6Bl2卵白表達(dá)的不雅察將獵取的切片脫蠟至水，置入枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)行微波抗原修復(fù)10in；沖洗后滴加3%(體積分?jǐn)?shù))H22阻斷內(nèi)源性酶15in，沖洗5in；滴加Bl2抗體(Stantaruz，1∶1000)50μL，4℃孵育留宿，PBS沖洗，參照SAB試劑盒說明(博士德公司)別離滴加二抗及StreptavidinPerxidase，DABH22混淆液顯色，封片，鏡下不雅察。1.7esternblt1.8統(tǒng)計學(xué)處置懲罰接納SPSS統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計學(xué)處置懲罰，數(shù)據(jù)用±s表現(xiàn)，行組間方差闡發(fā)。2效果2.1全腦缺血后血糖的變革全腦缺血前后各組鼠血糖濃度無顯著差異。缺血組與治療組比力血糖濃度那么無明顯差異(表1)。表1各實行組血糖濃度變革〔略〕Table1Thehangesfbldgluseindifferentgrup2.2全腦缺血后海馬A1區(qū)Bl2RNA相對含量的變革在缺血組及胰島素治療組海馬A1區(qū)，于各取材時間點均可見Bl2RNA的陽性電泳條帶(圖1)。利用Labrks軟件對各陽性條帶均勻密度舉行丈量，盤算各陽性條帶的均勻密度值與βatin條帶均勻密度值之比，效果全腦缺血后1、3、5d胰島治療組與缺血組比力無明顯差異(表2)。表2缺血組及治療組海馬A1區(qū)Bl2RNA的相對含量〔略〕Table2TherelativelyntentfBl2RNAfhippapalA1regininisheiandtreatedgrup圖1腦缺血后海馬A1區(qū)Bl2RNARTPR電泳條帶〔略〕Fig.1TheeletrphretistripfBl2RNAithRTPRfrhippapalA1reginpstbrainishei1,3,5:theeletrphretistripfBl2RNAfisheigrupin1,3,5day,respetively;2,4,6:theeletrphretistripfBl2RNAfinsulintreatedgrupin1,3,5day,respetively2.3全腦缺血后海馬A1區(qū)Bl2卵白的表達(dá)全腦缺血后1、3、5d，缺血組海馬A1區(qū)Bl2卵白表達(dá)為陰性，而胰島素治療組海馬A1區(qū)Bl2卵白表達(dá)那么呈陽性(圖2)。2.4全腦缺血后海馬A1區(qū)構(gòu)造esternblt效果全腦缺血后1、3、5d胰島素治療組Bl2卵白電泳條帶密度(圖3)均高于缺血組(P0.01)。表白全腦缺血后經(jīng)腦室注入胰島素可進(jìn)步峻鼠海馬A1區(qū)Bl2卵白的表達(dá)(表3)。表3海馬A1區(qū)Bl2卵白電泳條帶密度〔略〕Table2ThedensityfeletrphretistripfBl2prtEinfrhippapalA1regin圖2全腦缺血再灌注后1、3、5d海馬A1區(qū)神經(jīng)元Bl2卵白表達(dá)〔略〕Fig.2TheexpressinfBl2inhippapalA1reginin1,3,5daypstglbalbrainisheia(×400)A-:theexpressinfBl2asnegativeinhippapalA1reginin1,3,5daypstglbalbrainisheiainisheigrup,respetively;D-F:theexpressinfBl2aspsitiveinhippapalA1reginin1,3,5daypstglbalbrainisheiaininsulintreatedgrup,respetively圖3腦缺血后海馬A1區(qū)Bl2卵白esternblt電泳條帶〔略〕Fig.3TheeletrphretistripfBl2prteinbyesternbltfrhippapalA1reginpstbrainisheia1:psitiventrl;2,4,6:theeletrphretistripfBl2prteinin1,3,5dayinisheigrup,respetively;3,5,7:theeletrphretistripfBl2prteinin1,3,5dayininsulintreatedgrup,respetively3討論缺血性腦血管病是威脅人類康健的龐大疾病之一，隨著對缺血后腦致傷機(jī)理研究的深化，如今以為缺血性腦損傷的病理生理機(jī)制是一種損傷級聯(lián)反響。