DB37-T 3573-2019牛支原體診斷技術(shù)規(guī)程

ICS 11.220B41

DB37山 東 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB37/T3573—2019牛支原體診斷技術(shù)規(guī)程CodeofPracticefortheDiagnosisofMycoplasmaBovis20192019052920190629山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布目 次前言 II范圍 1規(guī)性用件 1術(shù)與義 1試及器 112樣采與理 2似支體牛的判斷 2似例品采集 2品理 2微物檢法 2體養(yǎng) 2落態(tài)察 2Dienes3化驗(yàn) 3果定 3核檢法 3DNA板制備 3PCR3膠泳 4量制 4果定 4廢物處和測(cè)程中全施 4操注事項(xiàng) 5附錄A（范附）養(yǎng)的備法 6前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并監(jiān)督實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。牛支原體診斷技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)適用于牛支原體的實(shí)驗(yàn)室診斷。GB6682—2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T14926.8—2001實(shí)驗(yàn)動(dòng)物支原體檢測(cè)方法GB15981—1995消毒與滅菌效果的評(píng)價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)GB19489—2008實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求3術(shù)語(yǔ)與定義3術(shù)語(yǔ)與定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1牛支原體Mycoplasmabovis3.2Dienes染色液一種經(jīng)典的利用天青美藍(lán)染色檢測(cè)支原體的染色液。3.3類(lèi)胸膜肺炎微生物培養(yǎng)基Pleuropneumonia-LikeOrganismsmedium，PPLO培養(yǎng)基4試劑及儀器4.1試劑去離子水（符合GB6682—2008的相應(yīng)要求）；牛支原體檢測(cè)培養(yǎng)基所需試劑及配制方法見(jiàn)附錄A；TaqDNA聚合酶及其反應(yīng)緩沖液；生理鹽水；Dienes染色液；TAE電泳緩沖液；瓊脂糖4.2儀器接種環(huán)、酒精燈、移液器（5～100μL和100～1000μL）、槍頭（200μL和1mL）、培養(yǎng)試管（15mL）和玻璃平皿（90mm）、CO2恒溫培養(yǎng)箱、移液器、1L容量瓶、核酸擴(kuò)增儀、電泳儀、高壓滅菌鍋、正置光學(xué)顯微鏡。根據(jù)“5.1”所述牛支原體感染的三種臨床表現(xiàn)型，分別進(jìn)行樣品的采集，具體要求如下：15152mL～5mL剪至云霧狀后，用2mL生理鹽水重懸，7500g離心5min，用注射器吸取1mL上清液經(jīng)0.45μm濾膜濾過(guò)后備用。用2mL生理鹽水浸潤(rùn)拭子后，7500g離心5min，吸取1mL上清液經(jīng)0.45μm濾膜濾過(guò)后備用。分別取1mL原液與1mL生理鹽水充分混合，7500g離心5min，用注射器吸取1mL上清液經(jīng)0.45μm濾膜濾過(guò)后備用。6微生物學(xué)檢測(cè)法將0.5mL“5.34.5mLPPLO37℃，53PPLO取50μL疑似液體培養(yǎng)陽(yáng)性的樣品加入到PPLO固體培養(yǎng)基（配方見(jiàn)附錄A）上，涂布均勻后，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5天后，4倍物鏡下觀察菌落形態(tài)。Dienes將有可疑菌落的固體培養(yǎng)基平皿進(jìn)行Dienes染色，37℃孵育30min后，觀察菌落顏色。0.2mg/mLPPLO37℃，5CO23℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3或變黃時(shí)，說(shuō)明不水解精氨酸；當(dāng)培養(yǎng)基顏色變紅時(shí)，說(shuō)明水解精氨酸。當(dāng)同時(shí)滿足以下條件時(shí)，判定為牛支原體陽(yáng)性：Dienes7核酸檢測(cè)法DNA水煮法取“5.3”所述的上清樣1mL于滅菌的2mLEppendorf管中，12000g離心12min，棄上清，沉淀重懸于200μL無(wú)菌ddH2或變黃時(shí)，說(shuō)明不水解精氨酸；當(dāng)培養(yǎng)基顏色變紅時(shí)，說(shuō)明水解精氨酸。當(dāng)同時(shí)滿足以下條件時(shí)，判定為牛支原體陽(yáng)性：Dienes7核酸檢測(cè)法DNA水煮法取“5.3”所述的上清樣1mL于滅菌的2mLEppendorf管中，12000g離心12min，棄上清，沉淀重懸于200μL無(wú)菌ddH20中，沸水浴15min后立即冰浴2min，待Eppendorf管冷卻后12000g離心10min，取上清液即為樣品DNA模板。提取樣品DNA模板時(shí)，采用商品化的支原體基因組DNA提取試劑盒或革蘭氏陰性菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，操作步驟參照商品化試劑盒說(shuō)明書(shū)。7.2PCRPCR參照國(guó)際上常用的PCR診斷方法，選擇針對(duì)牛支原體設(shè)計(jì)的一對(duì)特異性引物用于PCR檢測(cè)（Subramaniam,etalMolecular&CellularProbes,1998.）1626bpMBOUVRC2-L：5’-TTACGCAAGAGAATGCTTCA-3’MBOUVRC2-R：5’-TAGGAAAGCACCCTATTGAT-3’PCR經(jīng)“7.1”提取的樣品DNA模板，以牛支原體DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，ddH2O為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)體系如表1。表1牛支原體PCR反應(yīng)體系中各成分添加量試劑名稱用量Taq酶（1000U/mL）1μL10×反應(yīng)緩沖液（含鎂離子）2μLdNTP（10mM）1μL上游引物（10μM）1μL下游引物（10μM）1μL檢測(cè)模板5μLddH209μL總體積20μL7.2.37.2.3PCR955min9530s，5230s，721.5min36個(gè)循環(huán)；7210min4采用1.5120V35min1600bpPCR1600bp8廢棄物的處理和檢測(cè)過(guò)程中安全措施按照GB19489—2008中規(guī)定執(zhí)行。48h2～3PCR附錄A（）PPLO（pH7.6）PPLO21.0g2.5g，2.5g2.0g850mLddH2O1w/v)4mL，11620min（GB15981—1995執(zhí)行）56150mL和pH7.6，每4.5mL15mL1PPLO（pH7.6）PPLO粉21.0g，酵母粉2.5g，葡萄糖2.5g，丙酮酸鈉2.0g，瓊脂粉20.0g，溶于850mLddH2O中，加入1%(w/v)酚紅溶液4mL，116℃滅菌20min（按照GB15981—1995執(zhí)行），冷卻至55℃左右。無(wú)菌操作加入56℃滅活的馬血清150mL和20萬(wàn)單位青霉素，調(diào)節(jié)pH值為7.6，每15mL倒入90mm無(wú)菌培養(yǎng)皿，冷卻凝固，室溫保存1周，冷藏保存1個(gè)月。PPLOPPLO2.1g0.25g，0.25g85mLddH2O1w/v)0.2mL，116℃滅菌20min（按照GB15981—1995執(zhí)行），加入56℃滅活的馬血清150mL和20萬(wàn)單位青霉素，調(diào)節(jié)pH值為7.6，每4.5mL分裝至15mL培養(yǎng)管，冷藏保存1個(gè)月。A.4精