細胞培養(yǎng)技術(shù)3課件

細胞培養(yǎng)技術(shù)一、細胞培養(yǎng)的基本原理細胞培養(yǎng)：模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在適當(dāng)?shù)臈l件下，使活體組織細胞在體外環(huán)境存活、生長增殖，借以觀察細胞的生長、繁殖、衰老等生命現(xiàn)象。

貼壁型細胞：

必須貼附于支持物表面才能生長。大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞。懸浮型細胞：于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面，見于某些癌細胞和血液淋巴細胞。1.培養(yǎng)細胞的分類：

成纖維細胞型胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時呈放射狀、火焰狀、漩渦狀。除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌細胞等等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細胞的形態(tài)與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細胞。血管平滑肌細胞

上皮型細胞細胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細胞彼此緊密相連成單層膜，生長時呈膜狀移動，起源于內(nèi)、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。游走細胞型在支持物上呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細胞相區(qū)別。

多型細胞型有一些細胞，如神經(jīng)細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長，或以機械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長來自血，脾或骨髓在懸浮中生長良好，細胞圓形，單個或小細胞團生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)觀察不方便懸浮型細胞特點：懸浮型細胞2.培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程

單個細胞的生長過程：細胞周期培養(yǎng)細胞生命期所謂培養(yǎng)細胞生命期，是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。傳代期：

初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便改稱做細胞系。在全生命期中此期的持續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細胞增殖旺盛。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細胞進入第三期。衰退期：

此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退凋亡。在細胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細胞可能獲得永生性或惡性性。細胞永生性也稱不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞系，也稱連續(xù)細胞系。無限細胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體。細胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細胞也可能具有惡性性質(zhì)。細胞永生性和惡性性非同一性狀。潛伏期：

細胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時細胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細胞貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結(jié)束。各種細胞貼附速度不同，這與細胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細胞潛伏期長，約24～96小時或更長，連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅6～24小時；細胞接種密度大時潛伏期短。指數(shù)增生期：

是細胞增生最活躍、活力最旺盛的階段。培養(yǎng)物中細胞數(shù)量呈指數(shù)增長,細胞群體均一，是理想的實驗用細胞。在接種細胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天后，隨細胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少、最后細胞相互接觸匯合成片。細胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制。細胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細胞分裂停止。停滯期：

細胞數(shù)量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。此時細胞數(shù)量不再增加，故也稱平臺期。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時需傳代做分離培養(yǎng)，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。壓力蒸汽消毒鍋：濕熱消毒，用途廣。濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用孔徑小于0.22m的濾膜過濾。

超凈工作臺：為細胞操作提供無菌環(huán)境。紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒。

無污染(無菌)環(huán)境基質(zhì)(支持物)玻璃基質(zhì)塑料基質(zhì)氣體環(huán)境、溫度、濕度CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-CO2:5%溫度：37oCpH值控制平衡鹽溶液：PBS，Hank’s，D-hank’s(無鈣鎂；離子)等。培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基(如血清)；合成培養(yǎng)基(如市售DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基)。合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基(如血清)。水：新鮮配置的三蒸水或去離子水。液相環(huán)境二、細胞培養(yǎng)的基本方法體外培養(yǎng)細胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。即便使用設(shè)備完善的實驗室，若實驗者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范,也會導(dǎo)致污染。因而,為在一切操作中最大可能地保證無菌，每一項工作都必須做到有條不紊和完全可靠。1.無菌操作技術(shù)

培養(yǎng)前準(zhǔn)備

在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。

為了做好培養(yǎng)前準(zhǔn)備工作，宜制定出分門別類的操作卡片，包括操作程序卡片；如“分裝血清”、“原代培養(yǎng)”、“傳代培養(yǎng)”、等等。各卡片上記有需用器材和物品名稱、要求及數(shù)量等，這對初學(xué)者尤為重要。這樣做的好處是實驗者可按卡片收集所用物品，清點無誤后，把用品放置于操作場地，然后進行消毒，可避免操作開始后，因物品不全在往返拿取時增加污染機會。培養(yǎng)室的消毒

無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實驗前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min?！┎僮饔镁呷缫埔浩?、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒。

洗手和著裝

原則上和外科手術(shù)相同。并于開始操作前要用75％酒精消毒手和前臂。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。培養(yǎng)過程中的無菌操作

在無菌環(huán)境進行培養(yǎng)或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈。為便于拿送用品，工作臺面上的用品要有合理的布局；原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進行。進行培養(yǎng)時，動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以免打翻東西。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。培養(yǎng)過程中的無菌操作