針對級聯(lián)反響差異階段的致傷特點，探求相應(yīng)的神經(jīng)庇護(hù)劑阻斷損傷反響級聯(lián)，淘汰神經(jīng)元的殞命是缺血性腦損傷研究中的一個熱門。胰島素為一種血糖調(diào)治激素，其介導(dǎo)的落血糖效應(yīng)對減輕缺血性腦損傷具有必然的庇護(hù)作用。大量動物實行證明，腦缺血后將血糖落至正常低限程度可減輕缺血造成的神經(jīng)元損害。因此早期被應(yīng)用于腦缺血病人，尤其是同時患有糖尿病患者的治療傍邊并獲得了較好的療效。自證明哺乳動物及人類腦中存在有胰島素及其受體后，胰島素在中樞神經(jīng)體系中的作用引起了人們的器重。比年來一些實行研究創(chuàng)造，全腦缺血后經(jīng)外周血賜與胰島素的同時賜與葡萄糖抵消其落糖作用可減輕缺血造成的腦損害，提示胰島素對缺血性腦損害具有中樞直接庇護(hù)作用[34]。我們此前的研究也證明胰島素可淘汰大鼠全腦缺血后海馬A1區(qū)神經(jīng)元的凋亡并可減輕全腦缺血后大鼠的影象力損害，其產(chǎn)生抗凋亡作用的機(jī)理與促進(jìn)Bl2卵白表達(dá)有關(guān)。Bl2基因家屬在細(xì)胞凋亡中具有緊張的調(diào)控作用。在Bl2基因家屬中，如今已斷定出有凌駕20種基因，包羅按捺凋亡的Bl2、Blxl、Blx、Bl1和促進(jìn)凋亡的Bax、Bak、Bad、Blxs、Bik等成員，兩類分子的比例決定了細(xì)胞是否產(chǎn)生凋亡。Bl2基因家屬對換治線粒體通透性具有關(guān)鍵的作用。在Bl2基因家屬中按捺凋亡的重要成員如Bl2等基因的表達(dá)低落，促進(jìn)凋亡成員如Bax過表達(dá)，均可導(dǎo)致線粒體通透性的增長，可使細(xì)胞色素自線粒體中開釋進(jìn)入細(xì)胞漿中[56]，并與Apaf1及aspase9的前體結(jié)合，形成復(fù)合物。此后，aspase9的前體裂解，形成aspase9并被激活。使其他aspase家屬成員裂解并被激活，此中包羅aspase3[7]。aspase3的激活如今被以為是起始細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵點。aspase3可激活很多細(xì)胞底物，此中最重要的有PARP(聚ADP核糖多聚酶)，DNA卵白激酶，DNA裂解因子。這些卵白的水解直接導(dǎo)致與細(xì)胞凋亡相干特性的出現(xiàn)(如DNA修復(fù)的制止，染色體的聚攏和細(xì)胞核內(nèi)DNA的斷裂等)[89]。由此可見，Bl2基因家屬在細(xì)胞是否產(chǎn)生凋亡中具有緊張的調(diào)控作用。一些研究創(chuàng)造，全腦缺血后海馬A1區(qū)神經(jīng)元的遲發(fā)性殞命大概是一個細(xì)胞凋亡的歷程[10]，Bl2卵白在腦缺血再灌注后中樞神經(jīng)體系中的作用受到了器重[1112]。Kitagaa等[13]在神經(jīng)元過表達(dá)Bl2基因的轉(zhuǎn)基因小鼠上不雅察到，全腦缺血再灌注后7d，轉(zhuǎn)基因鼠海馬A1區(qū)神經(jīng)元的殞命數(shù)顯著少于同源的非轉(zhuǎn)基因鼠。