福林酚測蛋白質(zhì)-(1)課件

福林-酚法

測定蛋白質(zhì)的含量實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)測定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法

熟練分光光度計，微量移液器的操作以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

實(shí)驗(yàn)原理

第一步——雙縮脲反應(yīng)（蛋白質(zhì)與堿性銅試劑反應(yīng)）

在堿性條件下蛋白質(zhì)的肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質(zhì)-銅復(fù)合物第二步——與福林-酚試劑反應(yīng)在堿性條件下

，這種被作用的蛋白質(zhì)上的酚類基團(tuán)極不穩(wěn)定，很容易還原福林酚試劑中的磷鎢酸和磷鉬酸，生成鎢藍(lán)和鉬藍(lán)的混合物，呈藍(lán)色。可利用分光光度計測得650nm的OD值，濃度大小跟OD值成正比y=kx+b

OD值是opticaldensity（光密度）：

入射光強(qiáng)度與透射光強(qiáng)度之比值的常用對數(shù)值實(shí)驗(yàn)原理分光光度計的原理實(shí)驗(yàn)方法0123456789101112250μg/ml牛血清白蛋白（ml）

00.20.20.40.40.60.60.80.81.01.01.0待測樣品

1.0待測樣品

水（ml）

1.00.80.80.60.60.40.40.20.20000堿性銅（ml）5555555555555搖勻，放置10minFolin試劑(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5迅速搖勻，室溫放置20分鐘，測650nmOD值

實(shí)驗(yàn)方法

以0號管為空白對照，在分光光度計上以波長650nm比色，讀取光密度值（OD值），標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量μg（或者標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度）作為橫坐標(biāo)，OD值作為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線寫出回歸方程，根據(jù)待測樣品OD值計算蛋白質(zhì)含量。注意事項(xiàng)：及時做好標(biāo)記加入試劑后應(yīng)立即混勻測定所加入的蛋白質(zhì)量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)分光光度計的使用方法

設(shè)置波長設(shè)置樣品池個數(shù)調(diào)零測定開啟機(jī)器，調(diào)節(jié)所需的波長，設(shè)置樣品池個數(shù)空白對照管調(diào)零（一定放在離自己最近的那個樣品池）將待測樣品液放入比色皿（2/3高度），并將比色皿放入樣品池內(nèi)，蓋好蓋子，測光密度值（OD值），按上下鍵翻看其他樣品池的數(shù)據(jù)測量完畢，一定把比色杯用自來水和蒸餾水重新洗凈，倒置于濾紙上晾干

比色皿有光面和毛面，勿用手觸摸光面，使用時光面對準(zhǔn)光路。裝液體時，需達(dá)到比色皿2/3左右；若液體不慎溢出，需用紙巾吸干，儀器如果沾有液體，請迅速擦干。注意事項(xiàng)微量移液器的使用原理微量移液器是根據(jù)“虎克定律”設(shè)計的，“在一定限度內(nèi)彈簧伸展的長度與彈力成正比”：也就是微量加樣器吸入液體的容量與加樣器內(nèi)的彈簧拉伸長度成正比。常見種類

0.5～10μl

5～50μl

10～100μl

20～200μl

(讀數(shù)窗顯示20～200,每轉(zhuǎn)1檔1μl)

100～1000μl(讀數(shù)窗顯示100～1000,每轉(zhuǎn)1檔為

5μl)

1：選擇量程

根據(jù)轉(zhuǎn)移液體的量，選擇正確量程的微量移液器2：調(diào)節(jié)吸量體積：

將微量移液器調(diào)至所需體積，千萬不要將讀數(shù)的調(diào)節(jié)超出最大值和最小值；操作步驟3：吸量用移液器的吸桿插上合適的吸頭，旋緊。握緊微量移液器，用大拇指按至第一檔，將吸頭插入溶液中。然后松開大拇指，慢慢釋放按鈕以吸取液體（否則液體進(jìn)入吸嘴太快，導(dǎo)致液體倒吸入移液器內(nèi)部）；然后將微量移液器移出液面。釋放液體時，槍頭接觸在容器壁上，先慢慢按至第一檔，停留1～2秒后，再按至第二檔以排出所有液體。

操作步驟4.更換吸頭：吸取不同的液體，一定要更換槍頭，防止試劑交叉污染，更換槍頭時，對著廢棄桶，輕輕按下卸載吸頭的彈射器，吸頭自然脫落在廢棄桶內(nèi)。5.微量移液器的放置：實(shí)驗(yàn)完畢后，將移液器調(diào)回到接近最大量程，使彈簧處于松弛狀態(tài)，放到或者懸掛在架子上。操作步驟1.吸取不同的液體時，切記要更換吸頭，2.調(diào)節(jié)移液器時，動作要輕緩，千萬不要將讀數(shù)的調(diào)節(jié)超出最大值和最小值，否則會造成損壞。3.吸取液體時，動作要輕緩，防止液體隨著氣流進(jìn)入移液器的上部；4.帶有殘余液體吸嘴的移液器不能平放。5.

每次實(shí)驗(yàn)完畢后將微量移液器調(diào)至接近最大刻度，使彈簧處于自然伸展