工作由始至終要保持一定順序性，組織或細胞在末做處理之前，勿過早暴露在空氣中。培養(yǎng)液在末用前，不要過早開瓶；用過之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口。吸取培養(yǎng)基、PBS、細胞懸液及其它各種用液時，均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴大污染或?qū)е录毎徊嫖廴?。工作中不能面向操作野講話或咳嗽，以免唾沫把細菌或支原體帶入工作臺面發(fā)生污染。2.基本培養(yǎng)操作技術(shù)

原代培養(yǎng)

用直接從機體獲得的細胞進行的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。這種培養(yǎng)過程主要是采用無菌操作的方法，把組織（或器官）從動物體內(nèi)取出，經(jīng)酶消化處理，使分散成單個細胞，然后在人工條件下培養(yǎng)，使其不斷地生長和繁殖。原代培養(yǎng)是建立各種細胞系的第一步。動物細胞原代培養(yǎng)過程圖

傳代細胞培養(yǎng)

離體培養(yǎng)的細胞群體增殖達到一定密度時，細胞的生長和分裂速度就會減慢甚至停止，如不及時分離傳代培養(yǎng)，細胞將逐漸衰老死亡。傳代培養(yǎng)是指細胞從一個培養(yǎng)瓶以1：2或其他比率轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)細胞的傳代通常是采用胰蛋白酶消化，把細胞分散成單細胞再傳代，而懸浮型生長細胞則用直接傳代法或離心法傳代。※貼壁細胞傳代培養(yǎng)方法與步驟（1）選取生長良好的細胞，在超凈工作臺的酒精燈旁，倒去瓶中的舊培養(yǎng)液，加入2～3ml的PBS液，輕輕振蕩漂洗細胞，以除去懸浮在細胞表面的碎片。（2）加入1.5mL0.25％胰蛋白酶消化液(玻璃培養(yǎng)瓶)，37℃消化2～3min，倒置顯微鏡下觀察，待細胞單層收縮突起出現(xiàn)空隙時，倒去酶液(若消化過度，可不倒去酶液)。（3）用PBS液洗滌1次(可省略)，加入3mL培養(yǎng)液，反復(fù)吹打細胞，使其成細胞懸液。（4）細胞計數(shù)后，以1：2或1：3進行分裝(或以適當(dāng)密度接種于培養(yǎng)板進行藥物實驗)，并在培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記，注明代號、日期，輕輕搖勻，37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（5）觀察：細胞培養(yǎng)24h后，即可觀察培養(yǎng)液的顏色及細胞的生長情況。細胞計數(shù)血細胞計數(shù)板：手工計數(shù)細胞a.將計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。b.將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間，注意蓋片下不要有氣泡c.鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側(cè)和上方的。然后按公式計算：

細胞數(shù)/mL=四大格細胞總數(shù)/4×104注意：鏡下偶見有兩個以上細胞組成的細胞團，應(yīng)按單個細胞計算，若細胞團10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。細胞的凍存與復(fù)蘇所謂冷凍保存，就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度，并在此溫度下對其長期保存的過程。而復(fù)蘇就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復(fù)到常溫的過程。不論是微生物、動物細胞、植物細胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進行凍存，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。低溫保護劑的應(yīng)用在細胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融當(dāng)細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。3.細胞培養(yǎng)的污染、檢測與控制

微生物污染空氣、器材、操作、試劑、組織標(biāo)本微生物污染的檢測細菌和真菌的污染和檢測肉眼直接觀察法培養(yǎng)檢查法顯微鏡觀察法支原體的污染和檢測造成支原體高污染率的原因：1.支原體大小0.1－0.8um，無細胞壁，可透過一般過濾膜（0.22-0.45um）；

2.支原體污染時，沒有明顯的肉眼或一般光學(xué)顯微鏡可觀察到的特征變化；

3.過去缺乏簡單、快速且可靠的檢測方式；

4.細胞流通間缺乏物品管理，造成實驗室間的相互污染；

5.研究或操作人員忽略污染問題；6.已受污染的細胞；

7.已受污染的培養(yǎng)基、血清。支原體之檢測：

相差顯微鏡觀察法、電鏡法Hayflick培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法DNA熒光染色法

PCR方法微生物污染的控制抗生素除菌法加溫處理細胞培養(yǎng)常見問題解答培養(yǎng)液pH值變化太快CO2張力不對培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊松開瓶蓋1/4圈NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖力不足加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度

細菌、酵母或真菌污染丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，同時pH發(fā)生變化細菌或真菌污染丟棄培養(yǎng)物抗生素除菌培養(yǎng)細胞不貼壁胰蛋白酶消化過度縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度支原體污染分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