Antnaih等[14]乃至將攜帶Bl2基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒于全腦缺血前24h蒔植于鼠海馬A1區(qū)，使其轉(zhuǎn)染神經(jīng)元，全腦缺血后72h不雅察創(chuàng)造，于蒔植區(qū)四周的神經(jīng)元Bl2卵白呈陽性表達(dá)，且神經(jīng)元存活數(shù)顯著高于未轉(zhuǎn)染區(qū)[14]。從而進(jìn)一步證明Bl2卵白具有減輕全腦缺血后海馬A1區(qū)神經(jīng)元凋亡的作用。為進(jìn)一步探究全腦缺血后胰島素淘汰海馬A1區(qū)神經(jīng)元凋亡機(jī)制，本實行通過制作大鼠全腦缺血再灌注模子，于全腦缺血再灌注后馬上經(jīng)腦室直接注入胰島素，對血糖及海馬A1區(qū)的Bl2基因的RNA和卵白表達(dá)環(huán)境舉行了不雅察。效果表現(xiàn)，再灌注馬上經(jīng)腦室注入1u胰島素后，全腦缺血前后各組鼠血糖濃度無顯著變革，缺血組與治療組比力血糖濃度亦無明顯差異；全腦缺血后1、3、5d，胰島素治療組海馬A1區(qū)Bl2基因的RNA表達(dá)與缺血組無明顯差異，而Bl2卵白的表達(dá)卻顯著高于缺血組。效果證明，胰島素促進(jìn)鼠海馬A1區(qū)Bl2卵白表達(dá)的作用大概是通過促進(jìn)Bl2卵白的翻譯歷程而實現(xiàn)的，而并不依靠胰島素的外周血糖調(diào)治效應(yīng)及此中樞直接作用。因此我們以為，全腦缺血后經(jīng)腦室內(nèi)注入胰島素大概通過促進(jìn)Bl2卵白翻譯歷程，使大鼠海馬A1區(qū)Bl2卵白高表達(dá)按捺海馬A1區(qū)神經(jīng)元的凋亡，從而發(fā)揮中樞直接庇護(hù)作用。參考文獻(xiàn)：[1]李兵，章翔，張志文，等.腦室內(nèi)注射胰島素對全腦缺血后海馬A1區(qū)神經(jīng)元凋亡及學(xué)習(xí)影象的影響[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志,2022,2(1):3639.[2]ShintakuS,hdanH,YaatH,etal.Expressinfbl2hlgueRNAsinratliverallgraft:rejetinindudeellapptsisisassiatedithupregulatinfbaxandblxsexpress[J].TransplInt,1998,11(Suppl1):284288.[3]AuerRN.Insulin,bldgluselevels,andisheibraindaage[J].Neurlgy,1998,51(suppl3):3943.[4]李兵，章翔，張志文,等.室內(nèi)注射胰島素對大鼠腦海馬A1區(qū)神經(jīng)元遲發(fā)性殞命的作用[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2000,21(9):10701072.[5]JurgenseierJ,XieZ,DeverauxQ,etal.Baxdiretlyinduesreleasefythrefrislatedithndria[J].PrNatlAadSiUSA,1998,95:49975002.[6]Narita,ShiizuS,ItT,etal.Baxinteratsiththepereabilitytransitinpretinduepereabilitytransitinandythrereleaseinislatedithndria[J].PrNatlAadSiUSA,1998,95:1468114686.[7]LiP,NijhaanD,BudihardjI,etal.ythreanddATPdependentfratinfApaf1/aspase9plexinitiatesanappttiprteaseasade[J].ell,1997,91:479489.[8]ThrnberryNA,LazebnikY.aspases:eneiesithin[J].Siene,1998,281:13121316.[9]StevenH,Graha,GhenJ.Prgraedelldeathinerebr